高效液相色譜法

模塊五高效液相色譜法一、背景知識二、項(xiàng)目化教學(xué)參考方案一、背景知識(一)概述高效液相色譜法(HPLG,HighPerformance,LiquidChromatography)是在經(jīng)典液相色譜法基礎(chǔ)上發(fā)展起來的一種新型分離、分析技術(shù)。經(jīng)典液相色譜法由于使用粗顆粒的固定相，填充不均勻，依靠重力使流動相流動，因此分析速度慢，分離效率低。新型高效的固定相、高壓輸液泵、梯度洗脫技術(shù)以及各種高靈敏度的檢測器相繼發(fā)明，使高效液相色譜法迅速發(fā)展起來。高效液相色譜法與經(jīng)典液相色譜法比較，具有下列主要特點(diǎn)。上一頁下一頁返回一、背景知識(1)高效。由于使用了細(xì)顆粒、高效率的固定相和均勻填充技術(shù)，高效液相色譜法分離效率極高，柱效一般可達(dá)每米10-4理論塔板。(2)高速。由于使用高壓泵輸送流動相，采用梯度洗脫裝置，用檢測器在柱后直接檢測洗脫組分等，HPLC完成一次分離分析一般只需幾分鐘到幾十分鐘比經(jīng)典液相色譜快得多。(3)高靈敏度。紫外、熒光、電化學(xué)、質(zhì)譜等高靈敏度檢測器的使用，使HPLC的最小檢測量可達(dá)10-9~10-11g。(4)高度自動化。計(jì)算機(jī)的應(yīng)用，使HPLC不僅能自動處理數(shù)據(jù)、繪圖和打印分析結(jié)果，而且還可以自動控制色譜條件，使色譜系統(tǒng)自始至終都在最佳狀態(tài)下工作，成為全自動化的儀器。上一頁下一頁返回一、背景知識(5)應(yīng)用范圍廣。與氣相色譜法相比，HPLC可用于高沸點(diǎn)、相對分子質(zhì)量大、熱穩(wěn)定性差的有機(jī)化合物及各種離子的分離分析。如氨基酸、蛋白質(zhì)、生物堿、核酸、維生素、抗生素等。(6)流動相可選擇范圍廣。它可用多種溶劑作流動相，通過改變流動相組成改善分離效果，因此對于性質(zhì)和結(jié)構(gòu)類似的物質(zhì)分離的可能性比氣相色譜法更大。(7)餾分容易收集，更有利于制備。(二)高效液相色譜儀工作流程及主要組成部分高效液相色譜儀主要有分析型、制備型和專用型3類。一般由s個部分組成:高壓輸液系統(tǒng)、進(jìn)樣系統(tǒng)、分離系統(tǒng)、檢測系統(tǒng)和數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)。上一頁下一頁返回一、背景知識1.儀器工作流程高效液相色譜儀現(xiàn)在多做成一個個單元組件，然后根據(jù)分析要求將各所需單元組件組合起來，最基本的組件是高壓輸液系統(tǒng)、進(jìn)樣器、色譜柱、檢測器和工作站(數(shù)據(jù)處理系統(tǒng))。此外，還可根據(jù)需要配置自動進(jìn)樣系統(tǒng)、預(yù)柱、流動相在線脫氣裝置和自動控制系統(tǒng)等裝置。圖5-1是普通配制的帶有預(yù)柱的HPLC的結(jié)構(gòu)圖。2.儀器主要組成部分1)高壓輸液系統(tǒng)包括貯液裝置、高壓輸液泵、過濾器、脫氣裝置等。(1)貯液器。貯液器用于存放溶劑。溶劑必須很純，貯液器材料要耐腐蝕，對溶劑呈惰性。上一頁下一頁返回一、背景知識(2)脫氣裝置。脫氣的目的是為了防止流動相從高壓柱內(nèi)流出時，釋放出氣泡進(jìn)入檢測器而使噪聲劇增，甚至不能正常檢測。(3)高壓輸液泵。高壓輸液泵是高效液相色譜儀的重要部件，是驅(qū)動溶劑和樣品通過色譜柱和檢測系統(tǒng)的高壓源，其性能好壞直接影響分析結(jié)果的可靠性。(4)梯度洗脫裝置。梯度洗脫是利用兩種或兩種以上的溶劑，按照一定時間程序連續(xù)或階段地改變配比濃度，以達(dá)到改變流動相極性、離子強(qiáng)度或pH值，從而提高洗脫能力，改善分離的一種有效方法。上一頁下一頁返回一、背景知識2)進(jìn)樣器進(jìn)樣器一般要求密封性好，死體積小，重復(fù)性好，保證中心進(jìn)樣，進(jìn)樣時對色譜系統(tǒng)的壓力和流量波動小，并便于實(shí)現(xiàn)自動化。微量進(jìn)樣注射器和高壓進(jìn)樣閥是目前廣泛采用的兩種進(jìn)樣器。閥的種類很多，有六通閥、四通閥，雙路閥等。以六通進(jìn)樣閥最為常用。3)分離系統(tǒng)色譜分離系統(tǒng)包括色譜柱、固定相和流動相。色譜柱是其核心部分，柱應(yīng)具備耐高壓、耐腐蝕、抗氧化、密封不漏液和柱內(nèi)死體積小、柱效高、柱容量大、分析速度快、柱壽命長的要求。通常采用優(yōu)質(zhì)不銹鋼管制成。上一頁下一頁返回一、背景知識4)檢測系統(tǒng)檢測器的作用是將柱流出物中樣品組成和含量的變化轉(zhuǎn)化為可供檢測的信號，常用檢測器有紫外吸收、熒光、示差折光、化學(xué)發(fā)光等。(1)紫外可見吸收檢測器(UVD,UltravioletVisibleDetector)。紫外可見吸收檢測器(UVD)是HPLC中應(yīng)用最廣泛的檢測器之一，幾乎所有的液相色譜儀都配有這種檢測器。其特點(diǎn)是靈敏度較高，線性范圍寬，噪聲低，適用于梯度洗脫，對強(qiáng)吸收物質(zhì)檢測限可達(dá)1ng，檢測后不破壞樣品，可用于制備。紫外可見檢測器的工作原理與結(jié)構(gòu)同一般分光光度計(jì)相似，實(shí)際上就是裝有流通池的紫外可見光度計(jì)。上一頁下一頁返回一、背景知識①紫外吸收檢測器。紫外吸收檢測器常用氛燈作光源，氛燈則發(fā)射出紫外一可見區(qū)范圍的連續(xù)波長，并安裝一個光柵型單色器，其波長選擇范圍寬(190~800)nm。它有兩個流通池，一個作參比，一個作測量用，光源發(fā)出的紫外光照射到流通池上，若兩流通池都通過純的均勻溶劑，則它們在紫外波長下幾乎無吸收，光電管上接收到的輻射強(qiáng)度相等，無信號輸出。當(dāng)組分進(jìn)入測量池時，吸收一定的紫外光，使兩光電管接收到的輻射強(qiáng)度不等，這時有信號輸出，輸出信號大小與組分濃度有關(guān)。上一頁下一頁返回一、背景知識局限:流動相的選擇受到一定限制，即具有一定紫外吸收的溶劑不能做流動相，每種溶劑都有截止波長，當(dāng)小于該截止波長的紫外光通過溶劑時，溶劑的透光率降至10%以下，因此，紫外吸收檢測器的工作波長不能小于溶劑的截止波長。②光電二極管陣列檢測器(PDAD,PhotoDiodeArrayDetector)。光電二極管陣列檢測器也稱快速掃描紫外可見分光檢測器，是一種新型的光吸收式檢測器。圖5-2是單光束二極管陣列檢測器的光路圖。光源發(fā)出的光先通過檢測池，透射光由全息光柵色散成多色光，射到陣列元件上，使所有波長的光在接收器上同時被檢測。上一頁下一頁返回一、背景知識(2)熒光檢測器(FD,FluorescenceDetector)。熒光檢測器是一種高靈敏度、有選擇性的檢測器，可檢測能產(chǎn)生熒光的化合物。某些不發(fā)熒光的物質(zhì)可通過化學(xué)衍生化生成熒光衍生物，再進(jìn)行熒光檢測。其最小檢測濃度可達(dá)0.1ng/mL，適用于痕量分析;一般情況下熒光檢測器的靈敏度比紫外檢測器約高兩個數(shù)量級，但其線性范圍不如紫外檢測器寬。(3)示差折光檢測器(RID,DifferentialRefractiveIndexDetector)。示差折光檢測器是一種濃度型通用檢測器，對所有溶質(zhì)都有響應(yīng)，某些不能用選擇性檢測器檢測的組分，如高分子化合物、糖類、脂肪烷烴等，可用示差檢測器檢測。上一頁下一頁返回一、背景知識(4)電化學(xué)檢測器(ED,Elec-chemicalDetector)。電化學(xué)檢測器主要有安培、極譜、庫侖、電位、電導(dǎo)等檢測器，屬選擇性檢測器，可檢測具有電活性的化合物。目前它已在各種無機(jī)和有機(jī)陰陽離子、生物組織和體液的代謝物、食品添加劑、環(huán)境污染物、生化制品、農(nóng)藥及醫(yī)藥等的測定中獲得了廣泛的應(yīng)用。其中，電導(dǎo)檢測器在離子色譜中應(yīng)用最多。5)數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)早期的HPLC只配有記錄儀記錄色譜峰，用人工計(jì)算A或H。隨著計(jì)算機(jī)技術(shù)的發(fā)展，簡單的積分儀，可自動打印出H,A和tR，做一些簡單的計(jì)算，但不能存儲數(shù)據(jù)。上一頁下一頁返回一、背景知識(三)液-固色譜法1.原理“液-固色譜法”是指利用各組分在固定相上吸附能力的不同而將它們分離的方法。當(dāng)組分隨著流動相通過色譜柱中的吸附劑時，組分分子及流動相分子對吸附劑表面的活性中心發(fā)生吸附竟?fàn)帯＝M分分子對活性中心的竟?fàn)幠芰Φ拇笮Q定了它們保留值的大小。被活性中心吸附越強(qiáng)的組分分子越不容易被流動相洗脫，k值就大;反之k值就小。組分之間的k值相差越大，分離越容易。吸附劑吸附能力的強(qiáng)弱與吸附劑的比表面積、物理化學(xué)性質(zhì)、組分分子的結(jié)構(gòu)和組成以及流動相的性質(zhì)等因素有關(guān)。上一頁下一頁返回一、背景知識2.固定相液-固吸附色譜所使用的固定相，多數(shù)是有吸附活性的吸附劑，常用的有表面多孔型和全多孔微粒型硅膠、氧化鋁、分子篩等。1)表面多孔型又稱薄殼型，是高效液相色譜使用的第一種填料。表面多孔填料的機(jī)械強(qiáng)度好，易填充均勻、緊密，滲透性好，表面孔隙淺，傳質(zhì)快，柱效高，分離速度慢。其主要缺點(diǎn)是由于比表面積小，柱容量低，允許進(jìn)樣量小。上一頁下一頁返回一、背景知識2)全多孔微粒型目前廣泛使用的有球形和無定形兩種，顆粒直徑為3~10μm，它具有粒度小，比表面積大(100~600m2/g)、孔穴淺、柱效高和柱容量大的優(yōu)點(diǎn)。3.流動相實(shí)現(xiàn)最佳分離與流動相的選擇有關(guān)。流動相(即溶劑)的極性是重要的依據(jù)。溶劑的極性強(qiáng)弱可用溶劑強(qiáng)度參數(shù)ε0來衡量。溶劑強(qiáng)度參數(shù)ε0越大，表示洗脫劑的極性越強(qiáng)。上一頁下一頁返回一、背景知識(四)化學(xué)鍵合相色譜法1.原理“化學(xué)鍵合相色譜法”是采用化學(xué)鍵合相作固定相的液相色譜法?；瘜W(xué)鍵合相是利用化學(xué)反應(yīng)通過共價鍵將有機(jī)分子鍵合在載體(硅膠)表面，形成均一、牢固的單分子薄層而構(gòu)成的固定相。其分離機(jī)理為吸附和分配兩種機(jī)理兼有。對多數(shù)鍵合相來說，以分配機(jī)理為主?；瘜W(xué)鍵合固定相具有以下優(yōu)點(diǎn)。(1)柱效高。傳質(zhì)速度比一般液體固定相快。(2)穩(wěn)定性好。耐溶劑沖洗，耐高溫，無固定液流失，從而提高了色譜柱的穩(wěn)定性和使用壽命。上一頁下一頁返回一、背景知識(3)應(yīng)用范圍廣。改變鍵合有機(jī)分子的結(jié)構(gòu)和基團(tuán)的類型，能靈活地改變分離的選擇性，適用于分離幾乎所有類型的化合物;且能用各種溶劑作流動相(梯度洗脫)。2.流動相化學(xué)鍵合相色譜所用流動相的極性必須與固定相顯著不同，根據(jù)流動相和固定相的相對極性不同可分為以下幾種。1)正相鍵合相色譜法流動相極性小于固定相極性。常用非極性溶劑如烷烴類溶劑，樣品組分的保留值可用加入適當(dāng)?shù)挠袡C(jī)溶劑(調(diào)節(jié)劑)的辦法調(diào)節(jié)洗脫強(qiáng)度。常用有機(jī)溶劑為極性溶劑，如氯仿、二氯甲烷、乙睛、醇類等。上一頁下一頁返回一、背景知識2)反相鍵合相色譜法流動相極性大于固定相極性。流動相多以水或無機(jī)鹽緩沖液為主體，再加入一種能與水相混溶的有機(jī)溶劑(如甲醇、乙睛、四氫吠喃等)為調(diào)節(jié)，根據(jù)分離需要，改變洗脫劑的組成及含量，以調(diào)節(jié)極性和洗脫能力。在反相鍵合相色譜中，極性大的組分先流出，極性小的組分后流出。(五)離子交換色譜法1.原理離子交換色譜的固定相是交換劑，根據(jù)交換劑性質(zhì)可分為:陽離子交換劑和陰離子交換劑。上一頁下一頁返回一、背景知識交換劑由固定的離子基團(tuán)和可交換的平衡離子組成。當(dāng)流動相帶著組分離子通過離子交換柱時，組分離子與交換劑上可交換的平衡離子進(jìn)行可逆交換，最后達(dá)到交換平衡，陰陽離子的交換平衡可表示為:陽離子交換:陰離子交換:交換劑上的固定離子基團(tuán)?？山粨Q的平衡離子。組分離子。2.固定相早期離子交換色譜法采用離子交換樹脂作為固定相，有溶脹和收縮現(xiàn)象，不耐高壓，而且表面微孔結(jié)構(gòu)影響傳質(zhì)，柱效低，現(xiàn)已被離子交換鍵合相所取代。上一頁下一頁返回一、背景知識3.流動相離子交換色譜流動相通常是鹽類的緩沖溶液。通過改變流動相的pH值、緩沖劑(平衡離子)的類型、離子強(qiáng)度以及加入有機(jī)溶劑、配位劑等都會改變交換劑的選擇性，影響樣品的分離效果。常用的緩沖劑有:磷酸鹽、乙酸鹽、檸檬酸鹽、甲酸鹽、氨水等。(六)尺寸排阻色譜法1.分離原理尺寸排阻色譜法:是按分子尺寸的差異進(jìn)行分離的一種液相色譜方法，也稱凝膠色譜法。上一頁下一頁返回一、背景知識排阻色譜的固定相多為凝膠。凝膠是一種由有機(jī)分子制成的分子篩，其表面惰性，含有許多不同大小孔穴或立體網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)。凝膠的孔穴大小與被分離組分大小相當(dāng)，對不同大小的組分分子則可分別滲到凝膠孔內(nèi)的不同深度。尺寸大的組分分子可以滲入到凝膠的大孔內(nèi)，但進(jìn)不了小孔，甚至于完全被排斥，先流出色譜柱。尺寸小的組分分子，大孔小孔都可以滲進(jìn)去，最后流出。當(dāng)組分X進(jìn)入柱子后，它就要從高濃度的流動相向固定相孔隙內(nèi)的流動相擴(kuò)散。當(dāng)組分X進(jìn)入色譜固定相達(dá)到擴(kuò)散平衡時:組分的分配系數(shù)為:上一頁下一頁返回一、背景知識

2.固定相尺寸排阻色譜常用固定相有無機(jī)和有機(jī)兩大類。無機(jī)凝膠:又稱硬質(zhì)凝膠。它是具有一定孔徑范圍的多孔性凝膠，如多孔硅膠、多孔玻璃珠等，此類凝膠化學(xué)惰性，穩(wěn)定性及機(jī)械強(qiáng)度均好，耐高溫，使用壽命長，但裝柱時易碎，不易裝緊，柱效較低。有機(jī)凝膠:又稱半硬質(zhì)凝膠。如苯乙烯二乙烯苯交聯(lián)共聚物凝膠，能耐較高壓力，適用于有機(jī)溶劑作流動相，有一定可壓縮性，可填得緊密，柱效較高。但在有機(jī)溶劑中有輕度膨脹。新型凝膠色譜填料，克服了傳統(tǒng)軟填料的一些弱點(diǎn)，粒度細(xì)，機(jī)械強(qiáng)度高，分離速度快，效果好，特別是無機(jī)填料表面鍵合親水性單分子層或多層覆蓋的單糖或多糖型等填料廣泛用于生物大分子的分離。上一頁下一頁返回一、背景知識3.流動相尺寸排阻色譜流動相:從樣品的溶解性考慮，流動相應(yīng)與凝膠本身有相似哇，黍占度低，與樣品的折光率相差大;能潤濕凝膠，防止吸附作用?？捎糜诜蛛x相對分子質(zhì)量大的分子，如蛋白質(zhì)、核酸等。(七)色譜分離條件選擇1.減小柱內(nèi)展寬，提高柱效1)固定相粒度小，均勻，以減小渦流擴(kuò)散和流動相傳質(zhì)阻力;改進(jìn)結(jié)構(gòu)，盡可能采用大孔徑和淺孔道的表面多孔型載體或全多孔微粒型載體，減少滯留流動相傳質(zhì)阻力。上一頁下一頁返回一、背景知識2)流動相選用低豁度的流動相，有利于增大組分在溶劑中的擴(kuò)散系數(shù)Dm，減少傳質(zhì)阻力。3)流速如圖5-3所示，從H-u曲線可知，HPLC的最佳流速在流速很小處，減少流速有利于提高柱效，但在實(shí)踐中為加快分析速度，常采用比最佳流速高數(shù)倍的流速。4)柱溫適當(dāng)提高柱溫，可降低流動相豁度，減少傳質(zhì)阻力，但柱溫升高將使分辨率降低，柱壽命短，易產(chǎn)生氣泡，一般在室溫下進(jìn)行。上一頁下一頁返回一、背景知識2.柱外展寬柱外譜帶展寬又稱“柱外效應(yīng)”，系指從進(jìn)樣點(diǎn)到檢測池之間除柱子本身以外的所有死體積所引起的色譜峰展寬，使柱效下降。1)柱前展寬柱前展寬主要由進(jìn)樣引起。減小進(jìn)樣器的死體積，用閥門進(jìn)樣可減少柱前譜帶展寬，提高柱效。2)柱后展寬柱后展寬主要由接管、檢測器流通池體積及檢測器響應(yīng)時間等因素所引起。因此，盡可能用短而內(nèi)徑細(xì)的接管，減少流通池體積，改進(jìn)檢測器和記錄系統(tǒng)的響應(yīng)速度等都是克服柱后展寬的途徑。上一頁下一頁返回一、背景知識(八)高效液相色譜法的應(yīng)用高效液相色譜法的應(yīng)用遠(yuǎn)遠(yuǎn)廣于氣相色譜法。它廣泛用于合成化學(xué)、石油化學(xué)、生命科學(xué)、臨床化學(xué)、藥物研究、環(huán)境監(jiān)測、食品檢驗(yàn)及法學(xué)檢驗(yàn)等領(lǐng)域。1.在食品分析中的應(yīng)用(1)食品營養(yǎng)成分分析。蛋白質(zhì)、氨基酸、糖類、色素、維生素、香料、有機(jī)酸(鄰苯二甲酸、檸檬酸、蘋果酸等)、有機(jī)胺、礦物質(zhì)等。(2)食品添加劑分析。甜味劑、防腐劑、著色劑(合成色素如檸檬黃、覺菜紅、靛藍(lán)、胭脂紅、日落黃、亮藍(lán)等)、抗氧化劑等。上一頁下一頁返回一、背景知識(3)食品污染物分析。霉菌毒素(黃曲霉毒素、黃桿菌毒素、大腸桿菌毒素等)、微量元素、多環(huán)芳烴等。2.在環(huán)境分析中的應(yīng)用多環(huán)芳烴(特別是稠環(huán)芳烴)、農(nóng)藥(如氨基甲酸醋類，反相色譜)殘留等。3.在生命科學(xué)中的應(yīng)用HPLC技術(shù)目前已成為生物化學(xué)家和醫(yī)學(xué)家在分子水平上研究生命科學(xué)、遺傳工程、臨床化學(xué)、分子生物學(xué)等必不可少的工具。其在生化領(lǐng)域的應(yīng)用主要集中于以下兩個方面。上一頁下一頁返回一、背景知識(1)低分子量物質(zhì)。如氨基酸、有機(jī)酸、有機(jī)胺、類固醇、葉琳、糖類、維生素等的分離和測定。(2)高分子量物質(zhì)。如多膚、核糖核酸、蛋白質(zhì)和酶(各種胰島素、激素細(xì)胞色素、干擾素等)的純化、分離和測定。4.在醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)中的應(yīng)用體液中代謝物測定;藥代動力學(xué)研究;臨床藥物監(jiān)測。(1)合成藥物?？股?、抗憂郁藥物(冬眠靈、氯丙咪嗓、安定、利眠寧苯巴比妥等)、磺胺類藥等。(2)天然藥物生物堿(p5}噪堿、顛茄堿、鴉片堿、強(qiáng)心貳)等。上一頁下一頁返回一、背景知識5.在無機(jī)分析中的應(yīng)用陰、陽離子的分析等。(九)高效液相色譜儀的使用及維護(hù)1.儀器安裝條件與注意事項(xiàng)(1)安裝儀器的實(shí)驗(yàn)臺應(yīng)水平、穩(wěn)固、并具有足夠的放置空間。避免在具有腐蝕性氣體、大量灰塵或能產(chǎn)生強(qiáng)磁場的地方安裝本儀器，否則將會影響儀器的正常運(yùn)轉(zhuǎn)及縮短儀器的使用壽命。(2)由于儀器所用溶劑是易燃并且有毒，故安裝設(shè)備的房間應(yīng)通風(fēng)良好，應(yīng)具有向外排風(fēng)的裝置，否則可能引起中毒或身體不適，也可能會引起火災(zāi)。上一頁下一頁返回一、背景知識(3)應(yīng)安裝四個以上三芯電源插座(220V,5~10A)，必須具有專門的接地線(注意，絕不能將電源線的中線作為接地線)，并確保輸出電源的電壓穩(wěn)定，否則會導(dǎo)致儀器的不正常運(yùn)作。(4)如果實(shí)驗(yàn)室電壓不穩(wěn)定，應(yīng)使用穩(wěn)壓器等必要設(shè)備，使電源電壓穩(wěn)定。(5)實(shí)驗(yàn)室的室溫應(yīng)控制在15℃~30℃范圍內(nèi)，并且波動要小;濕度在45%~80%范圍內(nèi)。(6)由空調(diào)或其他設(shè)備產(chǎn)生的氣流不要直吹儀器，避免光線直射及振動。(7)儀器的啟動順序:先開高壓恒流泵和紫外檢測器，待紫外檢測器自檢完畢，回到默認(rèn)波長254nm后，再開計(jì)算機(jī)及打開工作站軟件。上一頁下一頁返回一、背景知識(8)儀器關(guān)閉順序:先按泵停止，關(guān)閉氛燈，退出工作站軟件，然后再關(guān)儀器。(9)儀器應(yīng)由專人負(fù)責(zé)，如果使用人員不固定，請準(zhǔn)備《儀器使用登記本》，以明確使用情況，及時處理和保養(yǎng)。2.流動相使用的注意事項(xiàng)(1)必須使用HPLC級或相當(dāng)于該級別的流動相，并要先經(jīng)0.45μm薄膜過濾。(2)過濾后的流動相必須經(jīng)過充分脫氣，以除去其中溶解的氣體(如O2)如不脫氣易產(chǎn)生氣泡，增加基線噪聲，造成靈敏度下降，甚至無法分析。上一頁下一頁返回一、背景知識(3)幾種脫氣方法比較。①氦氣脫氣法。利用液體中氦氣的溶解度比空氣低，連續(xù)吹氦脫氣，效果較好，但成本高。②加熱回流法。效果較好，但操作復(fù)雜，且有毒性揮發(fā)污染。③抽真空脫氣法。易抽走有機(jī)相。④超聲脫氣法。它是一種較為常見的脫氣法。(4)如果管路中使用peek樹脂部件，請不要使用下列流動相:濃硫酸、濃硝酸、二氯乙酸、丙酮、四氫吠喃、二氯甲烷、氯仿和二甲基亞礬。(5)特別注意HPLC使用過后的系統(tǒng)清洗。上一頁下一頁返回一、背景知識含有緩沖鹽溶液的流動相的清洗方法如下。①先用100%的純水沖洗，打開排放閥，用3~5mL/min的流量，洗20分鐘左右后停泵。此舉主要是針對吸液系統(tǒng)、泵頭、進(jìn)出口單向閥等體積較大的空間的清洗。②再用95:5的甲醇/水清洗整個系統(tǒng)，關(guān)閉排放閥，用1mL/min的流量，洗30~60min后停泵。此舉主要是用水清洗整個系統(tǒng)中的鹽，用5%的甲醇主要是為了保護(hù)色譜柱。③最后用100%的甲醇清洗整個系統(tǒng)，用1mL/min的流量，洗2min左右，然后關(guān)機(jī)。如果流動相中不含鹽，則使用上述第三步清洗即可。上一頁下一頁返回一、背景知識3.流動相的更換在分析過程中，有時需要更換流動相進(jìn)行分析。一定要注意前一種使用的流動相和所更換的流動相是不是能夠相溶的。如果前一種使用的流動相和所更換的流動相不能夠相溶，那您就要特別注意了。要采用一種與這兩種需更換的流動相都能相溶的流動相進(jìn)行過濾、清洗。較為常用的過濾流動相為異丙醇，但實(shí)際操作中要看具體情況而定，原則就是采用與這兩種需更換的流動相都能相溶的流動相。一般清洗時間為30~40min，直至系統(tǒng)完全穩(wěn)定。上一頁下一頁返回一、背景知識4.管路連接的注意事項(xiàng)(1)將管子完全插入開口端，直至其與開口端的末端相碰為止。否則將產(chǎn)生死體積，引起峰展寬。(2)為了使柱外效應(yīng)減到最小，獲得理想的分析結(jié)果，盡量使用管徑細(xì)的管路作為連接。(3)管路接頭不要擰得過緊，以防破壞螺紋。5.基本操作注意事項(xiàng)(1)泵運(yùn)行前先打開排空閥，用注射器抽出流動相，觀察10s，流動相應(yīng)連續(xù)流出。不用排空閥時應(yīng)將其關(guān)閉，否則大氣壓力會使流動相從排空閥出口流出。上一頁下一頁返回一、背景知識(2)在使用儀器過程中，注意貯液瓶里的流動相是否夠用，如快用盡應(yīng)及時更換。更換流動相時務(wù)必停泵，防止吸入大量空氣，影響儀器正常運(yùn)作。(3)在啟動分析進(jìn)樣時，請快速扳動進(jìn)樣閥，否則會引起系統(tǒng)壓力突跳，影響儀器的使用壽命。(4)如對樣品分析的定性定量要求較高，應(yīng)配置柱溫箱，保持溫度恒定。(5)若流動相不是純甲醇，樣品分析結(jié)束后，必須用HPLC級甲醇對泵及進(jìn)樣閥進(jìn)行清洗，大約半小時后，待壓力重新回落并穩(wěn)定，方可關(guān)泵。(6)若流動相中含有緩沖鹽，則須根據(jù)其特殊的清洗方法進(jìn)行清洗。上一頁下一頁返回一、背景知識6.氛燈的保養(yǎng)紫外檢測器中的氛燈是有一定使用壽命的。為了節(jié)省燈的使用壽命，在暫時不使用時可在不關(guān)機(jī)的情況下，只把燈關(guān)掉(建議:最好在需要關(guān)燈4h以上才關(guān)燈，因?yàn)轭l繁的開關(guān)燈，同樣會縮短燈的使用壽命)。7.色譜柱的保養(yǎng)事項(xiàng)為了保護(hù)色譜柱，延長其使用壽命，在使用時應(yīng)采取以下幾方面措施。(1)應(yīng)在柱頭加燒結(jié)片不銹鋼濾片，需要時加保護(hù)柱，防止柱頭堵塞，影響分析效果。上一頁下一頁返回一、背景知識(2)當(dāng)流動相的pH>7時，要用大粒度同種填料作預(yù)柱。(3)溶劑的化學(xué)腐蝕性不能太強(qiáng)。(4)要避免微粒在柱頭沉降。(5)為防止高壓沖擊，泵上的壓力限制不宜太高，一般在15~20MPa為宜，在舊柱或梯度洗脫時應(yīng)稍高些，以避免因上限設(shè)置過低而造成正常使用中的中途停機(jī)。(6)色譜柱長時間不用，存放時，柱內(nèi)應(yīng)充滿溶劑(甲醇或乙睛)，兩端封死。上一頁下一頁返回一、背景知識8.手動進(jìn)樣閥的維護(hù)注意事項(xiàng)(1)在每次使用后，尤其是進(jìn)樣濃度差異比較大的樣品時要用專用工具(不是帶針頭的注射器)沖洗進(jìn)樣閥，沖洗時必須沖洗進(jìn)樣閥兩頭數(shù)次，每次數(shù)毫升。以防止無機(jī)鹽沉積和樣品微粒造成閥內(nèi)部磨損或阻塞以及樣品的交叉污染。(2)進(jìn)樣量的多少要根據(jù)定量管的環(huán)體積決定:當(dāng)樣品量較少時，進(jìn)樣體積由注射器的進(jìn)樣體積決定，但最大體積要小于環(huán)體積的1/2;當(dāng)樣品量較多時，進(jìn)樣體積由定量管的體積決定，為保證樣品完全把定量管的流動相置換干凈，需注射5~6倍的環(huán)體積。(3)要使用專用的液相注射器進(jìn)樣，絕不可用氣相注射器。(4)注射器前應(yīng)用專用的樣品過濾器。上一頁下一頁返回一、背景知識9.高壓恒流泵的維護(hù)注意事項(xiàng)泵的密封圈是最易磨損的部件，密封圈的損壞可引起系統(tǒng)的許多故障，要注意保養(yǎng)和定期更換。應(yīng)采取下列措施以延長使用壽命。(1)絕對不允許在沒有流動相或流動相還沒有進(jìn)入泵頭的情況下啟動泵而造成柱塞桿的干磨。(2)每天使用后應(yīng)將整個系統(tǒng)管路中的緩沖液體沖洗干凈，防止鹽沉積，整個管路要浸在無緩沖的溶液或有機(jī)溶劑中。長期不用也要定期開泵沖洗整個管路。上一頁下一頁返回一、背景知識(3)要用HPLC級試劑。(4)輸液管前端要用燒結(jié)不銹鋼沉子過濾流動相。要注意防止管路阻塞造成壓力過高而損壞儀器。(5)壓力下限應(yīng)設(shè)置在0.5~1MPa，以防止儲液器中的流動相被抽干或嚴(yán)重滲漏而引起柱塞的干磨，有柱后清洗功能的高壓恒流泵還要注意保持清洗液，否則將失去柱后清洗效果。10.泵的壓力不穩(wěn)定在安裝調(diào)試時以及在日常使用過程中，若出現(xiàn)壓力不穩(wěn)的現(xiàn)象，原因有以下幾點(diǎn)。上一頁下一頁返回一、背景知識(1)管路里有氣泡，建議由流動相多走些時間?；虼蜷_排空閥，用配件里的針筒多抽幾下。(2)輸入單向閥失效所致，這也是經(jīng)常遇見的。首先是如何判斷輸入單向閥失效。①判斷步驟。如果是雙泵梯度分析系統(tǒng)，故泵壓力不穩(wěn)必然是其中一臺泵壓力不穩(wěn)所致，須逐個分析?！ぴ诓婚_UV檢測器及工作站的前提下，將其中一臺泵接上蒸餾水作為流動相。上一頁下一頁返回一、背景知識.打開排空閥，用針筒抽出些流動相，確認(rèn)泵中已有該流動相，然后將針筒內(nèi)的液體排出，并重新接在排空閥上?！ぐ础霸O(shè)置”鍵直至出現(xiàn)“沖洗”字樣，選擇時，并啟動沖洗功能。·沖洗完畢后。查看針筒內(nèi)流動相體積是否為20mL(5x5=25)，若正確，則說明該泵在低壓情況下無故障;若不正確，則說明該泵中某一單向閥失效(一般為輸入單向閥)。.用同樣的方法測試另外一泵。等度洗脫只要測試一臺就可以了。②造成單向閥失效的原因。.液相色譜從成品到客戶手中有一段時間，出廠前每臺儀器都要經(jīng)過調(diào)試，一段時間內(nèi)不會造成內(nèi)部殘留流動相與寶石球粘連的情況。上一頁下一頁返回一、背景知識.流動相內(nèi)雜質(zhì)或其他原因污染了單向閥。雖然有人認(rèn)為流動相已過濾了。但長期使用后，由于液相色譜是微量分析儀器，難免會產(chǎn)生類似情況。這是液相色譜的普遍現(xiàn)象，國內(nèi)外的泵只要是被動單向閥，都會有類似現(xiàn)象發(fā)生，這并不是儀器的質(zhì)量問題，而是日常維護(hù)的一部分。③單向閥失效處理辦法。.擰下兩個單向閥(一個為進(jìn)口，另一個為出口)。.將兩個單向閥擰上清洗用四氟特殊螺帽(在儀器附件中)，放人超聲波清洗器，先用異丙醇清洗10min，再用清水清洗10min，擰上四氟特殊螺帽主要是防止清洗時單向閥被散開。上一頁下一頁返回一、背景知識

.完畢后，將兩個單向閥裝回原位即可(注意單向閥必須擰緊)。(3)若兩個泵在低壓狀態(tài)下流量都正確，則建議分別將兩泵連接上色譜柱進(jìn)行高壓測試。高壓測試具體操作方法如下:.在雙泵分析系統(tǒng)連接的前提下，只須先打開其中一泵(確認(rèn)接好流動相)。.設(shè)置流量為1mL/min.啟動泵。上一頁下一頁返回一、背景知識·觀察運(yùn)行期間，泵的壓力是否穩(wěn)定。若穩(wěn)定，說明泵無問題;若泵壓力不穩(wěn)，則應(yīng)檢查各管路接頭有無泄露，并將有泄露的接頭擰緊。若無泄露，則問題可能還是出在單向閥上，須再次沖洗單向閥，反復(fù)實(shí)驗(yàn)。(注:不必打開UV檢測器及工作站).重復(fù)上述步驟，對另一臺泵進(jìn)行高壓測試。如還出現(xiàn)壓力不穩(wěn)的情況，有可能密封圈受損，建議更換。11.紫外檢測器的維護(hù)注意事項(xiàng)(1)要保持檢測器中的流通池清潔，每天用后注意沖洗整個管路。(2)要定期用強(qiáng)溶劑反向沖洗流通池(斷開柱)。(3)流動相要脫氣，防止氣泡滯留在流通池內(nèi)，影響分析效果。(4)注意氘燈的保養(yǎng)，及時更換。上一頁返回二、項(xiàng)目化教學(xué)參考方案(一)任務(wù)引入1.藥物分析藥物分析是藥學(xué)中的一門分支學(xué)科，它是藥學(xué)和分析科學(xué)的交叉學(xué)科，其內(nèi)容包括藥物(原料、制劑、制藥原料及中間體等)的檢驗(yàn)、藥物穩(wěn)定性、藥物臨床監(jiān)測以及中草藥(動物、植物、礦物類)檢定等諸多方面的有關(guān)定性定量分析工作。其目的是確保藥物的質(zhì)量，保證病人用藥的安全有效。此外，像毒物分析、運(yùn)動員的興奮劑檢測、成瘤藥物檢查等也屬于藥物分析的范疇。藥物分析使用化學(xué)、物理、生物、數(shù)學(xué)、計(jì)算機(jī)及自動化等許多學(xué)科的手段，并隨著這些學(xué)科的發(fā)展而發(fā)展。在這些學(xué)科中，與藥物分析關(guān)系最密切的還是化學(xué)，尤其是分析化學(xué)的手段在藥物的研究與開發(fā)中應(yīng)用得最為廣泛。下一頁返回二、項(xiàng)目化教學(xué)參考方案1)藥典與分析方法為保證藥品的質(zhì)量，很多國家都有自己的國家藥典，它是記載藥品標(biāo)準(zhǔn)和規(guī)格的國家法典。它是國家管理藥品生產(chǎn)、供應(yīng)、使用與檢驗(yàn)的依據(jù)，通常都由專門的藥典委員會組織編寫，由政府頒布施行。凡藥典收載的藥品，其質(zhì)量在出廠前均需經(jīng)過檢驗(yàn)，并符合藥典規(guī)定的標(biāo)準(zhǔn)和要求，否則不得出廠、銷售和使用。藥典中對每一個藥品及其制劑都單獨(dú)列為一個項(xiàng)目，內(nèi)容包括:(1)性狀。記載該藥品的各種物理化學(xué)性質(zhì)。一般包括外觀、比重、折光率、紫外吸收系數(shù)等。這些都是藥品的特性，決定是否為該供試品。上一頁下一頁返回二、項(xiàng)目化教學(xué)參考方案(2)鑒別。包括色澤、溶解度、晶型、熔點(diǎn)等，根據(jù)這些性質(zhì)可以幫助初步判斷。有時可結(jié)合紫外吸收與紅外光譜，幫助鑒別供試品是否與品名相符。(3)檢查。指雜質(zhì)的檢查，需要檢查的雜質(zhì)項(xiàng)目，主要是根據(jù)生產(chǎn)該藥品所用的原料、制備方法、貯存容器與貯存過程可能發(fā)生的變化等情況?？紤]可能存在的雜質(zhì)，再聯(lián)系這些雜質(zhì)的毒性，經(jīng)綜合考慮而提出的。一般情況下，對雜質(zhì)規(guī)定有一定限量，不能超過這個限量，否則即不合格。(4)含量測定。主要確定藥品中有效成分的含量范圍，測定方法力求簡便快速，易于推廣和拿握。同時還要考慮所用儀器是否容易獲得及使用情況。我國藥典收載的常用方法也在隨著學(xué)科的發(fā)展而不斷有所增加與改進(jìn)。上一頁下一頁返回二、項(xiàng)目化教學(xué)參考方案2)藥物分析方法前面已經(jīng)提到一些藥物分析中常用的方法，藥典中使用的方法目前多趨向于色譜法，尤以高效液相色譜為普遍。當(dāng)然，分析化學(xué)中常用的分析方法仍都有應(yīng)用，如基于化學(xué)反應(yīng)的重量法和各種容量法;基于光學(xué)或譜學(xué)的紫外(UV)、可見(Vis)、紅外(IR)、熒光、拉曼、核磁共振、各種計(jì)算分光光度法等;基于電化學(xué)的各種極譜法、伏安法、庫侖法、離子選擇電極及各種傳感器。利用電流和電位的各種滴定方法等。上一頁下一頁返回二、項(xiàng)目化教學(xué)參考方案3)展望藥物分析涉及的面很廣，其對象更為多種多樣，包括合成藥物、生