食品衛(wèi)生檢驗方法及應用7

第四章紫外吸收光譜分析法

利用溶液中分子吸收紫外和可見光產(chǎn)生電子躍遷所記錄的吸收光譜圖，可進行化合物結構分析，根據(jù)最大吸收波長強度變化可進行定量分析。特點

靈敏度高，適用于微量組分的測定，一般測定下限可達10-4％～10-5％。準確度高，其相對誤差可達2％～5％，如分光光度法，若使用精密儀器，誤差可降至1％～2％，完全能滿足微量組分的測定要求。應用廣泛，幾乎所有的無機物質和許多有機化合物都可直接或間接地用吸光光度法進行測定。此外該法還可用來研究化學反應的機理以及溶液化學平衡等理論。儀器設備簡單，操作簡便，快速。第一節(jié)基本原理

一、紫外吸收光譜的產(chǎn)生紫外吸收光譜：分子價電子能級躍遷。波長范圍：100-800nm.(1)遠紫外光區(qū):

100-200nm(2)近紫外光區(qū):200-400nm(3)可見光區(qū):400-800nm250300350400nm1234eλ

可用于結構鑒定和定量分析。電子躍遷的同時，伴隨著振動轉動能級的躍遷;帶狀光譜。一、分子吸收光譜的產(chǎn)生1.分子的能級及運動狀態(tài)在分子中存在著電子的運動，以及組成分子的各原子間的振動和分子作為整體的轉動。分子的總能量可以認為等于這三種運動能量之和。即：E分子=E電子+E振動+E轉動如果用△E電子，△E振動以及△E轉動表示各能級差，則：

△E電子＞△E振動＞△E轉動分子中的這三種運動狀態(tài)都對應有一定的能級。即在分子中存在著電子能級、振動能級和轉動能級。這三種能級都是量子化的。其中電子能級的間距最大（每個能級間的能量差叫間距或能級差），振動能級次之，轉動能級的間距最小。由于組成分子能量的幾部分都具有一定的能級，所以分子也具有一定的能級，如圖是雙原子分子的能級圖。由圖可見，在每一個電子能級上有許多間距較小的振動能級，在每一個振動能級上又有許多間距更小的轉動能級。由于這個原因，處在同一電子能級的分子，可能因振動能量不同而處于不同的能級上。同理，處于同一電子能級和同一振動能級上的分子，由于轉動能量不同而處于不同的能級上。能級躍遷電子能級間躍遷的同時，總伴隨有振動和轉動能級間的躍遷。即電子光譜中總包含有振動能級和轉動能級間躍遷產(chǎn)生的若干譜線而呈現(xiàn)寬譜帶。2.物質對光的選擇性吸收及吸收曲線M+熱M+熒光或磷光E=E2-

E1=h量子化；選擇性吸收吸收曲線與最大吸收波長

max

用不同波長的單色光照射，測吸光度;M+

h

→M*基態(tài)激發(fā)態(tài)E1

（△E）E23.電子躍遷與分子吸收光譜物質分子內部三種運動形式：（1）電子相對于原子核的運動；（2）原子核在其平衡位置附近的相對振動；（3）分子本身繞其重心的轉動。分子具有三種不同能級：電子能級、振動能級和轉動能級三種能級都是量子化的，且各自具有相應的能量。分子的內能：電子能量Ee、振動能量Ev、轉動能量Er

即:E＝Ee+Ev+Er

ΔΕe>ΔΕv>ΔΕr討論：（1）

轉動能級間的能量差ΔΕr：0.005～0.050eV，躍遷產(chǎn)生吸收光譜位于遠紅外區(qū)。遠紅外光譜或分子轉動光譜；（2）振動能級的能量差ΔΕv約為：0.05～１eV，躍遷產(chǎn)生的吸收光譜位于紅外區(qū)，紅外光譜或分子振動光譜；（3）電子能級的能量差ΔΕe較大1～20eV。電子躍遷產(chǎn)生的吸收光譜在紫外—可見光區(qū)，紫外—可見光譜或分子的電子光譜；討論：

（4）吸收光譜的波長分布是由產(chǎn)生譜帶的躍遷能級間的能量差所決定，反映了分子內部能級分布狀況，是物質定性的依據(jù)；（5）吸收譜帶的強度與分子偶極矩變化、躍遷幾率有關，也提供分子結構的信息。通常將在最大吸收波長處測得的摩爾吸光系數(shù)εmax也作為定性的依據(jù)。不同物質的λmax有時可能相同，但εmax不一定相同；（6）吸收譜帶強度與該物質分子吸收的光子數(shù)成正比，定量分析的依據(jù)。二、有機物吸收光譜與電子躍遷

1．紫外—可見吸收光譜有機化合物的紫外—可見吸收光譜是三種電子躍遷的結果：σ電子、π電子、n電子。分子軌道理論：成鍵軌道—反鍵軌道。當外層電子吸收紫外或可見輻射后，就從基態(tài)向激發(fā)態(tài)(反鍵軌道)躍遷。主要有四種躍遷所需能量ΔΕ大小順序為：n→π＊

<π→π＊

<n→σ＊

<σ→σ＊

sp

*s*RKE,BnpECOHnpsH可見光在以上幾種躍遷中，只有-*和n-*兩種躍遷的能量小，相應波長出現(xiàn)在近紫外區(qū)甚至可見光區(qū)，且對光的吸收強烈，是我們研究的重點σ→σ*

躍遷主要發(fā)生在真空紫外區(qū)。π→π*

躍遷吸收的波長較長，孤立的π→π*躍遷一般在200nm左右n→π*

躍遷一般在近紫外區(qū)（200~400nm），吸光強度較小，n→σ*躍遷吸收波長仍然在150~250nm范圍，因此在紫外區(qū)不易觀察到這類躍遷。

2.常用術語生色團是指含有π鍵的不飽和基團稱為生色團。有機物中含有n→π*

或π→π*

躍遷的基團。這兩種躍遷均要求有機物分子中含有不飽和基團。簡單的生色團由雙鍵或叁鍵體系組成，如乙烯基、羰基、亞硝基、偶氮基—N＝N—、乙炔基、腈基—C三N等。助色團是指帶有非鍵電子對的基團；可使生色團吸收峰向長波方向移動并提高吸收強度的一些官能團，常見助色團助色順序為：-F<-CH3<-Br<-OH<-OCH3<-NH2<-NHCH3<-NH(CH3)2<-NHC6H5<-O-紅移與藍移

有機化合物的吸收譜帶常常因引入取代基或改變溶劑使最大吸收波長λmax和吸收強度發(fā)生變化。紅移：λmax向長波方向移動藍移(或紫移)

：λmax向短波方向移動。增色效應或減色效應吸收強度即摩爾吸光系數(shù)ε增大或減小的現(xiàn)象。3.

σ→σ＊躍遷

所需能量最大；σ電子只有吸收遠紫外光的能量才能發(fā)生躍遷；飽和烷烴的分子吸收光譜出現(xiàn)在遠紫外區(qū)；吸收波長λ<200nm；例：甲烷的λmax為125nm,乙烷λmax為135nm。只能被真空紫外分光光度計檢測到；作為溶劑使用；sp*s*RKE,BnpE4.

n→σ＊躍遷

所需能量較大。

吸收波長為150～250nm，大部分在遠紫外區(qū)，近紫外區(qū)仍不易觀察到。含非鍵電子的飽和烴衍生物(含N、O、S和鹵素等雜原子)均呈現(xiàn)n→σ*躍遷。sp*s*RKE,Bnp5π→π＊躍遷

所需能量較小，吸收波長處于遠紫外區(qū)的近紫外端或近紫外區(qū)，εmax一般在104L/（mol·cm）以上，屬于強吸收。

（1）不飽和烴π→π*躍遷乙烯π→π*躍遷的λmax為171nm，

C=C發(fā)色基團，但

→

*200nm。助色基團取代

（K帶)發(fā)生紅移。（2）共軛烯烴中的→*K帶——共軛非封閉體系的π→π*躍遷特點：吸收強度大，εmax為:1×104L/mol·cm，λmax在217~280nm判斷共軛體系的存在的依據(jù)

K的吸收帶的λ與εmax與共軛體系的數(shù)目、位置、取代基有關。共軛雙鍵愈多，深色移動愈顯著，甚至產(chǎn)生顏色。如二甲基十二碳六烯（黃色）（3）羰基化合物共軛烯烴中的→*Y=H,Rn→*

180-190nm

→

*

150-160nm

n→*

275-295nmY=-NH2,-OH,-OR等助色基團K帶紅移，R帶蘭移；R帶max=205nm

；10-100K

K

R

R

n

n

165nm

n

③不飽和醛酮K帶紅移：165250nmR

帶蘭移：290310nm

產(chǎn)生R帶（4）芳香烴及其雜環(huán)化合物

苯：185、204nmE1帶180184nm；

=47000E2帶200204nm=7000

苯環(huán)上三個共扼雙鍵的→*躍遷特征吸收帶；B帶：精細結構

230-270nm=200

→

*躍遷與苯環(huán)振動引起含取代基時，B帶簡化，紅移。

max（nm）

max苯254200甲苯261300間二甲苯2633001，3，5-三甲苯266305六甲苯272300乙酰苯（正庚烷為溶劑）紫外光譜圖羰基雙鍵與苯環(huán)共扼：K帶強；苯的E2帶與K帶合并，紅移；取代基使B帶簡化；氧上的孤對電子：R帶，躍遷禁阻，弱；CCH3On→p*

;

R帶p

→p*

;

K帶苯環(huán)上助色基團對吸收帶的影響苯環(huán)上發(fā)色基團對吸收帶的影響5.立體結構和互變結構的影響順反異構：

順式：λmax=280nm；εmax=10500反式：λmax=295.5nm；εmax=29000互變異構：

酮式：λmax=204nm

烯醇式：λmax=243nm

立體結構和互變結構的影響6.溶劑的影響極性溶劑對溶質吸收峰的波長、強度和形狀都產(chǎn)生影響。溶劑和溶質之間常形成氫鍵，或溶劑的偶極使溶質的極性增強，引起-*和n-*吸收帶的遷移。由于溶劑對電子光譜圖影響很大，因此，在吸收光譜圖上或數(shù)據(jù)表中必須注明所用的溶劑。與已知化合物紫外光譜作對照時也應注明所用的溶劑是否相同。在進行紫外光譜法分析時，必須正確選擇溶劑。6.溶劑的影響非極性極性n

np

n<p

n

p

非極性極性n>pn

→

*躍遷：蘭移；；

→*躍遷：紅移；；

max(正己烷)max(氯仿)max(甲醇)max(水)230238237243n3293153093056、溶劑的影響1：乙醚2：水12250300苯酰丙酮非極性→極性n

→

*躍遷：蘭移；；

→*躍遷：紅移；；極性溶劑使精細結構消失；B帶在非極性溶劑清晰，在極性溶劑若，甚至消失而出現(xiàn)寬峰。7．吸收曲線（吸收光譜）及最大吸收波長（1）吸收曲線：每一種物質對不同波長光的吸收程度是不同的。如果我們讓各種不同波長的光分別通過被測物質，分別測定物質對不同波長光的吸收程度。以波長為橫坐標，吸收程度為縱坐標作圖所得曲線。

吸收曲線可以提供物質的結構信息，并作為物質定性分析的依據(jù)之一。

例：丙酮

max=279nm(=15)

nm300400500600700/nm350525545Cr2O72-MnO4-1.00.80.60.40.2Absorbance350Cr2O72-、MnO4-的吸收光譜吸收曲線表明了某種物質對不同波長光的吸收能力分布。曲線上的各個峰叫吸收峰。峰越高，表示物質對相應波長的光的吸收程度越大。其中最高的那個峰叫最大吸收峰，它的最高點所對應的波長叫最大吸收波長，用λmax表示。（2）吸收峰和最大吸收波長max

不同的物質，吸收曲線的形狀不同，最大吸收波長不同。同一種物質對不同波長光的吸光度不同。對同一物質，其濃度不同時，吸收曲線形狀和最大吸收波長不變，只是吸收程度要發(fā)生變化，表現(xiàn)在曲線上就是曲線的高低發(fā)生變化不同濃度的同一種物質，在某一定波長下吸光度A有差異，在λmax處吸光度A的差異最大。此特性可作作為物質定量分析的依據(jù)。在λmax處吸光度隨濃度變化的幅度最大，所以測定最靈敏。吸收曲線是定量分析中選擇入射光波長的重要依據(jù)。（3）物質的吸收曲線和最大吸收波長的特點三、光的選擇性吸收與物質顏色的關系1．可見光的顏色和互補色：在可見光范圍內，不同波長的光的顏色是不同的。平常所見的白光（日光、白熾燈光等）是一種復合光，它是由各種顏色的光按一定比例混合而得的。利用棱鏡等分光器可將它分解成紅、橙、黃、綠、青、藍、紫等不同顏色的單色光。白光

白光除了可由所有波長的可見光復合得到外，還可由適當?shù)膬煞N顏色的光按一定比例復合得到。能復合成白光的兩種顏色的光叫互補色光。/nm顏色互補光400-450紫黃綠450-480藍黃480-490綠藍橙490-500藍綠紅500-560綠紅紫560-580黃綠紫580-610黃藍610-650橙綠藍650-760紅藍綠

當白光照射到物質上時，如果物質對白光中某種顏色的光產(chǎn)生了選擇性的吸收，則物質就會顯示出一定的顏色。物質所顯示的顏色是吸收光的互補色。2．物質的顏色與吸收光的關系完全吸收完全透過吸收黃色光光譜示意表觀現(xiàn)象示意復合光物質顏色吸收光物質顏色吸收光顏色波長范圍（nm）顏色波長范圍(nm)黃綠紫400～450紫黃綠560～580黃藍450～480藍黃580～600橙綠藍480～490綠藍橙600～650紅藍綠490～500藍綠紅650～760紫紅綠500～560

當強度為I0的一定波長的單色入射光束通過裝有均勻待測物的溶液介質時，該光束將被部分吸收I3，部分反射I2

，余下的則通過待測物的溶液I1

，即有：I0=I1+I2+I3如果吸收介質是溶液（測定中一般是溶液），式中反射光強度主要與器皿的性質及溶液的性質有關，在相同的測定條件下，這些因素是固定不變的，并且反射光強度一般很小。所以可忽略不記，這樣：I0=I1+I3四、光吸收定律

Lamber-Beer定律透光率——透光率表示透過光強度與入射光強度的比值，用T來表示，計算式為：T=I1/I0T常用百分比（T%）表示。吸光度——透光率的倒數(shù)的對數(shù)叫吸光度。用A表示：A=-lgT1.吸收光和透過光當用一束強度為I0的單色光垂直通過厚度為b、吸光物質濃度為c的溶液時，溶液的吸光度正比于溶液的厚度b和溶液中吸光物質的濃度c的乘積。數(shù)學表達式為：

A=-lgT=kbc2、定律內容k比例常數(shù)叫“消光系數(shù)”，它的大小可表示出吸光物質對某波長光的吸收程度。它與吸光物質的性質、入射光的波長及溫度等因素有關?！庀禂?shù)，物理意義：吸光物質在單位濃度、單位厚度的吸光度。在標準曲線是斜率。某種有色溶液對于一定波長的入射光，具有一定數(shù)值。k的值隨著b和c的單位不同而不同。下面就介紹k的幾種不同的表示方法。(1)比例常數(shù)k的幾種表示方法當溶液濃度c的單位為g/L,溶液液層厚度b的單位為cm時，K叫“消光系數(shù)”，用α表示，其單位為L/g·cm，此時：A=αbc由式可知：α=A/bc，它表示的是當c=1g/L、b=1cm時溶液的吸光度。消光系數(shù)當溶液濃度c的單位為mol/L，液層厚度b的單位為cm時，K叫“摩爾吸光系數(shù)”，用λ表示，其單位為L/mol·cm，此時：A=λbc由此式可知：λ=A/bc，它表示的是當c=1mol/L，b=1cm時，物質對波長為λ的光的吸光度。對于K的這兩種表示方法，它們之間的關系為：λ=αM

M為吸光物質的分子量λ摩爾消光系數(shù)ελ和α的大小都可以反映出吸光物質對波長為λ的單色光的吸收能力。但更常用和更好的是用ελ來表示吸光物質對波長為λ的光的吸收能力。摩爾吸光系數(shù)越大，表示物質對波長為λ的光的吸收能力越強，同時在分光光度法中測定的靈敏度也越大。必須是使用單色光為入射光；溶液為稀溶液：一般c＜0.01mol吸收定律能夠用于彼此不相互作用的多組分溶液。它們的吸光度具有加合性，且對每一組分分別適用，即：

A總=A1+A2+A3…+An=ε1bc1+ε2bc2+ε3bc3…+εnbcn吸收定律對紫外光譜、可見光譜、紅外光譜都適用。3.吸收定律的適用條件：例題：已知某化合物的相對分子量為251，將此化合物用已醇作溶劑配成濃度為0.150mmol/L溶液，在480nm處用2.00cm吸收池測得透光率為39.8%，求該化合物在上述條件下的摩爾吸光系數(shù)和吸光系數(shù)。解：由Lambert-Beer定律得：ε480=A/cb=-lg0.398/（0.150×10-3×2.00）=1.33×103(L/（mol·cm)由ε480=αM,得:a=ε480/M=ε480/251=5.30L/（g·cm)4.實際溶液對吸收定律的偏離及原因：4.1偏離：被測物質濃度與吸光度不成線性關系的現(xiàn)象，如下圖。AC4.2.1入射光為非單色光：嚴格地說吸收定律只適用于入射光為單色光的情況。但在紫外可見光分光光度法中，入射光是由連續(xù)光源經(jīng)分光器分光后得到的，這樣得到的入射光并不是真正的單色光，而是一個有限波長寬度的復合光，這就可能造成對吸收定律的偏離。對非單色光引起的偏離，其原因是由于同一物質對不同波長的光的摩爾吸光系數(shù)不同造成的。所以只要在入射光的波長范圍內，摩爾吸光系數(shù)差別不是太大，由此引起的偏離是較小的。4.2原因當入射光是非平行光時，所有光通過介質的光的光程不同，引起小的偏離。另外，當溶液中含有懸浮物或膠粒等散射質點時，入射光通過溶液時就會有一部分光因散射而損失掉，使透過光強度減小，測得的吸光度增大，從而引起偏離吸收定律。4.2.2非平行光和光的散射離解作用：在可見光區(qū)域的分析中常常是將待測組分同某種試劑反應生成有色配合物來進行測定的。有色配合物在水中不可避免的要發(fā)生離解，從而使得有色配合物的濃度要小于待測組分的濃度，導致對吸收定律的偏離。特別是在稀溶液中時，更是如此。4.2.3化學因素引起的偏離

離解作用、酸效應、溶劑作用：酸效應：如果待測組分包括在一種酸堿平衡體系中，溶液的酸度將會使得待測組分的存在形式發(fā)生變化，而導致對吸收定律的偏離。溶劑作用：溶劑對吸收光譜的影響是比較大的，溶劑不同時，物質的吸收光譜不同。五、顯色反應及其影響因素1.顯色反應和顯色劑：1.1顯色反應：在光度分析中將試樣中的待測組分轉變成有色化合物的反應叫顯色反應。分類：配位反應和氧化還原反應。Fe3＋＋SCN－=FeSCN－；Mn2＋－5e＋4H2O=MnO4－＋8H＋在這兩類反應中，用得較多的是配位反應。1.2顯色劑：與待測組分生成有色化合物的試劑叫顯色劑（1）無機顯色劑（2）有機顯色劑優(yōu)點：具有鮮明的顏色，ε都很大（一般可達到104以上），所以測定的靈敏度很高；生成的一般為螯合物，穩(wěn)定性很好，一般離解常數(shù)都很?。贿x擇性好有些有色配合物易溶于有機溶劑，可進行萃取光度分析，提高了測定的靈敏度和選擇性。1.3常見的有機顯色劑：磺基水楊酸：它可用于測定三價鐵離子。鄰二氮菲（鄰菲羅啉，1，10—二氮菲）：直接在PH=3～9時與Fe2+生成紅色螯合物。用于鐵的測定。雙硫腙：也叫二苯—硫腙。測定很多重金屬離子，如：鉛、鋅、銅、銀、汞、鎘等。偶氮胂Ⅲ（鈾試劑Ⅲ）：可用于測定鈾、釷、鋯等。2.選擇顯色反應的標準選擇性要好；靈敏度要高；有色化合物的組成要恒定，化學性質穩(wěn)定；顯色劑的顏色與有色化合物的顏色差別要大；反應的條件要易于控制。3.影響顯色反應的因素：3.1顯色劑用量：顯色反應就是將待測組分轉變成有色化合物的反應，其反應一般可用下式代表：M＋R=MR反應具有一定的可逆性，當加入R的用量時，有利于反應向右進行。注意，加入的顯色劑用量也不能太多，否則產(chǎn)生副反應，對測定產(chǎn)生不利。例如：用SCN-與Fe3+反應生成紅色配合物測定鐵時，當加入的顯色劑太多時，就會對測定產(chǎn)生不利。選擇顯色劑的用量方法對于不同的情況，顯色劑的用量對顯色反應的影響是不同的。在實際選用時，一般是通過實驗來確定的。實驗的方法為：固定待測組分的濃度和其它條件，分別加入不同量的顯色劑，分別測定它們的吸光度，以吸光度為縱坐標，顯色劑用量為橫坐標作圖，可得到吸光