細胞工程第五章細胞融合與單克隆抗體

本章主要內(nèi)容：細胞融合的基本概念人工誘導(dǎo)細胞融合技術(shù)雜種細胞的篩選細胞雜交瘤技術(shù)與單克隆抗體人源單克隆抗體當(dāng)前第1頁\共有82頁\編于星期四\21點1細胞融合（cellfusion)，是指在離體條件下將不同種生物或同種生物不同類型的單細胞通過無性方式融合成一個雜合細胞的技術(shù)。細胞融合技術(shù)的出現(xiàn)標(biāo)志著細胞工程的誕生！一、細胞融合當(dāng)前第2頁\共有82頁\編于星期四\21點2Muller于1838年觀察到脊椎動的腫瘤細胞能在體內(nèi)自發(fā)地融合產(chǎn)生多核的腫瘤細胞。Virchow于1858年描述了正常組織、發(fā)炎組織以及腫瘤組織中的多核細胞現(xiàn)象。Luginbuhl于1873年觀察到天花病人的血液中也有多核的血細胞存在。Lange于1875年第一個觀察到脊椎動物（蛙類）的血液細胞發(fā)生融合的過程。Cienkawski(1876)、Buck(1877)、Geddes(1880)在無脊椎動中發(fā)現(xiàn)了細胞合并現(xiàn)象。當(dāng)前第3頁\共有82頁\編于星期四\21點3自發(fā)細胞融合（一）細胞膜融合

受精過程（二）體內(nèi)細胞的自發(fā)融合

1、肌管的形成2、胚胎著床3、巨細胞和破骨細胞的形成4、腫瘤細胞的融合破骨細胞受精當(dāng)前第4頁\共有82頁\編于星期四\21點4當(dāng)前第5頁\共有82頁\編于星期四\21點5細胞融合的意義理論上說任何細胞，都有可能通過體細胞雜交而成為新的生物資源。這對于種質(zhì)資源的開發(fā)和利用具有深遠的意義。融合過程不存在有性雜交過程中的種性隔離機制的限制，為遠緣物種間的遺傳物質(zhì)交換提供了有效途徑。體細胞雜交產(chǎn)生的雜種細胞含有來自雙親的核外遺傳系統(tǒng)，在雜種的分裂和增殖過程中雙親的葉綠體、線粒體DNA亦可發(fā)生重組，從而產(chǎn)生新的核外遺傳系統(tǒng)。淋巴細胞雜交瘤和單克隆抗體的制備。當(dāng)前第6頁\共有82頁\編于星期四\21點6二、人工誘導(dǎo)細胞融合

誘導(dǎo)細胞融合的主要方法有：病毒誘導(dǎo)融合化學(xué)融合劑誘導(dǎo)融合物理方法（電融合）

當(dāng)前第7頁\共有82頁\編于星期四\21點7二、人工誘導(dǎo)細胞融合

（一）病毒誘導(dǎo)的細胞融合

有許多種類的病毒能介導(dǎo)細胞融合，如皰疹病毒、副粘液病毒、雞新城疫病毒等。其中最常用的是滅活的仙臺病毒（HVJ）,為RNA病毒。

當(dāng)前第8頁\共有82頁\編于星期四\21點8滅活的病毒顆粒黏附于細胞表面細胞膜被病毒顆粒穿通細胞膜連接細胞融合，形成雜種細胞（細胞膜具有一定的流動性）生物法：滅活的病毒（喪失感染性、保留抗原結(jié)構(gòu)）當(dāng)前第9頁\共有82頁\編于星期四\21點9(二)化學(xué)方法誘導(dǎo)細胞融合化學(xué)融合劑主要有高級脂肪酸衍生物（如甘油-醋酸酯、油酸、油胺等）、脂質(zhì)體（如磷脂酰膽堿、磷脂酰絲氨酸等）、鈣離子、水溶性高分子化合物（如聚乙二醇）、水溶性蛋白質(zhì)和多肽（如牛血清白蛋白、多聚L-賴氨酸等），其中最常用的是聚乙二醇（PEG）。優(yōu)點是易得，用法簡單，融合效果穩(wěn)定。當(dāng)前第10頁\共有82頁\編于星期四\21點10（三）物理方法誘導(dǎo)細胞融合電融合法是80年代出現(xiàn)的細胞融合技術(shù)，在直流電脈沖的誘導(dǎo)下，細胞膜表面的氧化還原電位發(fā)生改變，使異種細胞粘合并發(fā)生質(zhì)膜瞬間破裂，進而質(zhì)膜開始連接，直到閉和成完整的膜，形成融合體。電融合法的優(yōu)點：融合率高、重復(fù)性強、對細胞傷害??；裝置精巧、方法簡單、可在顯微鏡下觀察或錄像觀察融合過程；免去PEG誘導(dǎo)后的洗滌過程、誘導(dǎo)過程可控性強。當(dāng)前第11頁\共有82頁\編于星期四\21點11電融合的基本過程：細胞膜的接觸：當(dāng)原生質(zhì)體置于電導(dǎo)率很低的溶液中時，電場通電后，電流即通過原生質(zhì)體而不是通過溶液，其結(jié)果是原生質(zhì)體在電場作用下極化而產(chǎn)生偶極子，從而使原生質(zhì)體緊密接觸排列成串；膜的擊穿：原生質(zhì)體成串排列后，立即給予高頻直流脈沖就可以使原生質(zhì)膜擊穿，從而導(dǎo)致兩個緊密接觸的細胞融合在一起。

電融合誘導(dǎo)法原理示意圖當(dāng)前第12頁\共有82頁\編于星期四\21點12三、雜種細胞的篩選根據(jù)已經(jīng)發(fā)生融合的細胞中所含有核的類型，可將其分為以下幾種類型：異核細胞：非同源細胞的融合體。同核細胞：兩個相同細胞的融合體。多核細胞：含有雙親不同比例核物質(zhì)的融合體。當(dāng)前第13頁\共有82頁\編于星期四\21點13基于酶缺陷型細胞和藥物抗性所建立的雜種篩選基于營養(yǎng)缺陷型細胞所建立的雜種篩選由溫度敏感型細胞組成的雜種細胞的篩選具有所需性狀雜種細胞的篩選常用的雜種細胞篩選方法當(dāng)前第14頁\共有82頁\編于星期四\21點14四、細胞雜交瘤技術(shù)與單克隆抗體當(dāng)前第15頁\共有82頁\編于星期四\21點15

免疫器官：免疫細胞生成、成熟或集中分布的場所，包括骨髓、胸腺、脾、淋巴結(jié)等

免疫細胞（發(fā)揮免疫作用的細胞）：1．吞噬細胞2．淋巴細胞（起源骨髓中的造血干細胞）T細胞（在胸腺中成熟）B細胞（在骨髓中成熟）

免疫活性物質(zhì)：由免疫細胞或其他細胞產(chǎn)生的發(fā)揮免疫作用的物質(zhì)，包括抗體、淋巴因子、溶菌酶等當(dāng)前第16頁\共有82頁\編于星期四\21點16當(dāng)前第17頁\共有82頁\編于星期四\21點17基本概念抗原抗體抗原決定簇（抗原表位）細胞克隆多克隆抗體單克隆抗體當(dāng)前第18頁\共有82頁\編于星期四\21點18抗原（antigen，Ag），是指一種能刺激人或動物機體產(chǎn)生抗體或致敏淋巴細胞，并能與這些產(chǎn)物在體內(nèi)或體外發(fā)生特異性反應(yīng)的物質(zhì)?？乖幕拘再|(zhì)具有異物性、大分子性和特異性。異物性是指進入機體組織內(nèi)的抗原物質(zhì)，必須與該機體組織細胞的成分不相同。大分子性是指構(gòu)成抗原的物質(zhì)通常是相對分子質(zhì)量大于10000的大分子物質(zhì)，分子量越大，抗原性越強。特異性是指一種抗原只能與相應(yīng)的抗體或效應(yīng)T細胞發(fā)生特異性結(jié)合。當(dāng)前第19頁\共有82頁\編于星期四\21點19抗體（antibody,Ab)是機體免疫系統(tǒng)在抗原刺激下，由B細胞或記憶細胞增殖分裂成漿細胞所產(chǎn)生的可與相應(yīng)抗原發(fā)生特異性結(jié)合的免疫球蛋白。主要存在于血清等體液中，能與相應(yīng)抗原特異性地結(jié)合，具有免疫功能。當(dāng)前第20頁\共有82頁\編于星期四\21點20當(dāng)前第21頁\共有82頁\編于星期四\21點21抗原決定簇（Antigenicdeterminant）是指抗原分子中決定抗原特異性的特殊化學(xué)基團，又稱表位(epitope).抗原以抗原決定簇與相應(yīng)淋巴細胞的抗原受體結(jié)合而激活淋巴細胞引起免疫應(yīng)答。淋巴細胞表面的抗原識別受體通過識別抗原決定簇而區(qū)分“自身”與“異己”?？乖彩且钥乖瓫Q定簇與相應(yīng)抗體特異性結(jié)合而發(fā)生反應(yīng)的。當(dāng)前第22頁\共有82頁\編于星期四\21點22細胞克隆：由一個細胞增殖而成的細胞集團當(dāng)前第23頁\共有82頁\編于星期四\21點23當(dāng)前第24頁\共有82頁\編于星期四\21點24多克隆抗體（Polyclonalantibody,PcAb）：針對多種抗原決定簇的混合抗體當(dāng)前第25頁\共有82頁\編于星期四\21點25單克隆抗體（Monoclonalantibody,McAb）由單個B細胞克隆產(chǎn)生的針對單一抗原決定簇的同源抗體當(dāng)前第26頁\共有82頁\編于星期四\21點26

當(dāng)前第27頁\共有82頁\編于星期四\21點271975年科勒(Kohler)和米爾斯坦(Milstein)將小鼠免疫細胞與腫瘤細胞融合，培養(yǎng)出既能迅速生長無限繁殖又可分泌特異性抗體的雜交瘤細胞。從而獲得針對某一特殊抗原決定簇的單克隆抗體。當(dāng)前第28頁\共有82頁\編于星期四\21點28一個B淋巴細胞只分泌一種特異性抗體骨髓瘤細胞（癌細胞）能無限增殖雜種細胞動物細胞培養(yǎng)技術(shù)設(shè)計方案：動物細胞融合創(chuàng)始人：米爾斯坦單克隆抗體既能產(chǎn)生特異性抗體，又能大量繁殖當(dāng)前第29頁\共有82頁\編于星期四\21點29

單克隆和多克隆抗體的比較和用途特異性敏感性均一性McAbPcAb低差無高強有1、用于免疫學(xué)檢測，輔助臨床診斷2、McAb用于親和層析，分離微量可溶性抗原3、標(biāo)記的McAb用于基礎(chǔ)研究，了解細胞分化等4、制備生物導(dǎo)彈用于腫瘤、移植等的臨床治療。當(dāng)前第30頁\共有82頁\編于星期四\21點30單克隆抗體在醫(yī)學(xué)中的應(yīng)用檢驗醫(yī)學(xué)診斷試劑（1）病原微生物抗原抗體的檢測（2）腫瘤抗原的檢測（3）免疫細胞及其亞群的檢測（4）激素測定（5）細胞因子的測定蛋白質(zhì)的提純腫瘤的導(dǎo)向治療和放射免疫顯像技術(shù)酶標(biāo)儀當(dāng)前第31頁\共有82頁\編于星期四\21點31動物細胞融合技術(shù)B、BB、B瘤、瘤瘤、瘤只有雜種細胞才能活動物細胞培養(yǎng)五、單克隆抗體制備過程獲得產(chǎn)生相應(yīng)抗體的B淋巴細胞篩選陽性雜交細胞HAT培養(yǎng)基單抗的純化、檢測當(dāng)前第32頁\共有82頁\編于星期四\21點32動物細胞融合技術(shù)B、BB、B瘤、瘤瘤、瘤只有雜種細胞才能活動物細胞培養(yǎng)五、單克隆抗體制備過程獲得產(chǎn)生相應(yīng)抗體的B淋巴細胞篩選陽性雜交細胞HAT培養(yǎng)基單抗的純化、檢測當(dāng)前第33頁\共有82頁\編于星期四\21點33B、BB、B瘤、瘤瘤、瘤只有目的雜種細胞才能活HAT培養(yǎng)基當(dāng)前第34頁\共有82頁\編于星期四\21點34HAT選擇培養(yǎng)基HAT選擇培養(yǎng)基組分

次黃嘌呤核苷酸（hypoxanthine,H)氨甲喋呤（aminopterin,A)（二氫葉酸還原酶抑制劑）胸腺嘧啶核苷酸（thymidine,T)當(dāng)前第35頁\共有82頁\編于星期四\21點35細胞DNA合成途徑1.主要途徑：

氨基酸谷氨酰胺尿核苷單磷酸

葉酸及其衍生物（必不可少的媒介）2.補救途徑：次黃嘌呤-鳥嘌呤磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶（HGPRT）

胸腺嘧啶核苷酸激酶（TK）原料：次黃嘌呤核苷酸（H）、胸腺嘧啶核苷酸（T）當(dāng)前第36頁\共有82頁\編于星期四\21點36B、B×B、B×瘤

—、瘤—×瘤—、瘤—只有目的雜種細胞才能活HAT培養(yǎng)基××××HGPRT—/TK—√當(dāng)前第37頁\共有82頁\編于星期四\21點378-雜氮鳥嘌呤Br-脫氧嘧啶核苷HGPRT—TK—當(dāng)前第38頁\共有82頁\編于星期四\21點38篩選陽性雜交細胞酶聯(lián)免疫吸附測定ELISA當(dāng)前第39頁\共有82頁\編于星期四\21點39當(dāng)前第40頁\共有82頁\編于星期四\21點40免疫標(biāo)記技術(shù)放射物標(biāo)記技術(shù)酶標(biāo)技術(shù)免疫熒光技術(shù)其他標(biāo)記技術(shù)酶聯(lián)免疫吸附技術(shù)酶免疫組化技術(shù)雙抗體夾心法競爭法雙抗原夾心法間接法雙位一點法當(dāng)前第41頁\共有82頁\編于星期四\21點41當(dāng)前第42頁\共有82頁\編于星期四\21點42ELISA原理使抗原或抗體結(jié)合到某種固相載體表面，并保持其免疫活性使抗原或抗體與某種酶連接成酶標(biāo)抗原或抗體，這種酶標(biāo)抗原或抗體既保留其免疫活性，又保留酶的活性結(jié)合在固相載體上的酶量與標(biāo)本中受檢物質(zhì)的量成一定的比例。加入酶反應(yīng)的底物后，底物被酶催化變?yōu)橛猩a(chǎn)物，產(chǎn)物的量與標(biāo)本中受檢物質(zhì)的量直接相關(guān)當(dāng)前第43頁\共有82頁\編于星期四\21點43ELISA基本的實驗過程包被：將已知抗原或抗體通過物理吸附到固相載體表面，使抗原或抗體固相化抗原抗體反應(yīng)：先后加入被檢標(biāo)本和酶結(jié)合物，使之與固相抗原或抗體發(fā)生免疫反應(yīng)而被結(jié)合固定酶促反應(yīng)：在反應(yīng)體系中加入酶作用的底物，使發(fā)生酶促反應(yīng)而顯色當(dāng)前第44頁\共有82頁\編于星期四\21點44當(dāng)前第45頁\共有82頁\編于星期四\21點45封閉當(dāng)前第46頁\共有82頁\編于星期四\21點46當(dāng)前第47頁\共有82頁\編于星期四\21點47當(dāng)前第48頁\共有82頁\編于星期四\21點48當(dāng)前第49頁\共有82頁\編于星期四\21點49當(dāng)前第50頁\共有82頁\編于星期四\21點50當(dāng)前第51頁\共有82頁\編于星期四\21點51當(dāng)前第52頁\共有82頁\編于星期四\21點52當(dāng)前第53頁\共有82頁\編于星期四\21點53當(dāng)前第54頁\共有82頁\編于星期四\21點54動物細胞融合技術(shù)B、BB、B瘤、瘤瘤、瘤只有雜種細胞才能活動物細胞培養(yǎng)五、單克隆抗體制備過程獲得產(chǎn)生相應(yīng)抗體的B淋巴細胞篩選陽性雜交細胞HAT培養(yǎng)基單抗的純化、檢測當(dāng)前第55頁\共有82頁\編于星期四\21點55當(dāng)前第56頁\共有82頁\編于星期四\21點56當(dāng)前第57頁\共有82頁\編于星期四\21點57當(dāng)前第58頁\共有82頁\編于星期四\21點58當(dāng)前第59頁\共有82頁\編于星期四\21點59當(dāng)前第60頁\共有82頁\編于星期四\21點60當(dāng)前第61頁\共有82頁\編于星期四\21點61當(dāng)前第62頁\共有82頁\編于星期四\21點62視頻：單克隆抗體的制備當(dāng)前第63頁\共有82頁\編于星期四\21點63動物細胞融合技術(shù)B、BB、B瘤、瘤瘤、瘤只有雜種細胞才能活動物細胞培養(yǎng)五、單克隆抗體制備過程獲得產(chǎn)生相應(yīng)抗體的B淋巴細胞篩選陽性雜交細胞HAT培養(yǎng)基單抗的純化、檢測當(dāng)前第64頁\共有82頁\編于星期四\21點64單抗純化方法：鹽析凝膠過濾離子交換層析親和層析法當(dāng)前第65頁\共有82頁\編于星期四\21點65用中性鹽使蛋白質(zhì)沉淀析出的方法為鹽析。大量的鹽加入到蛋白溶液中，高濃度的鹽離子有很強的水化力，可奪取蛋白質(zhì)的水化層，使蛋白質(zhì)膠粒失水發(fā)生凝聚而沉淀析出。

血清50%飽和度硫酸胺

上清（清蛋白）沉淀（球蛋白）33%飽和度硫酸胺上清沉淀擬球蛋白r球蛋白（1）鹽析法當(dāng)前第66頁\共有82頁\編于星期四\21點66（2）凝膠過濾法干燥的凝膠顆粒吸水后形成了多孔膠粒，將蛋白質(zhì)溶液加在凝膠柱上進行洗脫時，大分子蛋白不能穿過凝膠網(wǎng)孔進入膠粒內(nèi)，留在膠粒間隙的溶液中，隨洗脫液最先流出，小分子蛋白可穿過凝膠網(wǎng)孔進入膠粒內(nèi)，受到凝膠的阻留，向下移動較慢洗脫出來較慢，據(jù)此將不同大小的蛋白質(zhì)分離出來。交聯(lián)葡聚糖凝膠(Sephadex)瓊脂糖凝膠(Sepharose)當(dāng)前第67頁\共有82頁\編于星期四\21點67（3）離子交換層析法DEAE纖維素：結(jié)合溶液中帶負電荷的蛋白質(zhì)，又稱陰離子交換劑CM纖維素：結(jié)合溶液中帶正電荷的蛋白質(zhì)，又稱陽離子交換劑當(dāng)前第68頁\共有82頁\編于星期四\21點68（4）親和層析法將抗原（或抗體）連接到固相載體上，特異性吸附液相中的抗體（或抗原），形成抗原抗體復(fù)合物，然后改變條件，使抗原抗體復(fù)合物解離洗脫出純化的抗體（或抗原）當(dāng)前第69頁\共有82頁\編于星期四\21點69單克隆抗體特性理化性狀高度均一，生物活性專一，只與一種抗原表位發(fā)生反應(yīng)，特異性強，純度高，易于實驗標(biāo)準(zhǔn)化和大量制備當(dāng)前第70頁\共有82頁\編于星期四\21點70單抗鑒定方法：效價（凝集反應(yīng)、Elisa、放免）特異性（免疫熒光、Elisa、間接血凝、免疫印跡）當(dāng)前第71頁\共有82頁\編于星期四\21點71原理：WesternBlot采用的是聚丙烯酰胺凝膠電泳，經(jīng)過PAGE分離的蛋白質(zhì)樣品，轉(zhuǎn)移到固相載體（例如硝酸纖維素膜NC膜）上，固相載體以非共價鍵形式吸附蛋白質(zhì)，且能保持電泳分離的多肽類型及其生物學(xué)活性不變。以固相載體上的蛋白質(zhì)或多肽作為抗原，與對應(yīng)的抗體起免疫反應(yīng)，再與酶或同位素標(biāo)記的第二抗體起反應(yīng)，經(jīng)過底物顯色或放射自顯影以檢測電泳分離的特異性目的基因表達的蛋白成分。該技術(shù)也廣泛應(yīng)用于檢測蛋白水平的表達。當(dāng)前第72頁\共有