第三章細(xì)胞生物學(xué)的研究方法

第一節(jié)細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)的觀察方法一、光學(xué)顯微鏡二、電子顯微鏡三、掃描隧道顯微鏡當(dāng)前第1頁\共有66頁\編于星期五\21點(diǎn)一、光學(xué)顯微鏡技術(shù)☆基本構(gòu)造：光學(xué)放大系統(tǒng)、照明系統(tǒng)、機(jī)械和支架系統(tǒng)當(dāng)前第2頁\共有66頁\編于星期五\21點(diǎn)普通光學(xué)顯微鏡成像原理物鏡得到物體放大的實(shí)像;目鏡把物鏡成的像進(jìn)一步放大。當(dāng)前第3頁\共有66頁\編于星期五\21點(diǎn)顯微鏡和顯微技術(shù)幾個(gè)基本概念：放大分辨率反差能辨別兩點(diǎn)之間最小距離的能力與顯微鏡的自身特點(diǎn)有關(guān)，但也取決于進(jìn)行顯微觀察時(shí)對顯微鏡的正確使用及良好的標(biāo)本制作和觀察技術(shù)，這就是顯微技術(shù)。被觀察物區(qū)別于背景的程度被觀察物越小，放大倍數(shù)應(yīng)越大，否則難以看清！當(dāng)前第4頁\共有66頁\編于星期五\21點(diǎn)決定光學(xué)顯微鏡的分辨率的要素

D＝0.61λ∕［N·sin(α/2)］D:分辨率λ：入射光的波長N：介質(zhì)的折射率（1或1.5）α：物鏡的鏡口角當(dāng)前第5頁\共有66頁\編于星期五\21點(diǎn)當(dāng)前第6頁\共有66頁\編于星期五\21點(diǎn)（一）普通復(fù)式光學(xué)顯微鏡分辨率指區(qū)分開兩個(gè)質(zhì)點(diǎn)間的最小距離。兩個(gè)質(zhì)點(diǎn)之間的距離取決于光源波長λ，物鏡鏡口角a和介質(zhì)折射率ND=0.61λ/N×sin(a/2)空氣（N=1.0）、水（N=1.33）、香柏油（N=1.52）當(dāng)前第7頁\共有66頁\編于星期五\21點(diǎn)顯微鏡的種類及原理普通光學(xué)顯微鏡光學(xué)顯微鏡一般配置的最大放大倍數(shù)是多少？為什么？如何實(shí)現(xiàn)光學(xué)顯微鏡一般配置的最大放大倍數(shù)？其原理？目鏡：10~15×；物鏡：100×；總放大倍數(shù)1000~1500×；使用油鏡，即在100×物鏡和載玻片之間滴加香柏油；當(dāng)前第8頁\共有66頁\編于星期五\21點(diǎn)普通光學(xué)顯微鏡分辨率與所用波長成反比！當(dāng)前第9頁\共有66頁\編于星期五\21點(diǎn)用浸沒油取代空氣的作用?介質(zhì)折射率提高分辨率得到提高改變光折射角度增加照明亮度很多原來由于在透鏡及載片表面的反射和折射而損失的光線可以進(jìn)入物鏡，使照明亮度提高，改善觀察效果。浸沒油與玻璃的折射率相近當(dāng)前第10頁\共有66頁\編于星期五\21點(diǎn)Makingtissuesections.Howanembeddedtissueissectionedwithamicrotomeinpreparationforexaminationinthelightmicroscope.普通光鏡的觀察取材－固定－脫水－包埋－切片－脫蠟－復(fù)水－染色－脫水－透明－封片－觀察步驟：當(dāng)前第11頁\共有66頁\編于星期五\21點(diǎn)觀察結(jié)果當(dāng)前第12頁\共有66頁\編于星期五\21點(diǎn)（二）熒光顯微鏡技術(shù)是光鏡水平對特異蛋白質(zhì)等生物大分子定性定位的最有力的工具。主要是用于檢測細(xì)胞上的特異熒光材料；與普通光學(xué)顯微鏡不同的是增加了兩套濾光片。

第一套稱為激發(fā)光濾片，裝在光源和樣品之間，只有那些能激發(fā)熒光材料發(fā)光的特定波長的光才能通過。第二套稱為阻斷濾片，裝在物鏡和目鏡之間，只讓燃料所發(fā)出的熒光通過。在黑暗背景的襯托下，發(fā)出熒光的樣品很容易被觀察。當(dāng)前第13頁\共有66頁\編于星期五\21點(diǎn)Theopticalsystemofamodernfluorescencemicroscope.Afiltersetconsistsoftwobarrierfilters(1and3)andadichroic(beam-splitting)mirror(2).Inthisexamplethefiltersetfordetectionofthefluorescentmoleculefluoresceinisshown.熒光顯微鏡的光路圖當(dāng)前第14頁\共有66頁\編于星期五\21點(diǎn)Fluorescentdyes.Thestructuresoffluoresceinandtetramethylrhodamine,twodyesthatarecommonlyusedforfluorescencemicroscopy.Fluoresceinemitsgreenlight,whereastherhodaminedyeemitsredlight.熒光染料分子當(dāng)前第15頁\共有66頁\編于星期五\21點(diǎn)熒光顯微鏡的應(yīng)用B：不同熒光素所需激發(fā)波長與所產(chǎn)生的熒光波長比較C：細(xì)胞有絲分裂中期的觀察。當(dāng)前第16頁\共有66頁\編于星期五\21點(diǎn)熒光顯微鏡觀察真菌的細(xì)胞核MDFA/4d/DAPIstain(400×)WT?cdc15CM由于熒光顯微鏡的暗視野為熒光信號提供了強(qiáng)反差背景，非常微弱的熒光信號亦可得以分辨。當(dāng)前第17頁\共有66頁\編于星期五\21點(diǎn)（三）激光共焦點(diǎn)掃描顯微鏡特點(diǎn)：排除焦平面以外光的干擾，增強(qiáng)圖像反差和提高分辨率(1.4-1.7)，可重構(gòu)樣品的三維結(jié)構(gòu),主要用來研究細(xì)胞亞結(jié)構(gòu)。激光共聚焦掃描顯微鏡（Confocallaserscanningmicroscope，CLSM）：

用激光作掃描光源，逐點(diǎn)、逐行、逐面快速掃描成像，掃描的激光與熒光收集共用一個(gè)物鏡，物鏡的焦點(diǎn)即掃描激光的聚焦點(diǎn)，也是瞬時(shí)成像的物點(diǎn)。當(dāng)前第18頁\共有66頁\編于星期五\21點(diǎn)激光掃描共焦顯微鏡的原理圖原理：激光束經(jīng)雙色鏡反射后，通過物鏡聚集到樣品某一焦點(diǎn)；從焦點(diǎn)發(fā)射的熒光經(jīng)透鏡匯聚成像，被檢測出；其他部位發(fā)射的熒光不聚焦成像，不能檢測到。當(dāng)前第19頁\共有66頁\編于星期五\21點(diǎn)熒光顯微鏡（A）和激光掃描共焦顯微鏡（B）所觀察圖像的比較小鼠腎小球的厚切片當(dāng)前第20頁\共有66頁\編于星期五\21點(diǎn)Figure3-14.Comparisonofconventionalandconfocalfluorescencemicroscopy.Thesetwomicrographsareofthesameintactgastrula-stageDrosophilaembryothathasbeenstainedwithafluorescentprobeforactinfilaments.Theconventional,unprocessedimage(A)isblurredbythepresenceoffluorescentstructuresaboveandbelowtheplaneoffocus.Intheconfocalimage(B),thisout-of-focusinformationisremoved,whichresultsinacrispopticalsectionofthecellintheembryo.

當(dāng)前第21頁\共有66頁\編于星期五\21點(diǎn)相差顯微鏡（phase-contrastmicroscope）

一種將相位差轉(zhuǎn)變成振幅差（明暗差）的顯微鏡，可觀察不染色的活細(xì)胞。利用樣品的不同位點(diǎn)的密度差，形成肉眼可見的明暗區(qū)別。微分干涉顯微鏡（differential-interferencemicroscope）

一種將樣品厚度上的微小區(qū)別轉(zhuǎn)化成明暗區(qū)別相差顯微鏡。錄像增差顯微鏡技術(shù)（video-enhancemicroscopy）（四）其它光學(xué)顯微鏡當(dāng)前第22頁\共有66頁\編于星期五\21點(diǎn)相差顯微鏡觀察真菌菌絲2dWT?cdc15CM3d當(dāng)前第23頁\共有66頁\編于星期五\21點(diǎn)兩種不同類型的光學(xué)顯微鏡所拍攝的圖像比較體外培養(yǎng)的MDCK細(xì)胞的圖像A:普通顯微鏡所拍B：相差顯微鏡所拍當(dāng)前第24頁\共有66頁\編于星期五\21點(diǎn)二、電子顯微鏡（一）、電子顯微鏡的基本知識1.電子顯微鏡與光學(xué)顯微鏡的基本區(qū)別2.電子顯微鏡的分辨本領(lǐng)與有效放大倍數(shù)3.電子顯微鏡的基本構(gòu)造（二）、主要電鏡制樣技術(shù)1.超薄切片技術(shù)2.負(fù)染色技術(shù)3.冷凍蝕刻技術(shù)4.電鏡三維重構(gòu)與低溫電鏡技術(shù)5.掃描電鏡技術(shù)當(dāng)前第25頁\共有66頁\編于星期五\21點(diǎn)二、電子顯微鏡技術(shù)當(dāng)前第26頁\共有66頁\編于星期五\21點(diǎn)電子顯微鏡的基本結(jié)構(gòu)（A）和成像原理（B）當(dāng)前第27頁\共有66頁\編于星期五\21點(diǎn)電子顯微鏡與光學(xué)顯微鏡的區(qū)別

顯微鏡分辨本領(lǐng)光源透鏡真空成像原理LMTEM200nm100nm0.1nm可見光（400-700）紫外光（約200nm)電子束（0.01-0.9）玻璃透鏡玻璃透鏡電磁透鏡不要求真空不要求真空要求真空1.33x10-5～1.33x10-3Pa利用樣品對光的吸收形成明暗反差和顏色變化利用樣品對電子的散射和透射形成明暗反差主要區(qū)別（1）光源不同光鏡為可見光或紫外線；電鏡為電子束（2）透鏡不同光鏡為玻璃；電鏡為電磁透鏡（3）真空系統(tǒng)（4）顯示記錄系統(tǒng)當(dāng)前第28頁\共有66頁\編于星期五\21點(diǎn)超薄切片技術(shù)固定、脫水、包埋、切片、染色?；疽螅杭?xì)胞精細(xì)結(jié)構(gòu)保存良好，不產(chǎn)生明顯的物質(zhì)凝聚、丟失或添加人工效應(yīng)等；切片厚度在500埃左右，最大不超過1000埃（1mm厚的樣品切成20000片；一個(gè)一般大小的細(xì)胞要切成300片）切片應(yīng)耐受電子束的轟擊，包埋介質(zhì)不發(fā)生變形；切片應(yīng)具有良好的反差；切片需均勻，沒有皺褶、刀痕及染色劑沉淀等缺陷。當(dāng)前第29頁\共有66頁\編于星期五\21點(diǎn)SpecimenPreparationforElectronMicroscopyThinSectioningforTEMThewaxsections:3-10um;ThePlasticultrathin-sectionsforTEM:40-50nmSectionsofLM:>5um;SectionsofTEM:<100nm

當(dāng)前第30頁\共有66頁\編于星期五\21點(diǎn)電鏡超薄切片樣本制備示意圖當(dāng)前第31頁\共有66頁\編于星期五\21點(diǎn)Figure3-20.Electronmicrographofaroot-tipcellstainedwithosmiumandotherheavymetalions.Thecellwall,nucleus,vacuoles,mitochondria,endoplasmicreticulum,Golgiapparatus,andribosomesareeasilyseen.當(dāng)前第32頁\共有66頁\編于星期五\21點(diǎn)超薄切片技術(shù)顯示的動(dòng)物細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)當(dāng)前第33頁\共有66頁\編于星期五\21點(diǎn)家蠶細(xì)小病毒負(fù)染色電鏡照片（病毒直徑20nm）當(dāng)前第34頁\共有66頁\編于星期五\21點(diǎn)II.Scanningelectronmicroscope(SEM)

ImagesofsurfacescanbeobtainedbySEM;Critical-pointdrying;Range:15－150,000X.Resolution:5nm當(dāng)前第35頁\共有66頁\編于星期五\21點(diǎn)Figure3-23.Scanningelectronmicroscopy.Scanningelectronmicrographofthestereociliaprojectingfromahaircellintheinnerearofabullfrog(A).Forcomparison,thesamestructureisshownbydifferential-interference-contrastlightmicroscopy(B)andbythin-sectionelectronmicroscopy(C).當(dāng)前第36頁\共有66頁\編于星期五\21點(diǎn)

Figure3-32.Cellsinculture.Scanningelectronmicrographofratfibroblastsgrowingontheplasticsurfaceofatissue-culturedish.當(dāng)前第37頁\共有66頁\編于星期五\21點(diǎn)掃描電鏡原理示意圖（A），掃描電鏡下可清晰地顯示原生動(dòng)物四膜蟲表面的纖毛和口器（B）當(dāng)前第38頁\共有66頁\編于星期五\21點(diǎn)三、隧道掃描顯微鏡原理：掃描探針與樣品接觸或達(dá)到很近距離時(shí)，即產(chǎn)生彼此間相互作用力，如量子力學(xué)中的隧道效應(yīng)（隧道電流）、原子間作用力、磁力、摩擦力等，并在計(jì)算機(jī)顯示出來，從而反映出樣品表面形貌信息、電特性或磁特性等。特點(diǎn)：（1）可對晶體或非晶體成像，無需復(fù)雜計(jì)算，且分辨本領(lǐng)高。（側(cè)分辨率為0.1～0.2nm，縱分辨率可達(dá)0.01nm）； （2）可實(shí)時(shí)得到樣品表面三維圖象，可測量厚度信息；（3）可在真空、大氣、液體等多種條件下工作；非破壞性測量； （4）可連續(xù)成像，進(jìn)行動(dòng)態(tài)觀察。用途：納米生物學(xué)研究領(lǐng)域中的重要工具,在原子水平上揭示樣本表面的結(jié)構(gòu)。當(dāng)前第39頁\共有66頁\編于星期五\21點(diǎn)幾種顯微鏡可觀察的樣品大小（箭頭之間的范圍）及其分辨能力（右側(cè)箭頭所指位置）分辨率：能區(qū)分開兩個(gè)質(zhì)點(diǎn)間的最小距離眼睛、光學(xué)顯微鏡和電子顯微鏡的分辨率分別為：0.2mm、0.2μm和0.2nm。當(dāng)前第40頁\共有66頁\編于星期五\21點(diǎn)第二節(jié)細(xì)胞及其組分的分析方法一、用超離心技術(shù)分離細(xì)胞組分二、細(xì)胞成分的細(xì)胞化學(xué)顯示方法三、特異蛋白抗原的定位與定性四、細(xì)胞內(nèi)特異核酸的定位與定性五、定量細(xì)胞化學(xué)分析與細(xì)胞分選技術(shù)當(dāng)前第41頁\共有66頁\編于星期五\21點(diǎn)一、用超離心技術(shù)分離細(xì)胞組分用差速離心法分離細(xì)胞勻漿中的各種細(xì)胞組分當(dāng)前第42頁\共有66頁\編于星期五\21點(diǎn)用密度梯度離心分離細(xì)胞組分示意圖用一定的介質(zhì)在離心管內(nèi)形成一連續(xù)或不連續(xù)的密度梯度，將細(xì)胞混懸液或勻漿置于介質(zhì)的頂部，通過重力或離心力場的作用使細(xì)胞分層、分離。當(dāng)前第43頁\共有66頁\編于星期五\21點(diǎn)二、細(xì)胞成分的細(xì)胞化學(xué)顯示方法為了測定蛋白質(zhì)、核酸、多糖和脂質(zhì)等細(xì)胞組分，通常利用一些顯色劑與所檢測物質(zhì)中一些特殊基團(tuán)特異性結(jié)合（反應(yīng)）的特征，通過顯色劑在細(xì)胞中的定位及顏色的深淺來判斷某種物質(zhì)在細(xì)胞中的分布和相對含量。當(dāng)前第44頁\共有66頁\編于星期五\21點(diǎn)A:直接免疫熒光標(biāo)記技術(shù)：利用偶聯(lián)熒光分子的抗體與細(xì)胞或細(xì)胞切片進(jìn)行孵育，使抗體和相應(yīng)抗原結(jié)合，在熒光顯微鏡下對抗原進(jìn)行定位的技術(shù)。B:間接免疫熒光標(biāo)記技術(shù)：即不帶熒光標(biāo)記的第一抗體與相應(yīng)抗原孵育形成復(fù)合物后，再用熒光標(biāo)記的第二抗體識別第一抗體，從而顯示抗原所在位置。

三、特異蛋白抗原的定位與定性當(dāng)前第45頁\共有66頁\編于星期五\21點(diǎn)免疫膠體金電鏡原位雜交技術(shù)的基本原理與應(yīng)用（膀胱上皮細(xì)胞膜蛋白的分布：箭頭所指）當(dāng)前第46頁\共有66頁\編于星期五\21點(diǎn)四、細(xì)胞內(nèi)特異核酸的定位與定性原位雜交（insituhybridization）：通過單鏈RNA或DNA探針對細(xì)胞或組織中的基因或mRNA進(jìn)行定位的技術(shù)。

當(dāng)前第47頁\共有66頁\編于星期五\21點(diǎn)用原位雜交技術(shù)顯示Z13基因在受精后1d的斑馬魚胚胎的體節(jié)、眼和松果體中的表達(dá)（箭頭所指）當(dāng)前第48頁\共有66頁\編于星期五\21點(diǎn)五、定量細(xì)胞化學(xué)分析與細(xì)胞分選技術(shù)流式細(xì)胞術(shù)：一種用于核酸、蛋白質(zhì)、染色體和細(xì)胞等的定量、分離和分選的技術(shù)。當(dāng)前第49頁\共有66頁\編于星期五\21點(diǎn)流式細(xì)胞儀的工作原理當(dāng)前第50頁\共有66頁\編于星期五\21點(diǎn)第三節(jié)細(xì)胞培養(yǎng)與細(xì)胞工程一、細(xì)胞培養(yǎng)二、細(xì)胞工程當(dāng)前第51頁\共有66頁\編于星期五\21點(diǎn)一、細(xì)胞培養(yǎng)

原代培養(yǎng)：用直接從生物體獲得的細(xì)胞所進(jìn)行的培養(yǎng)的過程。

傳代培養(yǎng)：對原代培養(yǎng)的細(xì)胞進(jìn)行分割，重新接種進(jìn)行再培養(yǎng)的過程。細(xì)胞系：來源于動(dòng)物或植物細(xì)胞，能夠在體外培養(yǎng)過程中連續(xù)增殖的細(xì)胞群體。當(dāng)前第52頁\共有66頁\編于星期五\21點(diǎn)動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)A：正在生長分裂的HeLe（宮頸瘤）細(xì)胞B:長滿單層的CHO（中國倉鼠卵巢）原代細(xì)胞當(dāng)前第53頁\共有66頁\編于星期五\21點(diǎn)植物細(xì)胞培養(yǎng)單倍體細(xì)胞培養(yǎng)原生質(zhì)體培養(yǎng)

當(dāng)前第54頁\共有66頁\編于星期五\21點(diǎn)二、細(xì)胞工程細(xì)胞融合：兩個(gè)細(xì)胞通過質(zhì)膜的接觸并相互融合形成一個(gè)細(xì)胞的過程。融合后的細(xì)胞只有一個(gè)連續(xù)的細(xì)胞質(zhì)膜。單克隆抗體：單個(gè)細(xì)胞克隆所合成針對一種抗原決定簇的抗體。雜交瘤技術(shù)：由一個(gè)正常的產(chǎn)生抗體的B淋巴細(xì)胞與一個(gè)惡性骨髓瘤細(xì)胞融合產(chǎn)生的雜種細(xì)胞系。具有無限增殖和產(chǎn)生單克隆抗體的特性。細(xì)胞拆合：即先把細(xì)胞核與細(xì)胞質(zhì)分離開來，然后把不同來源的核體和胞質(zhì)體相互融合，形成核-質(zhì)雜交細(xì)胞。當(dāng)前第55頁\共有66頁\編于星期五\21點(diǎn)單克隆抗體制備過程體外培養(yǎng)當(dāng)前第56頁\共有66頁\編于星期五\21點(diǎn)應(yīng)用顯微注射技術(shù)進(jìn)行細(xì)