第五章大腸桿菌基因工程

1大腸桿菌作為表達(dá)外源基因受體菌的特征大腸桿菌表達(dá)外源基因的優(yōu)勢(shì)全基因組測(cè)序，共有4405個(gè)開放型閱讀框架基因克隆表達(dá)系統(tǒng)成熟完善繁殖迅速、培養(yǎng)簡(jiǎn)單、操作方便、遺傳穩(wěn)定被美國FDA批準(zhǔn)為安全的基因工程受體生物當(dāng)前第1頁\共有84頁\編于星期五\22點(diǎn)1大腸桿菌作為表達(dá)外源基因受體菌的特征大腸桿菌表達(dá)外源基因的劣勢(shì)缺乏對(duì)真核生物蛋白質(zhì)的復(fù)性功能缺乏對(duì)真核生物蛋白質(zhì)的修飾加工系統(tǒng)內(nèi)源性蛋白酶降解空間構(gòu)象不正確的異源蛋白細(xì)胞周質(zhì)內(nèi)含有種類繁多的內(nèi)毒素當(dāng)前第2頁\共有84頁\編于星期五\22點(diǎn)2外源基因在大腸桿菌中高效表達(dá)的原理啟動(dòng)子終止子核糖體結(jié)合位點(diǎn)密碼子質(zhì)?？截悢?shù)當(dāng)前第3頁\共有84頁\編于星期五\22點(diǎn)啟動(dòng)子啟動(dòng)子最佳距離的探測(cè)目的基因EEAEE啟動(dòng)子A酶切開Bal31酶解目的基因當(dāng)前第4頁\共有84頁\編于星期五\22點(diǎn)啟動(dòng)子啟動(dòng)子的篩選AprorigalKpKO1終止密碼子采用鳥槍法戰(zhàn)略，將合適大小的DNA片段克隆到啟動(dòng)子探針質(zhì)粒pKO1上受體細(xì)胞染色體DNA上的galE、galT與質(zhì)粒上報(bào)告基因galk的表達(dá)產(chǎn)物聯(lián)合作用，可將培養(yǎng)基中的半乳糖酵解成紅色素物質(zhì)轉(zhuǎn)化galE+、galT+、galK-的大腸桿菌受體菌株含有外源啟動(dòng)子活性的重組克隆當(dāng)前第5頁\共有84頁\編于星期五\22點(diǎn)啟動(dòng)子啟動(dòng)子的構(gòu)建-35區(qū)序列-10區(qū)序列PlLPrecAPtrpPlacPtraAPtac啟動(dòng)子TTGACAGATACTTTGATATATAATTTGACATTAACTTAGACATAATGTTTTACATATAATTTGACATATAATPtac

=

3

Ptrp

=

11

Plac當(dāng)前第6頁\共有84頁\編于星期五\22點(diǎn)啟動(dòng)子啟動(dòng)子的可控性P乳糖啟動(dòng)子Plac的可控性：OPO高效轉(zhuǎn)錄阻遏蛋白誘導(dǎo)乳糖異丙基-b-D-硫代半乳糖苷（IPTG）野生型的Plac與其控制區(qū)Olac偶聯(lián)在一起，在沒有誘導(dǎo)物存在時(shí)，整個(gè)操縱子處于基基底水平轉(zhuǎn)錄底水平表達(dá)；誘導(dǎo)物可以使啟動(dòng)子Plac介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄大幅提高當(dāng)前第7頁\共有84頁\編于星期五\22點(diǎn)啟動(dòng)子啟動(dòng)子的可控性Plac乳糖啟動(dòng)子Plac的可控性：OPlacO高效轉(zhuǎn)錄葡萄糖代謝野生型的Plac上游附近擁有代謝激活因子（CAP）結(jié)合區(qū)，cAMP激活CAP，CAP基底水平轉(zhuǎn)錄結(jié)合啟動(dòng)子控制區(qū)，進(jìn)而促進(jìn)Plac介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄。葡萄糖代謝使cAMP減少，也能阻遏Plac介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄。因此，基因工程中使用的乳糖啟動(dòng)子均為抗葡萄糖代謝阻遏的突變型，即PlacUV5CAPcAMPcAMP濃度降低PlacUV5O高效轉(zhuǎn)錄當(dāng)前第8頁\共有84頁\編于星期五\22點(diǎn)啟動(dòng)子啟動(dòng)子的可控性Ptrp色氨酸啟動(dòng)子Ptrp的可控性：Otrp除去色氨酸色氨酸啟動(dòng)子Ptrp受色氨酸-阻遏蛋白復(fù)合物的阻遏，轉(zhuǎn)錄呈基底狀態(tài)。在培養(yǎng)系統(tǒng)中去除色氨酸基底水平轉(zhuǎn)錄或者加入3-吲哚丙烯酸（IAA），便可有效地解除阻遏抑制作用。在正常的細(xì)菌培養(yǎng)體系中，除去色氨酸是困難的，因此基因工程中往往添加IAA誘導(dǎo)Ptrp介導(dǎo)的目基因的表達(dá)色氨酸或加3-吲哚丙烯酸高效轉(zhuǎn)錄阻遏蛋白（IAA）OtrpPtrp高效轉(zhuǎn)錄OtrpPtrp當(dāng)前第9頁\共有84頁\編于星期五\22點(diǎn)啟動(dòng)子啟動(dòng)子的可控性l噬菌體啟動(dòng)子PlL的可控性：噬菌體啟動(dòng)子PL受CI阻遏蛋白阻遏，很難直接誘導(dǎo)控制。在基因工程中常使用溫度敏感型的cI突變基因cI857控制PL。cI857阻遏蛋在42℃時(shí)失活脫落，PL便可介導(dǎo)目的基因的表達(dá)。但在大型細(xì)菌培養(yǎng)罐中迅速升溫非常困難，因此常使用一個(gè)雙質(zhì)?？刂葡到y(tǒng)，用色氨酸間接控制目的基因表達(dá)PtrpABcI857PL目的基因阻遏作用PtrpABPL表達(dá)色氨酸當(dāng)前第10頁\共有84頁\編于星期五\22點(diǎn)終止子強(qiáng)化轉(zhuǎn)錄終止的必要性外源基因在強(qiáng)啟動(dòng)子的控制下表達(dá)，容易發(fā)生轉(zhuǎn)錄過頭現(xiàn)象，即RNA聚合酶滑過終止子結(jié)構(gòu)繼續(xù)轉(zhuǎn)錄質(zhì)粒上鄰近的DNA序列，形成長(zhǎng)短不一的mRNA混合物過長(zhǎng)轉(zhuǎn)錄物的產(chǎn)生在很大程度上會(huì)影響外源基因的表達(dá)，其原因如下：轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物越長(zhǎng)，RNA聚合酶轉(zhuǎn)錄一分子mRNA所需的時(shí)間就相應(yīng)增加，外源基因本身的轉(zhuǎn)錄效率下降；如果外源基因下游緊接有載體上的其它重要基因或DNA功能區(qū)域，如選擇性標(biāo)記基因和復(fù)制子結(jié)構(gòu)等，則RNA聚合酶在此處的轉(zhuǎn)錄可能干擾質(zhì)粒的復(fù)制及其它生物功能，甚至導(dǎo)致重組質(zhì)粒的不穩(wěn)定性；過長(zhǎng)的mRNA往往會(huì)產(chǎn)生大量無用的蛋白質(zhì)，增加工程菌無謂的能量消耗；更為嚴(yán)重的是，過長(zhǎng)的轉(zhuǎn)錄物往往不能形成理想的二級(jí)結(jié)構(gòu)，從而大大降低外源基因編碼產(chǎn)物的翻譯效率當(dāng)前第11頁\共有84頁\編于星期五\22點(diǎn)終止子強(qiáng)終止子的選擇與使用

目前外源基因表達(dá)質(zhì)粒中常用的終止子是來自大腸桿菌rRNA操縱子上的rrnT1T2以及T7噬菌體DNA上的Tf。對(duì)于一些終止作用較弱的終止子，通?？梢圆捎枚垠w終止子串聯(lián)的特殊結(jié)構(gòu)，以增強(qiáng)其轉(zhuǎn)錄終止作用終止子也可以象啟動(dòng)子那樣，通過特殊的探針質(zhì)粒從細(xì)菌或噬菌體基因組DNA中克隆篩選pCP1AproriTcr篩選Apr、Tcs的轉(zhuǎn)化子當(dāng)前第12頁\共有84頁\編于星期五\22點(diǎn)核糖體結(jié)合位點(diǎn)外源基因在大腸桿菌細(xì)胞中的高效表達(dá)不僅取決于轉(zhuǎn)錄啟動(dòng)的頻率，而且在很大程度上還與mRNA的翻譯起始效率密切相關(guān)。大腸桿菌細(xì)胞中結(jié)構(gòu)不同的mRNA分子具有不同的翻譯效率，它們之間的差別有時(shí)可高達(dá)數(shù)百倍。mRNA翻譯的起始效率主要由其5‘端的結(jié)構(gòu)序列所決定，稱為核糖體結(jié)合位點(diǎn)（RBS）當(dāng)前第13頁\共有84頁\編于星期五\22點(diǎn)核糖體結(jié)合位點(diǎn)大腸桿菌核糖體結(jié)合位點(diǎn)包括下列四個(gè)特征結(jié)構(gòu)要素：位于翻譯起始密碼子上游的6-8個(gè)核苷酸序列5’UAAGGAGG3’，即Shine-Dalgarno（SD）序列，它通過識(shí)別大腸桿菌核糖體小亞基中的16SrRNA3’端區(qū)域3’AUUCCUCC5’并與之專一性結(jié)合，將mRNA定位于核糖體上，從而啟動(dòng)翻譯；翻譯起始密碼子，大腸桿菌絕大部分基因以AUG作為閱讀框架的起始位點(diǎn)，但有些基因也使用GUG或UUG作為翻譯起始密碼子；SD序列與翻譯起始密碼子之間的距離及堿基組成；基因編碼區(qū)5’端若干密碼子的堿基序列

核糖體結(jié)合位點(diǎn)的結(jié)構(gòu)當(dāng)前第14頁\共有84頁\編于星期五\22點(diǎn)核糖體結(jié)合位點(diǎn)核糖體結(jié)合位點(diǎn)對(duì)外源基因表達(dá)的影響SD序列的影響：一般來說，mRNA與核糖體的結(jié)合程度越強(qiáng)，翻譯的起始效率就越高，而這種結(jié)合程度主要取決于SD序列與16SrRNA的堿基互補(bǔ)性，其中以GGAG四個(gè)堿基序列尤為重要。對(duì)多數(shù)基因而言，上述四個(gè)堿基中任何一個(gè)換成C或T，均會(huì)導(dǎo)致翻譯效率大幅度降低

當(dāng)前第15頁\共有84頁\編于星期五\22點(diǎn)核糖體結(jié)合位點(diǎn)核糖體結(jié)合位點(diǎn)對(duì)外源基因表達(dá)的影響SD序列與起始密碼子之間的序列的影響：

SD序列下游的堿基若為AAAA或UUUU，翻譯效率最高；而CCCC或GGGG的翻譯效率則分別是最高值的50%和25%。緊鄰AUG的前三個(gè)堿基成份對(duì)翻譯起始也有影響，對(duì)于大腸桿菌b-半乳糖苷酶的mRNA而言，在這個(gè)位置上最佳的堿基組合是UAU或CUU，如果用UUC、UCA或AGG取代之，則酶的表達(dá)水平低20倍當(dāng)前第16頁\共有84頁\編于星期五\22點(diǎn)核糖體結(jié)合位點(diǎn)核糖體結(jié)合位點(diǎn)對(duì)外源基因表達(dá)的影響SD序列與起始密碼子之間的距離的影響：

SD序列與起始密碼子之間的精確距離保證了mRNA在核糖體上定位后，翻譯起始密碼子AUG正好處于核糖體復(fù)合物結(jié)構(gòu)中的P位，這是翻譯啟動(dòng)的前提條件。在很多情況下，SD序列位于AUG之前大約七個(gè)堿基處，在此間隔中少一個(gè)堿基或多一個(gè)堿基，均會(huì)導(dǎo)致翻譯起始效率不同程度的降低當(dāng)前第17頁\共有84頁\編于星期五\22點(diǎn)核糖體結(jié)合位點(diǎn)核糖體結(jié)合位點(diǎn)對(duì)外源基因表達(dá)的影響起始密碼子及其后續(xù)若干密碼子的影響：大腸桿菌中的起始tRNA分子可以同時(shí)識(shí)別AUG、GUG和UUG三種起始密碼子，但其識(shí)別頻率并不相同，通常GUG為AUG的50%而UUG只及AUG的25%。除此之外，從AUG開始的前幾個(gè)密碼子堿基序列也至關(guān)重要，至少這一序列不能與mRNA的5’端非編碼區(qū)形成莖環(huán)結(jié)構(gòu)，否則便會(huì)嚴(yán)重干擾mRNA在核糖體上的準(zhǔn)確定位目前廣泛用于外源基因表達(dá)的大腸桿菌表達(dá)型質(zhì)粒上，均含有與啟動(dòng)子來源相同的核糖體結(jié)合位點(diǎn)序列，序列和間隔是最佳的當(dāng)前第18頁\共有84頁\編于星期五\22點(diǎn)密碼子生物體對(duì)密碼子的偏愛性不同的生物，甚至同種生物不同的蛋白質(zhì)編碼基因，對(duì)簡(jiǎn)并密碼子使用頻率并不相同，具有一定的偏愛性，其決定因素是：

生物基因組中的堿基含量在富含AT的生物（如單鏈DNA噬菌體fX174）基因組中，密碼子第三位上的U和A出現(xiàn)的頻率較高；而在GC豐富的生物（如鏈霉菌）基因組中，第三位上含有G或C的簡(jiǎn)并密碼子占90%以上的絕對(duì)優(yōu)勢(shì)密碼子與反密碼子相互作用的自由能中等強(qiáng)度規(guī)律細(xì)胞內(nèi)tRNA的含量如GGG、CCC、GCG、GGC、AAA、UUU、AUA、UAU等使用少；如GUG、CAC、UCG、AGC、ACA、UGU、AUC、UUG等使用多；當(dāng)前第19頁\共有84頁\編于星期五\22點(diǎn)密碼子密碼子偏愛性對(duì)外源基因表達(dá)的影響由于原核生物和真核生物基因組中密碼子的使用頻率具有較大程大的差異性，因此外源基因尤其是高等哺乳動(dòng)物基因在大腸桿菌中高效翻譯的一個(gè)重要因素是密碼子的正確選擇。一般而言，有兩種策略可以使外源基因上的密碼子在大腸桿菌細(xì)胞中獲得最佳表達(dá)：外源基因全合成同步表達(dá)相關(guān)tRNA編碼基因當(dāng)前第20頁\共有84頁\編于星期五\22點(diǎn)密碼子密碼子偏愛性對(duì)外源基因表達(dá)的影響按照大腸桿菌密碼子的偏愛性規(guī)律，設(shè)計(jì)更換外源基因中不適宜的相應(yīng)簡(jiǎn)并密碼子，重組人胰島素、干擾素以及生長(zhǎng)激素在大腸桿菌中的高效表達(dá)均采用了這種方法外源基因全合成當(dāng)前第21頁\共有84頁\編于星期五\22點(diǎn)密碼子密碼子偏愛性對(duì)外源基因表達(dá)的影響對(duì)于那些含有不和諧密碼子種類單一、出現(xiàn)頻率較高、而本身分子量又較大的外源基因而言，則選擇相關(guān)tRNA編碼基因同步克隆表達(dá)的策略較為有利。例如，在人尿激酶原cDNA的412個(gè)密碼子中，共含有22個(gè)精氨酸密碼子，其中7個(gè)AGG、2個(gè)AGA，而大腸桿菌受體細(xì)胞中tRNAAGG和tRNAAGA的豐度較低。為了提高人尿激酶原cDNA在大腸桿菌中的高效表達(dá)，將大腸桿菌的這兩個(gè)tRNA編碼基因克隆在另一個(gè)高表達(dá)的質(zhì)粒上。由此構(gòu)建的大腸桿菌雙質(zhì)粒系統(tǒng)有效地解除了受體細(xì)胞對(duì)外源基因高效表達(dá)的制約作用同步表達(dá)相關(guān)tRNA編碼基因當(dāng)前第22頁\共有84頁\編于星期五\22點(diǎn)質(zhì)?？截悢?shù)質(zhì)?？截悢?shù)對(duì)細(xì)菌生長(zhǎng)代謝的影響目前實(shí)驗(yàn)室里廣泛使用的表達(dá)型質(zhì)粒在每個(gè)大腸桿菌細(xì)胞中可達(dá)數(shù)百甚至上千個(gè)拷貝，質(zhì)粒的擴(kuò)增過程通常發(fā)生在受體細(xì)胞的對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期內(nèi)，而此時(shí)正是細(xì)菌生理代謝最旺盛的階段。質(zhì)粒分子的過度增殖以及其后目的基因的高效表達(dá)勢(shì)必會(huì)影響受體細(xì)胞的生長(zhǎng)代謝，進(jìn)而導(dǎo)致重組質(zhì)粒的不穩(wěn)定性以及目的基因宏觀表達(dá)水平的下降解決上述難題的一種有效策略是將重組質(zhì)粒的擴(kuò)增納入可控制的軌道當(dāng)前第23頁\共有84頁\編于星期五\22點(diǎn)質(zhì)?？截悢?shù)質(zhì)粒擴(kuò)增時(shí)序的控制pCP3擁有一個(gè)溫度可誘導(dǎo)型的復(fù)制子pCP3PLMCSoriApr在28℃時(shí)，每個(gè)細(xì)胞的質(zhì)?？截悢?shù)為60在42℃時(shí)，拷貝數(shù)迅速增至300-600在此溫度下，受體細(xì)胞染色體上的CI基因表達(dá)的溫度敏感型阻遏蛋白失活因此，用一種手段同時(shí)控制質(zhì)?？截悢?shù)和基因的表達(dá)當(dāng)前第24頁\共有84頁\編于星期五\22點(diǎn)3大腸桿菌基因工程菌的構(gòu)建策略包涵體型異源蛋白的表達(dá)分泌型異源蛋白的表達(dá)融合型異源蛋白的表達(dá)寡聚型異源蛋白的表達(dá)整合型異源蛋白的表達(dá)蛋白酶抗性或缺陷型表達(dá)系統(tǒng)的構(gòu)建當(dāng)前第25頁\共有84頁\編于星期五\22點(diǎn)包涵體型異源蛋白的表達(dá)包涵體及其性質(zhì)在某些生長(zhǎng)條件下，大腸桿菌能積累某種特殊的生物大分子，它們致密地集聚在細(xì)胞內(nèi)，或被膜包裹或形成無膜裸露結(jié)構(gòu)，這種水不溶性的結(jié)構(gòu)稱為包涵體（InclusionBodies，IB）。富含蛋白質(zhì)的包涵體多見于生長(zhǎng)在含有氨基酸類似物培養(yǎng)基的大腸桿菌細(xì)胞中，由這些氨基酸類似物所合成的蛋白質(zhì)往往會(huì)喪失其理化特性和生物功能，從而集聚形成包涵體。由高效表達(dá)質(zhì)粒構(gòu)建的大腸桿菌工程菌大量合成非天然性的同源或異源蛋白質(zhì)，后者在一般情況下也以包涵體的形式存在于細(xì)菌細(xì)胞內(nèi)。除此之外，包涵體中還含有少量的DNA、RNA和脂多糖等非蛋白分子當(dāng)前第26頁\共有84頁\編于星期五\22點(diǎn)包涵體型異源蛋白的表達(dá)以包涵體形式表達(dá)目的蛋白的優(yōu)缺點(diǎn)能簡(jiǎn)化外源基因表達(dá)產(chǎn)物的分離操作

包涵體表達(dá)形式的優(yōu)點(diǎn)：包涵體的水難溶性及其密度遠(yuǎn)大于其它細(xì)胞碎片和細(xì)胞成分，菌體經(jīng)超聲波裂解后，直接通過高速離心即可將重組異源蛋白從細(xì)菌裂解物中分離出來能在一定程度上保持表達(dá)產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定

在形成包涵體之后，大腸桿菌的蛋白酶降解作用基本上對(duì)異源重組蛋白的穩(wěn)定性已構(gòu)不成威脅當(dāng)前第27頁\共有84頁\編于星期五\22點(diǎn)包涵體型異源蛋白的表達(dá)以包涵體形式表達(dá)目的蛋白的優(yōu)缺點(diǎn)包涵體表達(dá)形式的缺點(diǎn)：以包涵體形式表達(dá)的重組蛋白喪失了原有的生物活性，必須通過有效的變性復(fù)性操作，才能回收得到具有正確空間構(gòu)象（因而具有生物活性）的目標(biāo)蛋白，因此包涵體變復(fù)性操作的效率對(duì)目標(biāo)產(chǎn)物的收率至關(guān)重要。然而，這也是一個(gè)技術(shù)難題，尤其當(dāng)目標(biāo)蛋白分子中的Cys殘基數(shù)目較高時(shí)，體外復(fù)性蛋白質(zhì)的成功率相當(dāng)?shù)停话悴怀^30%當(dāng)前第28頁\共有84頁\編于星期五\22點(diǎn)包涵體型異源蛋白的表達(dá)以包涵體形式表達(dá)目的蛋白的操作如果未進(jìn)行特殊設(shè)計(jì)（如分泌型表達(dá)或融合型表達(dá)），外源基因在大腸桿菌中表達(dá)的蛋白量占細(xì)胞總蛋白量20%以上時(shí)，表達(dá)產(chǎn)物一般傾向于形成包涵體。因此，以包涵體形式表達(dá)目的基因操作的關(guān)鍵就是選擇高表達(dá)的載體。事實(shí)上，這種高表達(dá)率也是包涵體法的長(zhǎng)處所在當(dāng)前第29頁\共有84頁\編于星期五\22點(diǎn)包涵體型異源蛋白的表達(dá)包涵體的變性與復(fù)性操作C

共價(jià)修飾的蛋白質(zhì)蛋白質(zhì)變性復(fù)性的動(dòng)力學(xué)原理：C1C2CnCUI1InNX1X2XnXAgAgAgAgI

有效變復(fù)性過程中的中間狀態(tài)X

脫離有效變復(fù)性過程而進(jìn)入集聚的中間狀態(tài)N

天然狀態(tài)的蛋白質(zhì)U

變性狀態(tài)的蛋白質(zhì)A集聚狀態(tài)的蛋白質(zhì)在細(xì)菌細(xì)胞內(nèi)，集聚狀態(tài)和共價(jià)修飾的蛋白質(zhì)不能進(jìn)入復(fù)性過程，因此永遠(yuǎn)成為無活性的蛋白質(zhì)。包涵體中的蛋白質(zhì)就屬于這兩種狀態(tài)，因此需要在體外進(jìn)行人工變性（解除共價(jià)修飾和驅(qū)散集聚體）復(fù)性操作當(dāng)前第30頁\共有84頁\編于星期五\22點(diǎn)包涵體型異源蛋白的表達(dá)包涵體的變性與復(fù)性操作包涵體的溶解與變性：包涵體的溶解與變性的主要任務(wù)是拆開錯(cuò)配的二硫鍵和次級(jí)鍵在人工條件下，使包涵體溶解并重新進(jìn)入復(fù)性途徑中。能有效促進(jìn)包涵體溶解變性的試劑和條件包括：

清洗劑

SDS、正十二醇肌氨酸，廉價(jià)，但影響復(fù)性和純化

促溶劑

鹽酸胍、尿素，前者昂貴，尿素便宜，但常被自發(fā)形成的氰酸鹽污染，后者能與多肽鏈中的氨基反應(yīng)

混合溶劑

如尿素與醋酸、二甲基砜等聯(lián)合使用，溶解力增強(qiáng)

極端pH廉價(jià)，但許多蛋白質(zhì)在極端pH條件下發(fā)生修飾反應(yīng)當(dāng)前第31頁\共有84頁\編于星期五\22點(diǎn)包涵體型異源蛋白的表達(dá)包涵體的變性與復(fù)性操作包涵體的復(fù)性與重折疊（refolding）：包涵體的復(fù)性與重折疊的主要任務(wù)是：通過次級(jí)鍵的形成使蛋白質(zhì)復(fù)性將多肽鏈中被拆開的游離巰基重新折疊當(dāng)前第32頁\共有84頁\編于星期五\22點(diǎn)包涵體型異源蛋白的表達(dá)包涵體的變性與復(fù)性操作包涵體的復(fù)性與重折疊（refolding）：復(fù)性操作包涵體復(fù)性操作的方法包括：分段稀釋法，逐步降低變性劑的濃度，防止二次集聚的發(fā)生一步稀釋法，蛋白復(fù)性與濃度無關(guān)，但集聚與濃度關(guān)系很大試劑添加法，精氨酸、甘氨酸、甘油、蔗糖、PEG、Ca2+蛋白修飾法，氨基檸檬酸酐酰化，蛋白帶負(fù)電，抑制集聚產(chǎn)物隔離法，將變性的蛋白分子固定化，避免其相互碰撞分子伴侶法，GroEL、GroES、DnaK，固定化，共表達(dá)當(dāng)前第33頁\共有84頁\編于星期五\22點(diǎn)包涵體型異源蛋白的表達(dá)包涵體的變性與復(fù)性操作包涵體的復(fù)性與重折疊（refolding）：二硫鍵形成在包涵體變性體系中，始終存在著還原劑，使多肽鏈中的巰基保持還原狀態(tài)，防化學(xué)氧化法（A）需要電子受體，最廉價(jià)的電子受體為空氣，二硫鍵形成是二硫鍵交換（B）需要還原型和氧化型谷胱甘肽（GSH和GSSG），二硫鍵止二硫鍵錯(cuò)配導(dǎo)致嚴(yán)重的集聚。在變性操作結(jié)束后，這些游離型的巰基必須重新配對(duì)形成二硫鍵，此時(shí)多肽鏈也重新發(fā)生折疊。形成二硫鍵的方式主要有：隨機(jī)的，僅適用于那些不含游離半胱氨酸殘基的蛋白質(zhì)的重折疊形成相對(duì)特異，因此適用性較廣，重折疊效果好HSHSSS+2e+2H+AHSHSS-S-RHS+BR-S-S-RSS2R-SH當(dāng)前第34頁\共有84頁\編于星期五\22點(diǎn)分泌型異源蛋白的表達(dá)在大腸桿菌中表達(dá)的異源蛋白按其在細(xì)胞中的定位可分為兩種形式：即以可溶性或不溶性（包涵體）狀態(tài)存在于細(xì)胞質(zhì)中；或者通過運(yùn)輸或分泌方式定位于細(xì)胞周質(zhì)，甚至穿過外膜進(jìn)入培養(yǎng)基中。蛋白產(chǎn)物N端信號(hào)肽序列的存在是蛋白質(zhì)分泌的前提條件當(dāng)前第35頁\共有84頁\編于星期五\22點(diǎn)分泌型異源蛋白的表達(dá)以分泌形式表達(dá)目的蛋白的優(yōu)缺點(diǎn)分泌表達(dá)形式的優(yōu)點(diǎn)：目的蛋白穩(wěn)定性高重組人胰島素原若分泌到細(xì)胞周中，其穩(wěn)穩(wěn)定性大約是在細(xì)胞質(zhì)中的10倍目的蛋白易于分離目的蛋白末端完整相當(dāng)多的真核生物成熟蛋白N端并不含有甲硫氨酸殘基。當(dāng)這些真核基因在大腸桿菌中表達(dá)時(shí)，蛋白質(zhì)N端的甲硫氨酸殘基往往不能被切除。如若將外源基因與大腸

桿菌的信號(hào)肽編碼序列重組在一起，一旦分泌型表達(dá)，其N端的甲硫氨酸殘基便可在信號(hào)肽的剪切過程中被有效除去當(dāng)前第36頁\共有84頁\編于星期五\22點(diǎn)分泌型異源蛋白的表達(dá)以分泌形式表達(dá)目的蛋白的優(yōu)缺點(diǎn)分泌表達(dá)形式的缺點(diǎn)：相對(duì)其它生物細(xì)胞而言，大腸桿菌的蛋白分泌機(jī)制并不健全。外源真核生物基因很難在大腸桿菌中進(jìn)行分泌型表達(dá)，少數(shù)外源基因既便能分泌表達(dá)，但其表達(dá)率通常要比包涵體方式低很多，因此目前用于產(chǎn)業(yè)化的異源蛋白分泌型重組大腸桿菌盡管有，但并不普遍當(dāng)前第37頁\共有84頁\編于星期五\22點(diǎn)分泌型異源蛋白的表達(dá)蛋白質(zhì)的分泌機(jī)制原核細(xì)菌周質(zhì)中含有多種分子伴侶可阻止分泌蛋白的隨機(jī)折疊，分泌在細(xì)胞周質(zhì)或培養(yǎng)基中的重組蛋白很少形成分子間的二硫鍵交聯(lián)，因此與包涵體相比，分泌型重組蛋白具有較高比例的正確構(gòu)象，生物活性的回收率增加，且對(duì)蛋白酶不敏感

當(dāng)前第38頁\共有84頁\編于星期五\22點(diǎn)分泌型異源蛋白的表達(dá)分泌型目的蛋白表達(dá)系統(tǒng)的構(gòu)建包括大腸桿菌在內(nèi)的絕大多數(shù)革蘭氏陰性菌不能將蛋白質(zhì)直接分泌到胞外，但有些革蘭氏陰性菌能將細(xì)菌的抗菌蛋白（細(xì)菌素）分泌到培養(yǎng)基中，這一過程嚴(yán)格依賴于細(xì)菌素釋放蛋白，它激活定位于內(nèi)上的磷酸酯酶，導(dǎo)致細(xì)菌內(nèi)外膜的通透性增大。因此，只要將細(xì)菌素釋放蛋白編碼基因克隆在一個(gè)合適的質(zhì)粒上即可構(gòu)建完全分泌型的受體細(xì)胞。此時(shí)，用另一種攜帶大腸桿菌信號(hào)肽編碼序列和目的基因的表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化上述完全分泌型受體細(xì)胞，并使用相同性質(zhì)的啟動(dòng)子介導(dǎo)目的基因的轉(zhuǎn)錄，則可實(shí)現(xiàn)目的蛋白從重組大腸桿菌中的完全分泌。當(dāng)前第39頁\共有84頁\編于星期五\22點(diǎn)融合型異源蛋白的表達(dá)除了直接表達(dá)異源蛋白外，還可將外源基因與受體菌自身的蛋白質(zhì)編碼基因拼接在一起，并作為一個(gè)開放型閱讀框架進(jìn)行表達(dá)。由這種雜合基因表達(dá)出的蛋白質(zhì)稱為融合蛋白。在這種融合蛋白結(jié)構(gòu)中，通常受體細(xì)菌的蛋白部分位于N端，異源蛋白位于C端。通過在DNA水平上人工設(shè)計(jì)引入的蛋白酶切割位點(diǎn)或化學(xué)試劑特異性斷裂位點(diǎn)，可以在體外從純化的融合蛋白分子中釋放回收異源蛋白當(dāng)前第40頁\共有84頁\編于星期五\22點(diǎn)融合型異源蛋白的表達(dá)以融合形式表達(dá)目的蛋白的優(yōu)缺點(diǎn)目的蛋白穩(wěn)定性高

尤其對(duì)分子量較小的多肽效果更佳目的蛋白易于分離

利用受體蛋白成熟的抗體、配體、底物進(jìn)目的蛋白表達(dá)率高

與受體蛋白共用一套完善的表達(dá)元件

胞內(nèi)形成良好的空間構(gòu)象，且大多具有水溶性目的蛋白。在實(shí)際生產(chǎn)中，產(chǎn)品主要的成本往往就在該工段行親和層析，可以快速獲得純度較高的融合蛋白目的蛋白溶解性好

由于受體蛋白的存在，融合蛋白往往能在目的蛋白需要回收

融合蛋白需要裂解和進(jìn)一步分離，才能獲當(dāng)前第41頁\共有84頁\編于星期五\22點(diǎn)融合型異源蛋白的表達(dá)融合型目的蛋白表達(dá)系統(tǒng)的構(gòu)建融合蛋白表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建原則：受體細(xì)胞的結(jié)構(gòu)基因能高效表達(dá)，且其表達(dá)產(chǎn)物可以通過親和層析進(jìn)行特異性簡(jiǎn)單純化兩個(gè)結(jié)構(gòu)基因拼接位點(diǎn)處的序列設(shè)計(jì)十分重要，它直接決定著為目的蛋白分離回收創(chuàng)造條件外源基因應(yīng)裝在受體蛋白編碼基因的下游，為融合蛋白提供終止密碼子。在某些情況下，并不需要完整的受體結(jié)構(gòu)基因，目的是盡可能避免融合蛋白分子中兩種組份的分子量過于接近，融合蛋白的裂解工藝兩個(gè)蛋白編碼序列應(yīng)保持一致的翻譯閱讀框架當(dāng)前第42頁\共有84頁\編于星期五\22點(diǎn)融合型異源蛋白的表達(dá)融合型目的蛋白表達(dá)系統(tǒng)的構(gòu)建用于融合蛋白構(gòu)建的受體蛋白：谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶（GST）維持良好空間構(gòu)象硫氧化還原蛋白（TrxA）

維持良好空間構(gòu)象pTrxFus麥芽糖結(jié)合蛋白（MBP）促進(jìn)分泌金黃色葡萄球菌蛋白A（SAPA）

免疫親和層析pRIT2T外膜蛋白（OmpF）

促進(jìn)分泌b-半乳糖苷酶（LacZ）

免疫親和層析泛素蛋白（Ubi）

維持良好空間構(gòu)象當(dāng)前第43頁\共有84頁\編于星期五\22點(diǎn)融合型異源蛋白的表達(dá)目的蛋白的回收融合蛋白中受體蛋白部分的存在可能會(huì)影響目的蛋白的空間構(gòu)象和生物活性，如果將之注入人體還會(huì)導(dǎo)致免疫反應(yīng)，因此在制備和生產(chǎn)藥用目的蛋白時(shí)，將融合蛋白中的受體蛋白部分完整除去是必不可少的工序。融合蛋白的位點(diǎn)專一性斷裂方法有兩種：

化學(xué)斷裂法酶促裂解法

當(dāng)前第44頁\共有84頁\編于星期五\22點(diǎn)融合型異源蛋白的表達(dá)目的蛋白的回收用于蛋白位點(diǎn)專一性化學(xué)斷裂的最佳試劑為溴化氰（CNBr）它與多肽鏈中的甲硫氨酸殘基側(cè)鏈的硫醚基反應(yīng)，生成溴化亞氨內(nèi)酯，后者不穩(wěn)定，在水的作用下肽鍵斷裂，形成兩個(gè)多肽降解片段其中上游肽段的甲硫氨酸殘基轉(zhuǎn)化為高絲氨酸殘基，而下游肽段N端的第一位氨基酸殘基保持不變。這一方法的優(yōu)點(diǎn)是回收率高（可達(dá)到85%以上），專一性強(qiáng)，而且所產(chǎn)生的目的蛋白的N端不含甲硫氨酸，與真核生物細(xì)胞中的成熟表達(dá)產(chǎn)物較為接近。然而，如果異源蛋白分子內(nèi)部含有甲硫氨酸殘基，則不能用此方法化學(xué)斷裂法：當(dāng)前第45頁\共有84頁\編于星期五\22點(diǎn)融合型異源蛋白的表達(dá)目的蛋白的回收酶促裂解法：?jiǎn)螝埢稽c(diǎn)蛋白內(nèi)切酶切割位點(diǎn)梭菌蛋白酶Arg-C葡萄球菌蛋白酶Glu-C假單孢菌蛋白酶Lys-C豬胰蛋白酶Arg-C

Lys-C蛋白酶酶促裂解法的特點(diǎn)是斷裂效率更高，同時(shí)每種蛋白酶均具有相應(yīng)的斷裂位點(diǎn)決定簇，因此可供選擇的專一性斷裂位點(diǎn)范圍較廣。幾種斷裂位點(diǎn)專一性最強(qiáng)的商品化蛋白酶分別在多肽鏈中的精氨酸、谷氨酸、賴氨酸殘基處切開酰胺鍵，形成不含上述殘基的下游斷裂肽段，與溴化氰化學(xué)斷裂法相似。用上述蛋白酶裂解融合蛋白的前提條件是外源蛋白分子內(nèi)部不能含有精氨酸、谷氨酸或賴氨酸殘基，如果外源基因表達(dá)產(chǎn)物為小分子多肽，這一限制條件并不苛刻，但大分子量的異源蛋白來說，上述三種氨基酸殘基的出現(xiàn)頻率是相當(dāng)高的ArgCNNC受體蛋白目的蛋白當(dāng)前第46頁\共有84頁\編于星期五\22點(diǎn)融合型異源蛋白的表達(dá)目的蛋白的回收酶促裂解法：多殘基位點(diǎn)為了克服僅切單一氨基酸殘基的蛋白酶所帶來的應(yīng)用局限性，可在受體蛋白編碼序列與不含起始密碼子的外源基因之間加裝一段編碼寡肽序列（Ile-Glu-Gly-Arg）的人工接頭片段，該寡肽為具有蛋白酶活性的凝血因子Xa的識(shí)別和作用序列，其斷裂位點(diǎn)在Arg的C末端。純化后的融合蛋白用Xa處理，即可獲得不含上述寡肽序列的目的蛋白。由于Xa的識(shí)別作用序列由四個(gè)氨基酸殘基組成，大多數(shù)蛋白質(zhì)中出現(xiàn)這種寡肽序列的概率極少，因此這種方法可廣泛用于從融合蛋白中回收各種不同大小的目的蛋白產(chǎn)物當(dāng)前第47頁\共有84頁\編于星期五\22點(diǎn)融合型異源蛋白的表達(dá)目的蛋白的回收酶促裂解法：多殘基位點(diǎn)啟動(dòng)子受體基因接頭目的基因MetArgStopLysGluIle-Glu-gly-ArgArgLysGluIle-Glu-gly-Arg表達(dá)親和層析酶解回收當(dāng)前第48頁\共有84頁\編于星期五\22點(diǎn)融合型異源蛋白的表達(dá)目的蛋白的回收酶促裂解法：多殘基位點(diǎn)PinpointXatac生物素結(jié)合肽編碼序列Xa因子識(shí)別位點(diǎn)編碼序列SP6T7AproriMCSATCGAAGGTCGCGAAGCTTCAGCTGGGATCCGGTACCGATATCAGATCTCCCGGGGCGGCCGCXa-1IleGluGlyArg

GluATCGAAGGTCGCGAAAGCTTCAGCTGGGATCCGGTACCGATATCAGATCTCCCGGGGCGGCCGCXa-2ATCGAAGGTCGCGAAAAGCTTCAGCTGGGATCCGGTACCGATATCAGATCTCCCGGGGCGGCCGCXa-3NruIHindIIIPvuIIBamHIKpnIEcoRVBglIISmaINotIXa因子切割位點(diǎn)當(dāng)前第49頁\共有84頁\編于星期五\22點(diǎn)寡聚型異源蛋白的表達(dá)從理論上講，外源基因的表達(dá)水平與受體細(xì)胞中可轉(zhuǎn)錄基因的拷貝數(shù)（即基因劑量）呈正相關(guān)。然而重組質(zhì)粒除了含有外源基因外，還攜帶其它的可轉(zhuǎn)錄基因，如作為篩選標(biāo)記的抗生素抗性基因等。隨著重組質(zhì)?？截悢?shù)的不斷增加，受體細(xì)胞內(nèi)的大部分能量和原料被用于合成所有的重組質(zhì)粒編碼蛋白，而細(xì)胞的正常生長(zhǎng)代謝卻因能量不濟(jì)受到影響，因此通過增加質(zhì)?？截悢?shù)提高外源基因表達(dá)產(chǎn)物的產(chǎn)量往往不能獲得滿意的效果。另一種通過增加外源基因劑量而提高目標(biāo)蛋白產(chǎn)量的有效方法是構(gòu)建寡聚串聯(lián)型異源蛋白表達(dá)載體，即將多拷貝的外源基因克隆在一個(gè)低拷貝質(zhì)粒上，以取代單拷貝外源基因在高拷貝載體上表達(dá)的策略當(dāng)前第50頁\共有84頁\編于星期五\22點(diǎn)寡聚型異源蛋白的表達(dá)以寡聚形式表達(dá)目的蛋白的優(yōu)缺點(diǎn)目的蛋白高效表達(dá)在不提高質(zhì)?？截悢?shù)的前提下，增加目的基因的拷貝數(shù)，可以穩(wěn)定表達(dá)小分子短肽在一定程度上改善表達(dá)量目的產(chǎn)物回收困難短肽由于缺乏有效的空間結(jié)構(gòu)，在細(xì)菌細(xì)胞中的半衰期較短。串聯(lián)短肽具有與蛋白質(zhì)相似的長(zhǎng)度及空間結(jié)構(gòu)，因而抗蛋白酶降解的能力大幅度提高寡聚短肽需要裂解和進(jìn)一步分離，才能獲最終分子，但裂解后的短肽分子容易出現(xiàn)序列不均一性當(dāng)前第51頁\共有84頁\編于星期五\22點(diǎn)寡聚型異源蛋白的表達(dá)寡聚型目的蛋白表達(dá)系統(tǒng)的構(gòu)建PSDgenegenegenegeneT1T2H2NCOOHMetMetMetMetmRNACNBr基本戰(zhàn)略：當(dāng)前第52頁\共有84頁\編于星期五\22點(diǎn)寡聚型異源蛋白的表達(dá)寡聚型目的蛋白表達(dá)系統(tǒng)的構(gòu)建構(gòu)建舉例：PSDT1T2EcoRIBamHIAATTCAGATCTGTCTAGAGCCTAGEcoRIBglIIBamHIEcoRIBamHIBglIIGATCTAGCCTAGEcoRIBamHIBglIIEcoRIBamHIBglIIEcoRI+BamHIBglII+BamHIBamHI當(dāng)前第53頁\共有84頁\編于星期五\22點(diǎn)整合型異源蛋白的表達(dá)以整合形式表達(dá)目的蛋白的優(yōu)缺點(diǎn)目的基因穩(wěn)定表達(dá)整合型的目的基因隨受體細(xì)胞染色體DNA的復(fù)制而復(fù)制，在大多數(shù)情況下相當(dāng)穩(wěn)定，工程菌在沒有選擇壓力存在下可以連續(xù)目的基因表達(dá)率低單拷貝整合的目的基因表達(dá)率受到限制，此時(shí)可通過強(qiáng)化表達(dá)元件而加以補(bǔ)償培養(yǎng)而不丟失目的基因表達(dá)盒，這對(duì)以改良物種遺傳性狀為目的的基因工程案例特別有意義當(dāng)前第54頁\共有84頁\編于星期五\22點(diǎn)整合型異源蛋白的表達(dá)DNA體內(nèi)重組的基本原理在生物體細(xì)胞尤其是原核細(xì)菌細(xì)胞內(nèi)，廣泛存在著DNA的遺傳重組機(jī)制，其可能的生物學(xué)功效是促進(jìn)生物種群的進(jìn)化。細(xì)胞內(nèi)的遺傳重組可分為兩大類：轉(zhuǎn)位因子依賴型同源序列依賴型當(dāng)前第55頁\共有84頁\編于星期五\22點(diǎn)整合型異源蛋白的表達(dá)DNA體內(nèi)重組的基本原理

轉(zhuǎn)位因子是指生物細(xì)胞內(nèi)天然存在的一類無復(fù)制能力的DNA可移動(dòng)因子，不同生物種群擁有結(jié)構(gòu)不同的轉(zhuǎn)位因子，例如：轉(zhuǎn)位因子依賴型的體內(nèi)重組：轉(zhuǎn)位因子家族噬菌體 G片段（G-Fragment）原核細(xì)菌 插入順序（IS）真核細(xì)菌 轉(zhuǎn)座子（Tn、Ty）高等植物可移動(dòng)因子（Ac、Ds）高等動(dòng)物 跳躍基因（mobilgene）當(dāng)前第56頁\共有84頁\編于星期五\22點(diǎn)整合型異源蛋白的表達(dá)DNA體內(nèi)重組的基本原理轉(zhuǎn)位因子依賴型的體內(nèi)重組：轉(zhuǎn)位因子的結(jié)構(gòu)IS（1kb）Ty（5kb）Tn（2-20kb）ACCATGGTTTTGGTACCA抗藥性基因轉(zhuǎn)位酶基因識(shí)別位點(diǎn)阻遏基因IRIRIRIRISIS當(dāng)前第57頁\共有84頁\編于星期五\22點(diǎn)整合型異源蛋白的表達(dá)DNA體內(nèi)重組的基本原理轉(zhuǎn)位因子依賴型的體內(nèi)重組：整合形式當(dāng)前第58頁\共有84頁\編于星期五\22點(diǎn)整合型異源蛋白的表達(dá)DNA體內(nèi)重組的基本原理在很多原核細(xì)菌細(xì)胞中，染色體DNA鏈上的兩個(gè)同源區(qū)之間可發(fā)生所謂的同源重組，其頻率與細(xì)菌種類、兩個(gè)同源區(qū)之間的距離同源區(qū)的長(zhǎng)度、同源程度密切相關(guān)。一般地說，距離越遠(yuǎn)、長(zhǎng)度越長(zhǎng)、同源性越高，重組的頻率也就越高，反之亦然。同源重組有整合和交換兩種形式，前者只需要一個(gè)斷裂位點(diǎn)，而后者涉及兩個(gè)斷裂位點(diǎn)同源序列依賴型的體內(nèi)重組：基本形式當(dāng)前第59頁\共有84頁\編于星期五\22點(diǎn)整合型異源蛋白的表達(dá)DNA體內(nèi)重組的基本原理同源序列依賴型的體內(nèi)重組：同源整合ori目的基因同源區(qū)域標(biāo)記基因整合位點(diǎn)染色體DNA當(dāng)前第60頁\共有84頁\編于星期五\22點(diǎn)整合型異源蛋白的表達(dá)DNA體內(nèi)重組的基本原理同源序列依賴型的體內(nèi)重組：同源交換ori目的基因同源區(qū)域標(biāo)記基因交換區(qū)域染色體DNAori標(biāo)記基因+當(dāng)前第61頁\共有84頁\編于星期五\22點(diǎn)蛋白酶抗性或缺陷型表達(dá)系統(tǒng)的構(gòu)建無論是在真核生物還是在原核細(xì)胞中，重組目的蛋白表達(dá)后都會(huì)面臨被降解的命運(yùn)，其穩(wěn)定性甚至還不如半衰期較短的受體細(xì)胞內(nèi)源性蛋白質(zhì)。在大多數(shù)情況下，重組目的蛋白的不穩(wěn)定性可歸結(jié)為對(duì)受體細(xì)胞蛋白酶系統(tǒng)的敏感性。然而越來越多的實(shí)驗(yàn)表明，重組目的蛋白在受體細(xì)胞內(nèi)的半衰期可以通過蛋白序列的人工設(shè)計(jì)以及受體細(xì)胞的改造加以調(diào)整和控制。當(dāng)前第62頁\共有84頁\編于星期五\22點(diǎn)蛋白酶抗性或缺陷型表達(dá)系統(tǒng)的構(gòu)建實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，大多數(shù)不穩(wěn)定的重組目的蛋白是被大腸桿菌中的蛋白酶La和Ti降解的，兩者分別由lon和clp基因編碼，其蛋白水解活性依賴于ATP。lon基因由熱休克等環(huán)境壓力激活，細(xì)胞內(nèi)異常蛋白或重組異源蛋白的過量表達(dá)也可作為一種環(huán)境壓力誘導(dǎo)lon基因的表達(dá)。lon-的大腸桿菌突變株可使原來半衰期較短的細(xì)菌調(diào)控蛋白（如SulA、RscA、lN）穩(wěn)定性大增，因此被廣泛用作外源基因高效表達(dá)的受體菌。蛋白酶缺陷型受體細(xì)胞的改造lon基因缺陷的大腸桿菌受體（lon-）：當(dāng)前第63頁\共有84頁\編于星期五\22點(diǎn)蛋白酶抗性或缺陷型表達(dá)系統(tǒng)的構(gòu)建大腸桿菌中龐大的熱休克蛋白家族對(duì)異?；虍愒吹鞍椎慕到庖灿兄匾饔?，其機(jī)理是脅迫異常或異源蛋白形成一種對(duì)蛋白酶識(shí)別和降解較有利的空間構(gòu)象，從而提高異?；虍愒吹鞍讓?duì)蛋白酶的敏感性。熱休克基因dnaK、dnaJ、groEL、grpE以及環(huán)境壓力特異性s因子編碼基因htpR的突變株均呈現(xiàn)出對(duì)異源蛋白降解作用的嚴(yán)重缺陷，特別是lon-htpR-的雙缺陷株，非常適合高效表達(dá)各種不穩(wěn)定的重組異源蛋白。蛋白酶缺陷型受體細(xì)胞的改造htpR基因缺陷的大腸桿菌受體（htpR-）：當(dāng)前第64頁\共有84頁\編于星期五\22點(diǎn)蛋白酶抗性或缺陷型表達(dá)系統(tǒng)的構(gòu)建大量的實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，在所有的極性氨基酸中，天門冬氨酸（Asp）的存在對(duì)提高蛋白質(zhì)穩(wěn)定性的效應(yīng)最顯著，而且Asp殘基離C末端越近，蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性就越大。更為重要的是，在多種結(jié)構(gòu)和功能相互獨(dú)立的蛋白質(zhì)C末端引入Asp殘基，都能顯著地延長(zhǎng)這些蛋白質(zhì)的半衰期，因此具有普遍意義?？沟鞍酌傅闹亟M異源蛋白序列的設(shè)計(jì)多肽鏈C末端氨基酸序列對(duì)穩(wěn)定性的影響：當(dāng)前第65頁\共有84頁\編于星期五\22點(diǎn)蛋白酶抗性或缺陷型表達(dá)系統(tǒng)的構(gòu)建大量的實(shí)驗(yàn)結(jié)果同時(shí)表明，如果多肽鏈的N末端序列中含有較高比例的Ala、Asn、Cys、Gln、His，則蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性顯著改善。相反，N末端含有Pro、Glu、Ser、Thr的真核生物蛋白質(zhì)，在真核和原核細(xì)胞中的半衰期通常很短，尤其Pro-Glu-Ser-Thr序列（PEST序列），是胞內(nèi)蛋白酶的超敏感區(qū)?？沟鞍酌傅闹亟M異源蛋白序列的設(shè)計(jì)多肽鏈N末端氨基酸序列對(duì)穩(wěn)定性的影響：當(dāng)前第66頁\共有84頁\編于星期五\22點(diǎn)4基因工程菌的遺傳不穩(wěn)定性及其對(duì)策基因工程菌遺傳不穩(wěn)定性的表現(xiàn)與機(jī)制改善基因工程菌不穩(wěn)定性的策略當(dāng)前第67頁\共有84頁\編于星期五\22點(diǎn)基因工程菌遺傳不穩(wěn)定性的表現(xiàn)與機(jī)制工程菌遺傳不穩(wěn)定性的表現(xiàn)形式

基因工程菌的遺傳不穩(wěn)定性主要表現(xiàn)在重組質(zhì)粒的不穩(wěn)定性，這種不穩(wěn)定性具有下列兩種表現(xiàn)形式：結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定性重組DNA分子上某一區(qū)域發(fā)生缺失、重排、修飾，導(dǎo)致其表觀生物學(xué)功能的喪失分配不穩(wěn)定性整個(gè)重組DNA分子從受體細(xì)胞中逃逸（curing）當(dāng)前第68頁\共有84頁\編于星期五\22點(diǎn)基因工程菌遺傳不穩(wěn)定性的表現(xiàn)與機(jī)制工程菌遺傳不穩(wěn)定性的產(chǎn)生機(jī)制受體細(xì)胞中的限制修飾系統(tǒng)對(duì)外源重組DNA分子的降解能量、物質(zhì)的匱乏和外源基因表達(dá)產(chǎn)物的毒性誘導(dǎo)受體細(xì)胞外源基因的高效表達(dá)嚴(yán)重干擾受體細(xì)胞正常的生長(zhǎng)代謝產(chǎn)生應(yīng)激反應(yīng)：關(guān)閉合成途徑，啟動(dòng)降解程序重組質(zhì)粒在受體細(xì)胞分裂時(shí)的不均勻分配這是重組質(zhì)粒逃逸的基本原因受體細(xì)胞中內(nèi)源性的轉(zhuǎn)座元件促進(jìn)重組分子的缺失重排當(dāng)前第69頁\共有84頁\編于星期五\22點(diǎn)基因工程菌遺傳不穩(wěn)定性的表現(xiàn)與機(jī)制重組質(zhì)粒的逃逸率一部分細(xì)胞不再攜帶重組質(zhì)粒，這些空載細(xì)胞數(shù)與總細(xì)胞數(shù)之比稱為當(dāng)含有重組質(zhì)粒的工程菌在非選擇性條件下生長(zhǎng)時(shí)，培養(yǎng)系統(tǒng)中稱為重組質(zhì)粒的宏觀逃逸率。重組質(zhì)粒逃逸的原因有：高溫培養(yǎng)、表面活性劑（SDS）、藥物（利福平）、染料（吖啶）促使重組質(zhì)粒滲漏受體細(xì)胞中的核酸酶降解重組質(zhì)粒重組質(zhì)粒在受體細(xì)胞分裂時(shí)不均勻分配，細(xì)胞所含重組質(zhì)?？截悢?shù)的差異隨著細(xì)胞分裂次數(shù)的增多而加劇當(dāng)前第70頁\共有84頁\編于星期五\22點(diǎn)改善基因工程菌不穩(wěn)定性的策略改進(jìn)載體受體系統(tǒng)以增大質(zhì)粒穩(wěn)定性為目的的構(gòu)建方法包括：將R1質(zhì)粒上的parB基因引入表達(dá)型載體中，其表達(dá)產(chǎn)物可以選擇性地殺死由于分配不均勻所產(chǎn)生的無質(zhì)粒細(xì)胞正確設(shè)置載體上的多克隆位點(diǎn)，禁止DNA片段插在穩(wěn)定區(qū)內(nèi)將受體細(xì)胞的致死性基因安裝在載體上，同時(shí)構(gòu)建條件致死性的相應(yīng)受體系統(tǒng)，如大腸桿菌的ssb基因（DNA單鏈結(jié)合蛋白編碼基因當(dāng)前第71頁\共有84頁\編于星期五\22點(diǎn)改善基因工程菌不穩(wěn)定性的策略施加選擇壓力根據(jù)載體上的抗藥性標(biāo)記，向培養(yǎng)系統(tǒng)中添加相應(yīng)的抗生素藥物和食品生產(chǎn)時(shí)禁止使用抗生素根據(jù)載體上的營(yíng)養(yǎng)缺陷型標(biāo)記，向培養(yǎng)系統(tǒng)中添加相應(yīng)的營(yíng)培養(yǎng)基復(fù)雜，成本較高養(yǎng)組份當(dāng)前第72頁\共有84頁\編于星期五\22點(diǎn)改善基因工程菌不穩(wěn)定性的策略控制目的基因的過量表達(dá)使用可控型啟動(dòng)子控制目的基因的定時(shí)表達(dá)及表達(dá)程度使用可控型復(fù)制子控制質(zhì)粒的定時(shí)增殖或降低質(zhì)粒的拷貝數(shù)優(yōu)化基因工程菌的培養(yǎng)工藝培養(yǎng)基組成：限制培養(yǎng)基比豐富培養(yǎng)基更有利于穩(wěn)定培養(yǎng)溫度：較低的培養(yǎng)溫度有利于重組質(zhì)粒的穩(wěn)定當(dāng)前第73頁\共有84頁\編于星期五\22點(diǎn)5利用重組大腸桿菌生產(chǎn)人胰島素胰島素的結(jié)構(gòu)及其生物合成人胰島素的生產(chǎn)方法重組人胰島素的大腸桿菌工程菌的構(gòu)建當(dāng)前第74頁\共有84頁\編于星期五\22點(diǎn)胰島素的結(jié)構(gòu)及其