細胞因子及抗體檢測技術

背景知識研究細胞因子對闡明機體免疫應答及其調節(jié)機制、免疫相關疾病的發(fā)生、發(fā)展規(guī)律和指導臨床治療均具有重要意義抗體具有高特異性、高親和力等特點，目前已廣泛應用于免疫學、微生物學、腫瘤學、遺傳學以及分子生物學等各個領域當前第1頁\共有40頁\編于星期四\10點細胞因子的檢測方法：

1)生物學方法①依賴性細胞株：生物分析法②功能檢測：生物分析法

2)分子生物學方法①分子雜交技術：mRNA表達水平的測定②多聚酶鏈反應技術（PCR）：mRNA的測定

3）免疫學方法①免疫測定：免疫酶技術②功能測定與抗體抑制當前第2頁\共有40頁\編于星期四\10點抗體檢測技術免疫酶技術免疫熒光技術間接血凝試驗放射免疫測定蛋白印跡免疫共沉淀親和力測定

當前第3頁\共有40頁\編于星期四\10點

酶聯(lián)免疫吸附測定實驗

(ELISA)

Enzymelinkedimmunosorbentassay

當前第4頁\共有40頁\編于星期四\10點

基于NP30抗獨特型抗體可替代蟲源性抗原率先應用生物技術制備抗原代替?zhèn)鹘y(tǒng)蟲源抗原血吸蟲抗體屬短程抗體，治療后陰轉較快，具有療效考核價值

該試劑盒的診斷效能多項指標均已達到或超過經典抗體檢測法，較以前病原學檢查和免疫學檢測方法，更為簡便快速優(yōu)點：僅用一滴血，20分鐘即可判讀結果，不需其他儀器設備，便于在基層、現(xiàn)場使用本試劑盒已在血吸蟲流行區(qū)已應用近120萬人次

當前第5頁\共有40頁\編于星期四\10點管曉虹（1946-2012），女，漢族，江蘇丹陽人，博士，教授，博士生導師。農工民主黨員。農工民主黨第十二、十三屆中央常委，第九、十屆全國人大代表，江蘇省婦聯(lián)副主席。1970年畢業(yè)于中國協(xié)和醫(yī)科大學；1981和1985年先后在原南京醫(yī)學院獲醫(yī)學碩士和醫(yī)學博士學位；1988年在美國布朗大學作博士后研究。曾任寄生蟲學教研室副主任、江蘇省醫(yī)學分子生物學重點實驗室主任、衛(wèi)生部抗體技術重點實驗室主任。

承擔國家“七五”、“八五”、“九五”科技攻關項目各1項（血吸蟲病免疫診斷）；國家“863”計劃項目1項和國家自然科學基金項目6項；發(fā)表論文100余篇；主編或參編衛(wèi)生部規(guī)劃教材6部；獲部省級科技進步二等獎2項、三等獎2項；獲國家發(fā)明專利授權6項。獲“全國優(yōu)秀教師”、“國家級有突出貢獻的中青年專家”等榮譽稱號。享受國務院政府特殊津貼。

當前第6頁\共有40頁\編于星期四\10點實驗原理是繼免疫熒光和放射免疫技術之后發(fā)展起來的一種免疫技術此項技術自70年代初問世以來,發(fā)展十分迅速優(yōu)點：微量、特異、高效、經濟、方便、安全等廣泛用于生物學和醫(yī)學科學的許多領域當前第7頁\共有40頁\編于星期四\10點實驗原理

ELISA利用了免疫反應的高度特異性和酶促反應的高度敏感性檢測抗原或抗體使抗原或抗體結合到某種固相載體表面，并保持其免疫活性使抗原或抗體與某種酶連接成酶標抗原或抗體，這種酶標抗原或抗體既保留其免疫活性，又保留酶的活性按一定步驟進行抗原抗體反應加底物顯色，根據(jù)顏色反應的深淺進行定性或定量分析當前第8頁\共有40頁\編于星期四\10點方法類型

ELISA既可測抗原又可測抗體，根據(jù)試劑來源、標本性狀以及檢測的具體條件，可設計出不同類型的檢測方法：

1.直接法

2.間接法

3.雙抗體夾心法

4.雙夾心間接法當前第9頁\共有40頁\編于星期四\10點當前第10頁\共有40頁\編于星期四\10點當前第11頁\共有40頁\編于星期四\10點一、試劑及儀器準備（一）免疫吸附劑1.固相載體⑴要求：①吸附力強②能保持Ag或Ab活性③不參與化學反應

當前第12頁\共有40頁\編于星期四\10點⑵載體性能比較

要求：載體材料+、-結果差別大

檢測方法：10ug/LIgG包被,加酶標抗IgG，顯色后，測20孔的OD，要求CV<10%⑶常用載體：

材料：聚苯乙烯、聚乙烯、聚丙烯等

形狀：小試管、小珠、微量反應板當前第13頁\共有40頁\編于星期四\10點2.Ag或Ab：純度高、效價高、結合力高3.免疫吸附劑(固相Ag或Ab)：

包被：將Ag或Ab固相化的過程包被緩沖液、包被方法

封閉：包被后在用1-5%小牛血清白蛋白再包被，以消除非特異吸附的干擾當前第14頁\共有40頁\編于星期四\10點㈡酶結合物：1.要求：純度高、催化轉化率高、專一性強、性質穩(wěn)定、來源豐富、標記后穩(wěn)定2.常用酶：HRP、AP、?-半乳糖苷酶等3.底物：HRP可溶性底物及呈色：鄰苯二胺(OPD)：橙紅(492nm)；四甲基聯(lián)苯胺(TMB)：藍色(450nm)5-氨基水楊酸(5-ASA)：棕色(550nm)魯咪諾+H2O2：熒光HRP不可溶性底物及呈色：

DAB：棕黃色α-萘酚：紅色3-氧基-9-乙基卡唑：紅色4-氯-1-萘酚：灰藍色AP可溶性底物及呈色：對硝基苯磷酸酯(P-NPP)：黃色(405nm)4-甲基傘基磷酸酯(4-MuP)：熒光AP不可溶性底物及呈色：

NBT和BCIP混合液：紫色堅固紅和萘酚ASMX混合液：紅色

?-半乳糖苷酶：

4-甲基傘基-?-半乳糖苷：熒光當前第15頁\共有40頁\編于星期四\10點4.酶結合物的制備：戊二醛交聯(lián)法過碘酸鹽氧化法當前第16頁\共有40頁\編于星期四\10點（三）設備：酶標比色儀簡稱酶標儀

指測讀ELISA光度計；針對固相載體形式的不同，各有特制的適用于板、珠和小試管的設計性能指標：測讀速度、讀數(shù)的準確性、重復性、精確度和可測范圍、線性優(yōu)良的酶標儀的讀數(shù)一般可精確0.001，準確性為±1%，重復性達0.5%操作：室溫宜在15-30℃，使用前先預熱儀器15-30min，測讀結果更穩(wěn)定。測讀A值時，要選用產物的敏感吸收峰，如OPD用492nm波長。有的酶標儀可用雙波長式測讀當前第17頁\共有40頁\編于星期四\10點當前第18頁\共有40頁\編于星期四\10點二、操作步驟

（間接ELISA法）

樣本的收集包被抗原封閉加稀釋的待檢樣品加酶標抗抗體加底物顯色終止反應當前第19頁\共有40頁\編于星期四\10點（一）樣品的收集和保存：

1.溶血標本可增加非特異性顯色(Hb作用于HRP的輔基)；

2.細菌污染標本因菌體內源性酶而假“-”(破壞Ag或Ab)或假“+”(非特異蛋白)；

3.反復凍融可使抗體效價下降而假“-”；

4.陳舊標本可使IgG聚集，引起間接法本底增加；

5.標本中含NaN3，可出現(xiàn)假“-”。當前第20頁\共有40頁\編于星期四\10點（二）包被包被(coating)：將抗原或抗體固定在固相載體的過程

原理：物理吸附結合的，靠的是蛋白質分子結構上的疏水基團與固相載體表面的疏水基團間的作用；這種物理吸附是非特異性的影響因素：受蛋白質分子量、等電點、濃度等

大分子蛋白質較小分子蛋白質通常含有更多的疏水基團，故更易吸附到固相載體表面當前第21頁\共有40頁\編于星期四\10點

包被條件

pH9.6碳酸鹽緩沖液

pH7.2磷酸鹽緩沖液

pH7-8Tris-HCl緩沖液。

方法：加入包被液后，在4-8℃冰箱中放置過夜或37℃中保溫2小時。

濃度：隨載體和包被物的性質可有很大的變化，每批材料需通過實驗與酶結合物的濃度協(xié)調選定。一般蛋白質的包被濃度為10ng/ml-20ug/ml當前第22頁\共有40頁\編于星期四\10點

最適工作濃度的選擇

可用棋盤滴定法在夾心ELISA法中選擇包被抗體和酶標抗體工作濃度，即利用棋盤滴定，將包被抗體和酶標抗體稀釋成一系列濃度，反應后顯色。陽性值在0.8左右，陰性值小于0.1為最適，可據(jù)此選擇包被抗體和酶標抗體的工作濃度當前第23頁\共有40頁\編于星期四\10點

方陣(棋盤)滴定法選擇包被抗原的工作濃度用包被液將抗原作一系列稀釋(1:50～l:800)后，按行進行包被、洗滌。按列分別加入用稀釋液1:100稀釋的強陽性、弱陽性、陰性參考血清及稀釋液(作空白對照)，保溫，洗滌。加工作濃度酶標抗體，洗滌，加底物顯色，加酸終止反應后讀取A值。選擇強陽性參考血清A值；為0．8左右，陰性參考血清A值<0．1的包被抗原稀釋度為工作濃度

當前第24頁\共有40頁\編于星期四\10點（三）封閉封閉(blocking)：是繼包被之后用高濃度的無關蛋白質溶液再包被的過程。封閉就是讓大量不相關的蛋白質充填這些空隙，從而排斥ELISA后的步驟中干擾物質的再吸附。常用封閉劑：0.05%-0.5%的BSA;10%的小牛血清或1%明膠;脫脂奶粉,比較價廉，可以高濃度使用（5%）。當前第25頁\共有40頁\編于星期四\10點（四）加樣（抗原或抗體）純化抗原/抗體：天然但干擾多合成抗原/抗體：多肽分子較小，常有空間位阻基因抗原：與片段的選擇和制備水平有關當前第26頁\共有40頁\編于星期四\10點對照設定陽性對照品(positivecontrol)陰性對照品(negativecontrol)目的:

是檢驗試驗有效性的控制品，同時也作為判斷結果的對照。要求：陽性對照品：基本組成應盡量與檢測標本的組成相一致，多以含蛋白保護劑的緩沖液為基質。加入的量應與試劑的敏感度相稱；在測定中得到的吸光值與受檢標本吸光值比較，可以估計標本物質的量陰性對照品：須先行檢測確定不含待測物質當前第27頁\共有40頁\編于星期四\10點（五）加酶標抗體

酶標記的抗體（原）：ELISA中關鍵的試劑要求：純度高，催化反應的轉化率高，專一性強，性質穩(wěn)定，來源豐富，價格不貴，受檢標本中不存在相同的酶酶結合物保留活性部分和催化能力，底物易于制備和保存，價格低廉，有色產物易于測定等在ELISA中，HRP，AP，葡萄糖氧化酶，β-D-半乳糖苷酶和脲酶等當前第28頁\共有40頁\編于星期四\10點（六）顯色

顯色：酶催化無色的底物生成有色產物的溫育反應。影響因素：溫度、時間

在一定時間內，陰性孔可保持無色，而陽性孔則隨時間的延長而呈色加強。適當提高溫度有助于加速顯色進行。TMB：受光照的影響不大，可在室溫中置于操作臺上，邊反應觀察結果。但為保證實驗結果的穩(wěn)定性，宜在規(guī)定的適當時間閱讀結果。TMB經HRP作用后，約40分鐘顯色達頂峰，隨即逐漸減弱，至2小時后即可完全消退至無色。當前第29頁\共有40頁\編于星期四\10點（七）結果判定

操作方法：拭干板底附著的液體，然后將板正確放入酶標比色儀中。以蒸餾水校零點，測讀底物孔（未經任何反應僅加底物液的孔）和空白孔（以生理鹽水或稀釋液代替標本作全過程的孔），以記錄本次試驗的試劑狀況。其后可用空白孔以蒸餾水校零點，以上各孔的吸光度需減去空白孔的吸光度，然后進行計算。

結果判定：光密度（oplicaldensity，OD），現(xiàn)按規(guī)定用吸光度（absorbence，A），兩者含義相同。通常的表示方法是將吸收波長寫于A字母的右下角，如OPD的吸收波長為492nm，表示方法為"A492nm"或"OD492nm"。當前第30頁\共有40頁\編于星期四\10點定性測定

定性測定的結果判斷作出“有”或“無”的回答，分別用“陽性”、“陰性”表示。在這種半定量測定中，將標本作一系列稀釋后進行試驗，呈陽性反應的最高稀釋度即為滴度。根據(jù)滴度的高低，可以判斷標本反應性的強弱，這比觀察不稀釋標本呈色的深淺判斷為強陽性、弱陽性更具定量意義在間接法和夾心法ELSIA中，陽性孔呈色深于陰性孔。在競爭法ELISA中則相反，陰性孔呈色深于陽性孔當前第31頁\共有40頁\編于星期四\10點2.定量測定

ELSIA操作步驟復雜，影響反應因素較多，特別是固相載體的包被難達到各個體之間的一致，因此在定量測定中，每批測試均須用一系列不同濃度的參考標準品在相同的條件下制作標準曲線。測定大分子量物質的夾心法ELISA，標準曲線的范圍一般較寬，曲線的值逐點連接，所得曲線一般呈S形，其頭、尾部曲線趨于平坦，中央較呈直線的部分是最理想的檢測區(qū)域。當前第32頁\共有40頁\編于星期四\10點當前第33頁\共有40頁\編于星期四\10點三、基本操作注意事項（一）加樣:一般有3次加樣步聚，即加標本，加酶結合物，加底物。方法：加樣時應將所加物加在LEISA板孔的底部，避免加在孔壁上部，并注意不可濺出，不可產生氣泡。當前第34頁\共有40頁\編于星期四\10