色譜分離技術(shù)灌注色譜

色譜分離技術(shù)灌注色譜第一頁，共一百三十頁，編輯于2023年，星期二如果試圖提升柱效和柱容量，可以減小介質(zhì)粒徑，但這會大大增加柱子壓降，增加層析時間；如果試圖加快層析時間，由于沒有足夠時間擴散，則會犧牲柱容量和分辨率。第二頁，共一百三十頁，編輯于2023年，星期二從介質(zhì)顆粒結(jié)構(gòu)的角度來說，是否可有更好的解決辦法?。康谌?，共一百三十頁，編輯于2023年，星期二灌注層析技術(shù)

PerfusionChromatography

第四頁，共一百三十頁，編輯于2023年，星期二1989年，美國的Regnier和Afeyan等人率先發(fā)明了具有貫穿孔的分離載體（FlowthroughParticle）—POROS，并申請了專利，并將這一技術(shù)命名為灌注層析技術(shù)（PerfusionChromatography）第五頁，共一百三十頁，編輯于2023年，星期二PerfusionChromatography灌注層析傳統(tǒng)層析第六頁，共一百三十頁，編輯于2023年，星期二在灌注層析中，固定相粒子的特殊設(shè)計使分子更易通過直通孔和擴散孔進入粒子內(nèi)部，直通孔直徑約為600~800nm，擴散孔直徑為80~150nm，結(jié)合了對流和擴散雙重作用，加速了分子傳質(zhì)。第七頁，共一百三十頁，編輯于2023年，星期二所以，灌注層析表現(xiàn)出以下優(yōu)點：1、分離速度比傳統(tǒng)層析快10~100倍而分辨率不變。2、分辨率和吸附量不再依賴于流速。3、減少了分子在層析柱中停留時間，減少了目標分子降解，變性等作用，提高了分子活性。4、層析放大的成本降低。第八頁，共一百三十頁，編輯于2023年，星期二灌注層析在流速加快的情況下不影響柱容量和分辨率，不會增加反壓，為快速純化生物大分子提供了基礎(chǔ)。灌注層析技術(shù)只是增強了傳質(zhì)的動力學過程而不改變層析的分離原理，因此可以用于除凝膠色譜外的所有層析技術(shù)中。第九頁，共一百三十頁，編輯于2023年，星期二灌注層析的介質(zhì)POROS是在苯乙烯-二乙烯苯的交聯(lián)共聚物基礎(chǔ)上構(gòu)成的，具有很高的機械和化學穩(wěn)定性。也可以使用鋁、硅或羥基磷灰石等。通過對惰性骨架的處理，可以使介質(zhì)活化產(chǎn)生不同的功能基團，用于不同的層析技術(shù)，如離子交換，疏水層析，親和層析等第十頁，共一百三十頁，編輯于2023年，星期二色譜的效能問題2傳統(tǒng)填充色譜柱內(nèi)由于存在渦流擴散和傳質(zhì)阻力等問題，使各個組分分子走過路程長短不一，結(jié)果峰形變寬，分辨率降低，理論塔板數(shù)減少。那么，能不能使溶質(zhì)分子走的路徑不再彎曲？第十一頁，共一百三十頁，編輯于2023年，星期二毛細管色譜柱毛細管柱：可分為壁涂毛細管柱和填充毛細管柱兩種?？招拿毠苤菍⒐潭ㄒ褐苯油吭趦?nèi)徑只有0.1～0.5mm的玻璃或金屬毛細管的內(nèi)壁上；填充毛細管柱是將某些多孔性固體顆粒裝入厚壁玻管中，然后加熱拉制成毛細管，一般內(nèi)徑為0.25～0.5mm。第十二頁，共一百三十頁，編輯于2023年，星期二毛細管柱的特點1.傳質(zhì)阻力小，可用長柱，總柱效分離效能高，理論塔板數(shù)可高達幾十萬2.分析速度快。3.樣品用量少，柱容量也小。

第十三頁，共一百三十頁，編輯于2023年，星期二毛細管柱的選擇1.內(nèi)徑越小，效率越高，但柱容量也越低。2.柱長越長，分離度越高3.液膜厚度越大，柱容量越大，組分出柱越晚，同時由于增加了傳質(zhì)阻力，柱效可能會下降。4.固定相類型，在分離度很高的情況下，選擇性不再是唯一標準，其他穩(wěn)定性，兼容性，使用溫度等都需要考慮。第十四頁，共一百三十頁，編輯于2023年，星期二一、固定液

非極性、中極性、極性。二、柱內(nèi)徑（mm）

0.2~0.25柱效高、負荷量低、流失小

0.3~0.35負荷量大于毛細口徑柱60%，柱效稍低

0.53~0.6大口徑毛細柱，負荷量近似填充柱，總柱效超過填充柱。

第十五頁，共一百三十頁，編輯于2023年，星期二三、柱長（m）

短柱10~15米分離少于10個組份的樣品

中長柱20~30米分離10~15個組份的樣品

長柱50米以上分離50個組份以上的樣品四、液膜厚度（μm）

薄液膜0.1~0.2μm低負荷量、高沸點化合物

標準液膜0.25~0.33μm一般標準毛細柱分析

厚液膜0.5~1μm負荷量較大，低沸點樣品

特厚液膜1~5μm取代填充柱，分析沸點200℃以下復雜樣品第十六頁，共一百三十頁，編輯于2023年，星期二第十七頁，共一百三十頁，編輯于2023年，星期二氣相色譜

氣相色譜法系采用氣體為流動相（載氣）流經(jīng)裝有固定相的色譜柱進行分離測定的色譜方法。物質(zhì)或其衍生物氣化后，被載氣帶入色譜柱進行分離，各組分先后進入檢測器，記錄并形成色譜信號。第十八頁，共一百三十頁，編輯于2023年，星期二

氣相色譜采用氣體作為流動相，由于物質(zhì)在氣相中的擴散速比在液相中快得多，氣體又比液體的滲透性強，因而相比液相色譜，氣相色譜柱阻力小，傳質(zhì)速度快，可以迅速達到分配平衡，分離效率高。第十九頁，共一百三十頁，編輯于2023年，星期二氣相色譜分析流程第二十頁，共一百三十頁，編輯于2023年，星期二氣相色譜儀組成1.載氣系統(tǒng)：一個讓載氣連續(xù)運行、管路密閉的氣路系統(tǒng)，通過該系統(tǒng)，可以獲得純凈的、流速穩(wěn)定的載氣。它的氣密性、載氣流速的穩(wěn)定性以及測量流量的準確性，對色譜結(jié)果均有很大的影響，因此必須注意控制。第二十一頁，共一百三十頁，編輯于2023年，星期二2.進樣系統(tǒng)：進樣系統(tǒng)包括進樣器和氣化室兩部分。

進樣系統(tǒng)的作用是將液體或固體試樣，在進入色譜柱之前瞬間氣化，然后快速定量地轉(zhuǎn)入到色譜柱中。進樣的多少，進樣時間的長短，試樣的氣化速度等都會影響色譜的分離效果和分析結(jié)果的準確性和重現(xiàn)性。第二十二頁，共一百三十頁，編輯于2023年，星期二分流法：毛細管柱進樣量極小，要引進微量樣品，常采用分流法進樣。即在氣化室出口分兩路，大部分放空，小部分進柱子，這兩部分比例叫分流比。第二十三頁，共一百三十頁，編輯于2023年，星期二3.色譜柱：色譜柱主要有兩類：填充柱和毛細管柱。

a.填充柱:由不銹鋼或玻璃材料制成，內(nèi)裝固定相，一般內(nèi)徑為2~4mm，長1~3m。填充柱的形狀有U型和螺旋型二種。b.毛細管柱:空心毛細管柱材質(zhì)為玻璃或石英。內(nèi)徑一般為0.2~0.5mm，呈螺旋型。

第二十四頁，共一百三十頁，編輯于2023年，星期二在以氮為載氣時，毛細管柱的線速可達16厘米/秒，而填充柱在4厘米/秒，毛細管柱可采用很高的載氣線速來縮短保留時間，

故毛細管柱上可實現(xiàn)快速分析。第二十五頁，共一百三十頁，編輯于2023年，星期二4.尾吹：

毛細管柱內(nèi)流動相流量太小，不能滿足檢測器的最佳操作條件，或是組分會因柱后死體積突然增加導致膨脹流速減緩，而發(fā)生嚴重的縱向擴散，從而導致峰形展寬，影響分離。

增加尾吹氣可改善這一問題。

第二十六頁，共一百三十頁，編輯于2023年，星期二尾吹氣：是從色譜柱出口直接進入檢測器的氣體，也叫補充氣或輔助氣，填充柱不用尾吹氣，而毛細管柱大都采用尾吹氣。第二十七頁，共一百三十頁，編輯于2023年，星期二5.檢測系統(tǒng)：色譜柱內(nèi)徑細，只能分析小量樣品，要求高靈敏度檢測器?？焖俜治鰰r因峰寬只有幾秒或少于1秒，要求檢測器、記錄器響應(yīng)時間快。

目前有多種檢測器可與氣相色譜聯(lián)用，其中常用的檢測器是：氫火焰離子化檢測器（FID）熱導檢測器（TCD)氮磷檢測器（NPD）火焰光度檢測器（FPD）電子捕獲檢測器（ECD)等類型。第二十八頁，共一百三十頁，編輯于2023年，星期二氣相色譜的應(yīng)用氣相色譜分析可以應(yīng)用于分析氣體試樣，也可分析易揮發(fā)或可轉(zhuǎn)化為易揮發(fā)的液體和固體，可分析有機物，也可分析部分無機物。一般地說，只要沸點在500℃以下，熱穩(wěn)定良好，相對分子質(zhì)量在400以下的物質(zhì)，原則上都可采用氣相色譜法。對于難揮發(fā)和熱不穩(wěn)定的物質(zhì)，氣相色譜法是不適用的。第二十九頁，共一百三十頁，編輯于2023年，星期二對于占有機物總數(shù)近80％的那些高沸點、熱穩(wěn)定性差、摩爾質(zhì)量大的物質(zhì)，目前主要采用高效液相色譜法進行分離和分析。第三十頁，共一百三十頁，編輯于2023年，星期二高效液相色譜法

(HighPerformanceLiquidChromatography，HPLC)

高效液相色譜法（HPLC）是20世紀60年代末70年代初發(fā)展起來的一種新型分離分析技術(shù)，已成為應(yīng)用極為廣泛的分離分析的重要手段。它是在經(jīng)典液相色譜基礎(chǔ)上，引入了氣相色譜的理論，在技術(shù)上采用了高壓泵、高效固定相和高靈敏度檢測器，因而具備速度快、效率高、靈敏度高、操作自動化的特點。第三十一頁，共一百三十頁，編輯于2023年，星期二高效液相色譜法與經(jīng)典液相色譜法的比較高效液相色譜法比起經(jīng)典液相色譜法的最大優(yōu)點在于高速、高效、高靈敏度、高自動化。在分析速度上可比經(jīng)典液相色譜法快數(shù)百倍。由于經(jīng)典色譜是重力加料，流出速度極慢；而高效液相色譜配備了高壓輸液設(shè)備，流速最高可達103cm·min-1第三十二頁，共一百三十頁，編輯于2023年，星期二固定相但體和粒度的區(qū)別操作壓力的區(qū)別色譜柱長，柱內(nèi)徑，柱效的區(qū)別樣品用量、分析時間的區(qū)別第三十三頁，共一百三十頁，編輯于2023年，星期二氣相色譜與HPLC的比較1.氣相色譜采用流動相是惰性氣體，它對組分沒有親和力，即不產(chǎn)生相互作用力，僅起運載作用。而高效液相色譜法中流動相可選用不同極性的液體，并參與組分的分離。第三十四頁，共一百三十頁，編輯于2023年，星期二2.氣相色譜一般都在較高溫度下進行的，而高效液相色譜法則通常在室溫條件下工作。3.分析對象的區(qū)別4.柱長，柱形的區(qū)別第三十五頁，共一百三十頁，編輯于2023年，星期二第三十六頁，共一百三十頁，編輯于2023年，星期二HPLC的組成1.高壓輸液系統(tǒng)：由于高效液相色譜所用固定相顆粒極細，因此對流動相阻力很大，為使流動相較快流動，必須配備有高壓輸液系統(tǒng)，一般由儲液罐、高壓輸液泵、過濾器、壓力脈動阻力器等組成，其中高壓輸液泵是核心部件。（恒壓與恒流）第三十七頁，共一百三十頁，編輯于2023年，星期二脈動第三十八頁，共一百三十頁，編輯于2023年，星期二2.進樣系統(tǒng)：高效液相色譜柱比氣相色譜柱短得多（約5～30cm），所以柱外展寬（又稱柱外效應(yīng)）較突出。柱外展寬是指色譜柱外的因素所引起的峰展寬，主要包括進樣系統(tǒng)、連接管道及檢測器中存在死體積等。進樣系統(tǒng)是引起展寬的主要因素，因此高效液相色譜法中對進樣技術(shù)要求較嚴。第三十九頁，共一百三十頁，編輯于2023年，星期二第四十頁，共一百三十頁，編輯于2023年，星期二3.色譜柱：同樣，可以分為填充柱和毛細管柱，但通常較氣相色譜柱短，在柱前還可備一個前置柱，前置柱內(nèi)填充物和分離柱可以完全一樣，這樣可使淋洗溶劑經(jīng)過前置柱而為其中的固定相飽和，使它在流過分離柱時不再與其中固定相作用，保證分離性能不受影響。第四十一頁，共一百三十頁，編輯于2023年，星期二

多數(shù)用于HPLC的色譜柱是用一節(jié)內(nèi)壁經(jīng)高度拋光處理的直不銹鋼管，用收縮接頭將其與HPLC儀器連接。不銹鋼可用于所有有機溶劑與大多數(shù)水性緩沖液。但含氯的流動相可能會緩慢地鹵素腐蝕不銹鋼材質(zhì)（尤其在低pH時），所以使用該流動相時應(yīng)小心。第四十二頁，共一百三十頁，編輯于2023年，星期二色譜柱的保存：避免將柱子泡在水中保存，避免在緩沖液中保存（尤其那些含高濃度水和醇類的）。應(yīng)加入有機溶劑和疊氮鈉，將色譜柱貯存于100%有機溶劑（如乙腈）中是保存鍵合相柱性能與壽命的最好方法之一。避免柱子干涸，應(yīng)將色譜柱兩頭塞緊，以防填充床干涸。第四十三頁，共一百三十頁，編輯于2023年，星期二4.檢測器。主要有紫外、熒光、電化學檢測器，示差折光，電導檢測器等第四十四頁，共一百三十頁，編輯于2023年，星期二分子印跡MolecularImprintingTechnology第四十五頁，共一百三十頁，編輯于2023年，星期二概述抗原與抗體，酶與底物的特異性識別對于抗原抗體的模仿和“塑料抗體”的產(chǎn)生。第四十六頁，共一百三十頁，編輯于2023年，星期二分子印跡的基本過程第四十七頁，共一百三十頁，編輯于2023年，星期二分子印跡聚合物制備過程3、將模板分子從高聚物中解離出來。1、功能單體通過與模板分子相互作用聚集在模板分子周圍形成某種可逆的復合物。2、功能單體與過量交聯(lián)劑在致孔劑存在下發(fā)生共聚生成高聚物。第四十八頁，共一百三十頁，編輯于2023年，星期二模板分子（印跡分子）

根據(jù)所要識別分離的化合物的結(jié)構(gòu)和性質(zhì)，模板分子可以是低分子化合物、低聚物、金屬離子或金屬絡(luò)合物，也可以是分子聚集體。應(yīng)用較多的模板分子有糖類及其衍生物、氨基酸及其衍生物、藥物、激素、殺蟲劑,染料、酶或輔酶、核酸、肽等。第四十九頁，共一百三十頁，編輯于2023年，星期二功能單體：具有可聚合的乙烯基和能與印跡分子相互作用的功能基團的物質(zhì)。第五十頁，共一百三十頁，編輯于2023年，星期二分子印跡的制備作用方式：共價鍵法（預(yù)組裝法）功能單體與印跡分子以共價鍵形式結(jié)合，作用力強，結(jié)合解離速度慢。非共價鍵法（自組裝法）作用力包括靜電，氫鍵，疏水作用，范德華力等，是目前常用的方法。將共價與非共價作用相結(jié)合

通過共價作用合成MIPs，使用過程中以非共價方式進行，兼具兩者的優(yōu)點。第五十一頁，共一百三十頁，編輯于2023年，星期二共價型印跡聚合物結(jié)合解離慢，反應(yīng)條件苛刻，相應(yīng)的功能單體也比較有限，常用的功能單體是含有乙烯基的硼酸、醛、胺、酚等。非共價型印跡聚合物功能單體通常具有一個碳碳雙鍵和一個羧基，能與許多官能團發(fā)生較強的分子間作用，最常用的是甲基丙烯酸（MAA）第五十二頁，共一百三十頁，編輯于2023年，星期二分子印跡聚合物的特點1.預(yù)定性：人們可以根據(jù)不同的目的制備不同的MIP

2.實用性：它與天然的識別系統(tǒng)如酶和底物,抗體和抗原相比，具有抗惡劣環(huán)境的能力，表現(xiàn)出高度穩(wěn)定性和長的使用壽命，且制備簡單。3.特異識別性：MIP是根據(jù)印跡分子定做的，它具有特殊的分子結(jié)構(gòu)和官能團，能選擇性地識別印跡分子第五十三頁，共一百三十頁，編輯于2023年，星期二影響分子印跡吸附的因素印跡分子的影響：分子結(jié)構(gòu)中含有強極性基團和氫鍵等，由于氫鍵具有方向性和飽和性，作用力較強，因此能形成氫鍵的印跡分子往往能制備高選擇性能的MIPs。第五十四頁，共一百三十頁，編輯于2023年，星期二功能單體的影響：功能單體與印跡分子的結(jié)合是MIPs制備的關(guān)鍵，主要有三點要求：1、在合成時，功能單體與印記分子之間的結(jié)合要盡可能的強，這樣才能在聚合過程中把印跡分子牢牢固定住，使之按正確的空間位置排列。第五十五頁，共一百三十頁，編輯于2023年，星期二2、生成聚合物后，印跡分子要能盡可能的與單體分子解離去除。3、功能單體能再次與目標物質(zhì)分子良好結(jié)合，并且這一過程要盡可能的快速并且可逆性好?？梢?，對第一種要求，希望結(jié)合作用有高的活化能，而對后兩種結(jié)合作用則要求較低的活化能。第五十六頁，共一百三十頁，編輯于2023年，星期二在實際使用過程中，可以將不同類型的單體混用，使之具有不同的鍵合種類和數(shù)量，提高MIPs的選擇性。第五十七頁，共一百三十頁，編輯于2023年，星期二交聯(lián)劑的選擇：MIPs的選擇性與交聯(lián)劑的種類和用量有很大的關(guān)系，足夠的交聯(lián)劑的作用是具有一定的硬度，使空穴的形態(tài)穩(wěn)定化，形成穩(wěn)定的結(jié)合位點。同時交聯(lián)劑適當?shù)娜嵝杂质箍昭ň哂辛己玫目山?。MIPs往往需要很高的交聯(lián)度（70~90%）第五十八頁，共一百三十頁，編輯于2023年，星期二最常用的交聯(lián)劑是二甲基丙烯酸二醇酯（EDMA），分子內(nèi)含有2個乙烯基，可以在聚合反應(yīng)中形成網(wǎng)狀。近年來還有采用含3個或以上乙烯基的交聯(lián)劑，能獲得較高的容量，選擇性和柱效率。印跡分子、功能單體與交聯(lián)劑的參考比例為1：4：20第五十九頁，共一百三十頁，編輯于2023年，星期二第六十頁，共一百三十頁，編輯于2023年，星期二MIPs不僅具有特定的選擇性和高親和性，而且還具有很好的物理化學穩(wěn)定性，如能抵抗很強的機械作用力、能耐高溫高壓、能抵抗酸堿、高濃度的鹽溶液及有機溶劑作用，使用壽命長，能多次重復使用而不損失分子記憶效應(yīng)。是一種重要的手性色譜固定相技術(shù)，在手性分子分離方面有著廣闊的應(yīng)用前景。第六十一頁，共一百三十頁，編輯于2023年，星期二分子印跡固相萃取技術(shù)

MIPs具有特異選擇性的優(yōu)點使之非常適合作為SPME的涂層材料，可將MIP的高選擇性與SPME技術(shù)操作簡便、易自動化的特點結(jié)合在一起，不僅SPME獲得了更高的選擇性，能夠更高效地從復雜樣品中分離富集目標分子，清除基體干擾，從而降低檢出限，提高分析的精度和準確性。第六十二頁，共一百三十頁，編輯于2023年，星期二分子印跡膜分離技術(shù)分子印跡膜（MIM）是一種結(jié)合了微孔篩分作用和分子印跡特異性吸附能力的膜技術(shù)。由于膜對目標分子的特異性吸附及由此而來的對擴散通道更高的接近能力，MIM能傳輸特定的底物分子，對MIM的研究是分子印跡技術(shù)領(lǐng)域的熱點。第六十三頁，共一百三十頁，編輯于2023年，星期二MIPs作為選擇性分離劑所存在的問題：1、制備MIPs需要大量純凈的印跡分子2、分離容量不足3、MIPs骨架的非特異性吸附4、親和性仍然不及天然配體5、功能單體，交聯(lián)劑和聚合方法仍然有限第六十四頁，共一百三十頁，編輯于2023年，星期二6、多數(shù)MIPs的制備和使用都是在非極性溶液中進行，對水溶性分子的分離有局限性。7、由于目前MIP制備方法本身存在合成時須使用大量模板分子的問題，導致模板分子滲漏現(xiàn)象難以得到根本解決，限制了分子印跡技術(shù)在痕量分析中的實際應(yīng)用。第六十五頁，共一百三十頁，編輯于2023年，星期二生物大分子印跡面臨的挑戰(zhàn)

生物大分子印跡機理

對于蛋白質(zhì)等生物大分子來說，其功能結(jié)構(gòu)比較復雜。蛋白質(zhì)的空間構(gòu)型和側(cè)鏈的氨基酸功能機基團如絲氨酸的羥基，酪氨酸得苯酚環(huán)，賴氨酸的氨基，半胱氨酸的巰基都給MIPs技術(shù)帶來了許多不可預(yù)測的因素。蛋白質(zhì)的構(gòu)型在聚合反應(yīng)的條件和過程中可能發(fā)生改變，從而使獲得的MIP與模板蛋白不匹配以至失去親和作用。第六十六頁，共一百三十頁，編輯于2023年，星期二蛋白質(zhì)等大分子進行印跡的單體應(yīng)該比小分子印跡聚合物的單體更為惰性，否則很容易造成非特異性吸附。尋找溫和有效的洗脫方法也是目前該領(lǐng)域的一個亟待解決的問題，如果吸附的目標分子無法被洗脫并保持其生物活性，對于比較昂貴的蛋白質(zhì)分子印跡技術(shù)的發(fā)展就會受到很大的限制。第六十七頁，共一百三十頁，編輯于2023年，星期二分子印跡技術(shù)的其他應(yīng)用酶催化，抗體模擬，生物傳感器，緩釋藥物，地質(zhì)測量，食品藥物安全檢測，環(huán)境監(jiān)控等第六十八頁，共一百三十頁，編輯于2023年，星期二電泳分離技術(shù)第六十九頁，共一百三十頁，編輯于2023年，星期二電泳：是指帶電粒子在電場中向與其自身帶相反電荷的電極移動的現(xiàn)象。正極負極帶負電粒子帶正電粒子第七十頁，共一百三十頁，編輯于2023年，星期二電泳的主要影響因素1、電泳介質(zhì)的pH值：溶液的pH值決定帶電顆粒解離的程度，亦即決定其所帶凈電荷的多少。對蛋白質(zhì)兩性電解質(zhì)而言，pH值離pI越遠，則顆粒凈電荷越多，泳動速度越快，反之則越慢。因此應(yīng)選擇合適的pH，使各種蛋白質(zhì)所帶電荷差異較大，有利于彼此分開，為了使電泳過程溶液pH值恒定，必須采用具有一定緩沖能力的緩沖溶液。第七十一頁，共一百三十頁，編輯于2023年，星期二2、緩沖液的離子強度：離子強度影響顆粒的電動電勢。溶液的離子強度越高，電動電勢越小，則電泳速度越慢，反之，則越快。離子強度過低，溶液的緩沖能力減弱，不易維持所需pH值，反而會影響顆粒帶電荷狀態(tài)影響電泳。第七十二頁，共一百三十頁，編輯于2023年，星期二3、電滲現(xiàn)象

液體在電場中對于一個固體支持物的相對移動，稱為電滲現(xiàn)象。例如，在紙電泳時，由于紙上帶有負電荷，而與紙接觸的水溶液因為靜電感應(yīng)帶有正電荷，在電場的作用下溶液便向負極移動并帶動著質(zhì)點向負極移動。假如這時進行電泳，則質(zhì)點移動的表面速度是質(zhì)點移動速度和由于溶液移動而產(chǎn)生的電滲速度的加和。

第七十三頁，共一百三十頁，編輯于2023年，星期二＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋+-液相固相電滲流電滲示意圖第七十四頁，共一百三十頁，編輯于2023年，星期二4、電場強度：電場強度是電泳支持物上每厘米的電位降，也稱電勢梯度。電場強度對電泳速度起著決定性作用，電場強度越高，電泳速度越快，但隨著電壓的增加，電流加大，產(chǎn)生熱效應(yīng)影響電泳。進行高壓電泳應(yīng)配備冷卻水系統(tǒng)以便在電泳過程中降溫。第七十五頁，共一百三十頁，編輯于2023年，星期二5、溫度的影響電泳過程中由于通電產(chǎn)生焦耳熱，熱對電泳有很大的影響。為降低熱效應(yīng)對電泳的影響，可控制電壓或電流，或在電泳系統(tǒng)中安裝冷卻散熱裝置。第七十六頁，共一百三十頁，編輯于2023年，星期二電泳的分類第七十七頁，共一百三十頁，編輯于2023年，星期二按支持介質(zhì)的不同，還可以分為惰性載體類和凝膠類電泳。惰性載體包括濾紙，醋酸纖維素薄膜和硅膠等。凝膠包括瓊脂糖凝膠，聚丙烯酰胺凝膠等第七十八頁，共一百三十頁，編輯于2023年，星期二醋酸纖維素薄膜電泳第七十九頁，共一百三十頁，編輯于2023年，星期二充分浸泡，沒有氣泡點樣均勻勿點多膜分2面電壓大了會燒第八十頁，共一百三十頁，編輯于2023年，星期二特點：１

電泳后區(qū)帶界限清晰；

２通電時間較短；３它對各種蛋白質(zhì)幾乎完全不吸附，因此無拖尾現(xiàn)象；４靈敏度高，樣品用量少。５對染料也沒有吸附。６它的電滲作用雖高但很均一，不影響樣品的分離效果。第八十一頁，共一百三十頁，編輯于2023年，星期二凝膠電泳較少對流，防止擴散，具有分子篩效應(yīng)，設(shè)備簡單，操作方便，具有很高的分辨率和選擇性。是一種很常用的電泳分離技術(shù)。凝膠電泳的主要介質(zhì)包括瓊脂糖和聚丙烯酰胺。第八十二頁，共一百三十頁，編輯于2023年，星期二瓊脂糖凝膠電泳

瓊脂糖是從瓊脂中提取的膠狀多糖，常態(tài)下為白色粉末，使用時按一定比例加入緩沖液，加熱熔化成均勻液態(tài)膠體，倒入電泳槽冷凝后即可使用。使用十分簡單，膠體具有分子篩效應(yīng)，孔徑可調(diào)，性質(zhì)穩(wěn)定，樣品易于回收。常用于DNA，RNA，以及一些蛋白質(zhì)的分離分析，分辨率不及聚丙烯酰胺。第八十三頁，共一百三十頁，編輯于2023年，星期二第八十四頁，共一百三十頁，編輯于2023年，星期二第八十五頁，共一百三十頁，編輯于2023年，星期二瓊脂糖凝膠用于DNA電泳時，常用EB染色，EB是一種強致癌劑，使用時應(yīng)特別小心。第八十六頁，共一百三十頁，編輯于2023年，星期二質(zhì)粒電泳開環(huán)線形超螺旋第八十七頁，共一百三十頁，編輯于2023年，星期二聚丙烯酰胺凝膠電泳聚丙烯酰胺凝膠電泳（polyacrylamidegelelectrophoresis，簡稱PAGE）是以聚丙烯酰胺凝膠作為支持介質(zhì)的電泳方法

PAGE應(yīng)用廣泛，可用于蛋白質(zhì)、核酸等生物分子的分離、定性、定量及少量的制備，還可測定分子量、等電點等第八十八頁，共一百三十頁，編輯于2023年，星期二常規(guī)聚丙烯酰胺凝膠電泳電荷因素分子大小分子形狀電荷效應(yīng)與分子篩效應(yīng)共同起作用第八十九頁，共一百三十頁，編輯于2023年，星期二聚丙烯酰胺凝膠有下列特性：(1)在一定濃度時，凝膠透明，有彈性，機械性能好；(2)化學性能穩(wěn)定，與被分離物不起化學反應(yīng)，在很多溶劑中不溶；(3)對pH和溫度變化較穩(wěn)定；(4)幾乎無吸附和電滲作用，只要純度高，操作條件一致，則樣品分離重復性好；第九十頁，共一百三十頁，編輯于2023年，星期二(5)樣品不易擴散，且用量少，其靈敏度可達10-6g(6)凝膠孔徑可調(diào)節(jié)，根據(jù)被分離物的分子量選擇合適的濃度，通過改變單體及交聯(lián)劑的濃度調(diào)節(jié)凝膠的孔徑；(7)分辨率高，尤其在不連續(xù)凝膠電泳中，集濃縮、分子篩和電荷效應(yīng)為一體。因而較醋酸纖維薄膜電泳、瓊脂糖電泳等有更高的分辨率。第九十一頁，共一百三十頁，編輯于2023年，星期二丙烯酰胺凝膠聚合原理第九十二頁，共一百三十頁，編輯于2023年，星期二第九十三頁，共一百三十頁，編輯于2023年，星期二丙烯酰胺的聚合（1）AP-TEMED：化學聚合作用。

加速劑TEMED的堿基可使催化劑過硫酸銨（簡稱AP）的水溶液產(chǎn)生出游離氧原子，然后激活單體，形成單體長鏈，在交聯(lián)劑Bis作用下聚合成凝膠。（2）核黃素-TEMED：光聚合作用。光聚合作用通常需痕量氧原子存在才能發(fā)生，因為核黃素在TEMED及光照條件下，還原成無色核黃素，后者被氧再氧化形成自由基，從而引發(fā)聚合作用。第九十四頁，共一百三十頁，編輯于2023年，星期二影響聚合反應(yīng)的各種因素：?催化劑的濃度：應(yīng)選擇合適的AP和TEMED濃度使聚合時間控制在30—60min內(nèi)較好，過量的催化劑和加速劑會引起燒膠和蛋白質(zhì)條帶的畸變。?pH：TEMED只能以游離堿的形式發(fā)揮作用，在酸性條件下，叔胺缺少自由堿基，引發(fā)AP產(chǎn)生自由基的過程會被延遲，聚合時間延長。第九十五頁，共一百三十頁，編輯于2023年，星期二?

溫度：聚合速度與溫度有關(guān)，一般是高溫聚合快，而聚合的速度影響交聯(lián)孔徑的大小，所以凝膠聚合時必須保持溫度恒定，通常用與電泳相同的溫度。?

分子氧：分子氧的存在會阻止碳鏈的延長，妨礙聚合作用，在聚合過程中要盡量避免接觸空氣。?

雜質(zhì)：某些金屬離子或其它雜質(zhì)也會影響凝膠的化學聚合，所以應(yīng)選擇高純度的Acr、Bis和AP。第九十六頁，共一百三十頁，編輯于2023年，星期二聚丙烯酰胺凝膠的一些相關(guān)概念凝膠濃度：每100亳升凝膠溶液中含有單體和交聯(lián)劑的總克數(shù)稱凝膠濃度，用T%表達；

T%=(a+b)/ma：丙烯酰胺克數(shù)；b：N,N-甲叉雙丙烯酰胺克數(shù)；m：緩沖液體積（毫升）。第九十七頁，共一百三十頁，編輯于2023年，星期二交聯(lián)度凝膠溶液中交聯(lián)劑占單體和交聯(lián)體總量的百分數(shù)稱為交聯(lián)度，常用C%表示。

C%=b/（a+b）凝膠a、b的比例決定了凝膠的物理性狀。當a:b小于10時，凝膠脆且硬，不透明，呈乳白色；當a:b大于100時，丙烯酰胺凝膠易呈糊狀；通常用a:b在30左右，并且丙烯酰胺濃度高于3%，凝膠富有彈性并且透明。第九十八頁，共一百三十頁，編輯于2023年，星期二凝膠的總質(zhì)量濃度T和交聯(lián)度C決定凝膠的有效孔徑。大多數(shù)蛋白質(zhì)在7.5%凝膠中能得到滿意的結(jié)果，所以這個濃度的凝膠稱為標準膠。當分析一個未知樣品時，常用標準膠來測試，而后確定適宜的凝膠濃度。第九十九頁，共一百三十頁，編輯于2023年，星期二聚丙烯酰胺凝膠電泳的連續(xù)性聚丙烯酰胺凝膠電泳根據(jù)其有無濃縮效應(yīng)，可分為連續(xù)的和不連續(xù)的兩類。前者指整個電泳系統(tǒng)中所用緩沖液，pH值和凝膠網(wǎng)孔都是相同的；后者是指在電泳系統(tǒng)中采用了兩種或兩種以上的緩沖液、pH值和孔徑，不連續(xù)電泳能使稀的樣品在電泳過程中濃縮成層，從而提高分辨能力。第一百頁，共一百三十頁，編輯于2023年，星期二不連續(xù)聚丙烯酰胺凝膠電泳1.孔徑的不連續(xù)性：濃縮膠的孔徑大，分離膠的孔徑小。在電場的作用下，蛋白質(zhì)顆粒在大孔膠中泳動時遇到的阻力小，移動快。而在小孔膠中泳動時遇到的阻力大，移動慢。因此，在兩層凝膠的交界處，由于凝膠孔徑的不連續(xù)性使樣品遷移受阻而壓縮成很窄的區(qū)帶。第一百零一頁，共一百三十頁，編輯于2023年，星期二2.緩沖液離子成分的不連續(xù)性,（等速電泳）體系中含三種離子。走在最前面的稱為快離子或前導離子。走在最后的稱為慢離子或尾隨離子。第一百零二頁，共一百三十頁，編輯于2023年，星期二快離子和慢離子間形成一個穩(wěn)定的遷移界面，形成三種離子移動界面，蛋白質(zhì)離子夾在中間，被濃縮成一薄層。第一百零三頁，共一百三十頁，編輯于2023年，星期二3.凝膠pH的不連續(xù)性：濃縮膠和分離膠的pH不同，這是為了控制尾隨離子的的解離度從而控制其遷移速率。濃縮膠中要控制尾隨離子使其走得慢來形成離子界面，到了分離膠，則要使其走得快，消除離子界面的影響。第一百零四頁，共一百三十頁，編輯于2023年，星期二當夾在快離子和慢離子中間的蛋白質(zhì)通過濃縮膠進入分離膠時，由于pH值和凝膠孔徑突然改變，慢離子的解離度增大，因而它的有效遷移率也增加，此時慢離子的有效遷移率超過了所有蛋白質(zhì)的有效遷移率，從而趕上并超過所有蛋白質(zhì)分子，這樣，高電壓梯度不存在了，濃縮效應(yīng)被破壞，蛋白質(zhì)樣品是在一個均一的電壓梯度和pH條件下通過分離膠。第一百零五頁，共一百三十頁，編輯于2023年，星期二第一百零六頁，共一百三十頁，編輯于2023年，星期二第一百零七頁，共一百三十頁，編輯于2023年，星期二SDSSDS：變性聚丙烯酰胺凝膠電泳，加入的SDS和還原劑主要有2個作用，一是破壞蛋白質(zhì)的高級結(jié)構(gòu)，二是與蛋白結(jié)合屏蔽蛋白自身所帶的電荷。其結(jié)果是這種蛋白在電泳中的遷移率只與蛋白質(zhì)的分子量大小有關(guān)，而與所帶電荷和形狀無關(guān)。因此可以利用SDS測定蛋白質(zhì)分子量。第一百零八頁，共一百三十頁，編輯于2023年，星期二SDS的主要影響因素SDS的濃度：

P與SDS的質(zhì)量比應(yīng)為1：4或1：3緩沖液的離子強度需要較低的離子濃度，10~100mmol/L二硫鍵的還原程度合適的凝膠濃度第一百零九頁，共一百三十頁，編輯于2023年，星期二注意兩板之間要均勻夾緊，不要接觸板內(nèi)表面，膠配好后要盡快加入板中，特別是加入引發(fā)劑和加速劑后。板內(nèi)不能留有氣泡，上膠后要以蒸餾水密封。第一百一十頁，共一百三十頁，編輯于2023年，星期二配膠，注入，液封，聚合，上樣，電泳，染色第一百一十一頁，共一百三十頁，編輯于2023年，星期二等電聚焦電泳

等電聚焦(isoelectrofocusing)，縮寫為IEF或EF，是60年代中期問世的一種利用有pH梯度的介質(zhì)分離等電點不同的蛋白質(zhì)的電泳技術(shù)。由于其分辨率可達0.01pH單位，因此特別適合于分離分子量相近而等電點不同的蛋白質(zhì)組分。

第一百一十二頁，共一百三十頁，編輯于2023年，星期二

各種蛋白質(zhì)各自都有一個等電點,在一定的pH環(huán)境中，蛋白質(zhì)分子呈電中性，在電場中不會遷移。

等電聚焦就是在電泳介質(zhì)中放入兩性載體電解質(zhì)，當通以直流電時，兩性電解質(zhì)即形成一個由陽極到陰極逐步增加的pH梯度，在此體系中，不同的蛋白質(zhì)移動到其相當?shù)牡入婞c位置上，就不再遷移，也就是說被聚焦于一個狹窄的區(qū)帶中，也稱為聚焦電泳。第一百一十三頁，共一百三十頁，編輯于2023年，星期二高pH等電聚焦電泳進行過程中低pH（＋）（＋）高pH等電聚焦電泳結(jié)束后低pH（－）（－）第一百一十四頁，共一百三十頁，編輯于2023年，星期二pH梯度的形成

用多種兩性電解質(zhì)混合物建立穩(wěn)定良好的pH梯度，載體兩性電解質(zhì)是一些具有相近等電點的分子量為600－900Da的多氨基多羥基兩性化合物的混和物第一百一十五頁，共一百三十頁，編輯于2023年，星期二理想的載體兩性電解質(zhì)應(yīng)具備的特征：

①分子量要小，以便與被分離大分子物質(zhì)分離；②化學性質(zhì)穩(wěn)定；③各成分的pI彼此接近，并在其pI值附近有良好的緩沖能力；④在pI處具有足夠的電導，導電性均勻；⑤兩性電解質(zhì)載體的數(shù)目要足夠多；⑥可溶性好；⑦對280nm的紫外光沒有或僅有很低的吸光度，不干擾樣品的測定。第一百一十六頁，共一百三十頁，編輯于2023年，星期二載體兩性電解質(zhì)的合成

本質(zhì)：一系列脂肪族多氨基多羧酸同系物和異構(gòu)體，具有很多既不相同又十分接近相互連接的pI值。pH范圍：pH3~10丙烯酸+多乙烯多胺Ampholine（LKB）加成反應(yīng)第一百一十七頁，共一百三十頁，編輯于2023年，星期二第一百一十八頁，共一百三十頁，編輯于2023年，星期二

㈠沒通電時的變化所有的載體兩性電解質(zhì)分子都荷電，只是溶液中荷正電和荷負電的基團數(shù)目相等，凈電荷為零。第一百一十九頁，共一百三十頁，編輯于2023年，星期二

（二）引