第五章噬菌體載體和

第五章噬菌體載體和柯斯載體1234561.噬菌體的概念專門侵害細(xì)菌和放線菌等微生物的病毒稱為噬菌體（phage）。

從形態(tài)學(xué)角度又可將其分為三種不同的基本類型。有尾部結(jié)構(gòu)的二十面體型：

1、2、3群都有尾部，1群具有收縮性的尾鞘，2群有長的非收縮性的尾部，3群的尾部很短，無尾部結(jié)構(gòu)的二十面體型：4、5兩群沒有尾部，兩者的區(qū)別是4群外殼頂端蛋白質(zhì)衣殼粒較大，5群則較小，線狀體型：6群為纖線形的噬菌體，第一節(jié)噬菌體的一般生物學(xué)特性病毒基本結(jié)構(gòu)：

DNA（或RNA）+外殼蛋白感染細(xì)菌的病毒，稱為噬菌體。分類（根據(jù)病毒與宿主的關(guān)系）： 溫和性病毒：

溶原性增殖→構(gòu)建病毒載體 烈性病毒：

溶菌性增殖→改造后噬菌體的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)噬菌體的構(gòu)造形式如圖,頭部呈現(xiàn)六角晶柱形，經(jīng)過染色處理和高度放大，可觀察到頭部呈20面體的結(jié)構(gòu)，由蛋白質(zhì)組成其外殼，內(nèi)含核酸。尾部由一個(gè)中空的管狀體尾髓和可收縮的蛋白質(zhì)尾鞘所組成。與頭部相接處呈現(xiàn)收隘部分，稱為頸部。尾端具有六邊形的基片，其上生出六個(gè)刺突，并纏繞著六根細(xì)長的尾絲。噬菌體的化學(xué)成分噬菌體的化學(xué)組成，絕大部分是核酸和蛋白質(zhì)，占病毒粒子重量的90%以上，其中核酸占40%～50%。噬菌體按核酸類型分有DNA和RNA噬菌體。一般多為DNA噬菌體，但近年來發(fā)現(xiàn)有不少噬菌體所含的核酸是RNA。噬菌體中核酸鏈有單鏈的也有雙鏈的，故有雙鏈環(huán)型DNA,單鏈環(huán)形DNA,單鏈線型DNA,單鏈線型RNA等多種形式。1、2、3三群由雙鏈DNA組成；4、6群為DNA單鏈；5群為RNA單鏈。某些噬菌體的核酸中含有異常堿基，如大腸桿菌T系偶數(shù)噬菌體，無胞嘧啶而代之以5-羥甲胞嘧啶。某些枯草菌噬菌體的DNA中無胸腺嘧啶而代之以尿嘧啶或羥甲基尿嘧啶。感染效率高得驚人，如：一個(gè)噬菌體顆粒經(jīng)四次感染，可使數(shù)十億細(xì)菌致死。將少量的噬菌體顆粒加入高濃度的細(xì)菌培養(yǎng)物中，在第一次裂解前涂板，細(xì)菌的裂解反應(yīng)，以最初被感染的細(xì)胞所在的位置為中心，慢慢向四周擴(kuò)散，最后在瓊脂糖平板上形成大量的噬菌斑。噬菌斑，即感染的細(xì)菌細(xì)胞被噬菌體裂解之后留下的空斑。二．噬菌體的感染性噬菌體對(duì)寄主細(xì)胞的感染作用，是一種相當(dāng)復(fù)雜的生理生化過程。噬菌體DNA盤旋成團(tuán)，被緊密地包裹在由蛋白質(zhì)外殼組成的頭部結(jié)構(gòu)內(nèi)。而當(dāng)噬菌體同敏感的細(xì)菌細(xì)胞接觸時(shí)，首先是它的尾部便會(huì)粘著到細(xì)胞壁上，與此同時(shí)，尾部蛋白質(zhì)發(fā)生收縮作用，迫使頭部中的DNA注入到被感染的細(xì)菌細(xì)胞中去。一旦噬菌體的DNA注入到細(xì)胞內(nèi)之后，在細(xì)菌RNA聚合酶的作用下，它們所編碼的噬菌體特有的基因便被轉(zhuǎn)錄形成相應(yīng)的RNA分子，后者又利用細(xì)菌核糖體轉(zhuǎn)譯成噬菌體蛋白質(zhì)。在噬菌體感染的早期階段，某些由噬菌體編碼合成的蛋白質(zhì)，會(huì)使細(xì)菌的DNA降解成單核苷酸。這樣，細(xì)菌賴以進(jìn)行增殖所必須的全部遺傳信息，便將喪失殆盡，而最終導(dǎo)致死亡。有些噬菌體帶有編碼RNA聚合酶的基因，因此，這樣的噬菌體不必依賴于寄主細(xì)菌的聚合酶，就能使自身編碼的基因合成出信使RNA。

還有許多噬菌體，編碼有控制自身DNA復(fù)制的基因，而且還能利用由細(xì)菌DNA降解釋放出來的游離的單核苷酸作原料，合成自己的DNA。當(dāng)噬菌體的拷貝數(shù)高達(dá)上百個(gè)之后，幾分鐘內(nèi)，噬菌體的其它基因也就開動(dòng)起來，合成出新的頭部及尾部蛋白質(zhì)。頭部蛋白質(zhì)組裝成頭部，并把噬菌體的DNA包裹在其內(nèi)，繼而再同尾部蛋白質(zhì)連接起來，形成子代噬菌體顆粒。最后，噬菌體產(chǎn)生出一種特異性的酶，破壞寄主細(xì)胞壁并伴隨發(fā)生溶菌作用，使子代噬菌體顆粒釋放出來。吸附注入合成組裝釋放溶菌周期指噬菌體將DNA注入寄主細(xì)胞后很快環(huán)化，然后進(jìn)行自我復(fù)制、蛋白衣殼合成和新噬菌體顆粒的組裝，最后使寄主細(xì)胞破裂而釋放出大量的子代噬菌體。溶源周期中，注入寄主細(xì)胞的噬菌體DNA是整合到寄主細(xì)胞染色體上并可以隨著寄主細(xì)胞的分裂而進(jìn)行復(fù)制。只有雙鏈DNA的噬菌體才具有溶源周期。噬菌體生命周期溶源周期：噬菌體DNA整合到寄主細(xì)胞染色體DNA上，成為它的一個(gè)組成部分溶菌周期：產(chǎn)生大量子代噬菌體顆粒3.噬菌體的溶菌生命周期大多數(shù)噬菌體的生命周期為20-60分鐘噬菌體感染的基本過程是：

①吸附：噬菌體顆粒吸附到位于感染細(xì)胞表面的特殊接受器上。

②注入：噬菌體DNA穿過細(xì)胞壁注入寄主細(xì)胞。

③轉(zhuǎn)變：被感染的細(xì)菌細(xì)胞的功能發(fā)生變化，成為制造噬菌體顆粒的場(chǎng)所。

④合成：功能發(fā)生了轉(zhuǎn)變的寄主細(xì)胞大量合成噬菌體特有的核酸和蛋白質(zhì)。

⑤組裝：包裝了DNA的頭部和尾部組裝成噬菌體的顆粒，這個(gè)過程也叫做噬菌體的形態(tài)建成。

⑥釋放：新合成的子代噬菌體顆粒從寄主細(xì)胞內(nèi)釋放出來。t=0噬菌體吸附到寄主菌的細(xì)胞壁，大約在吸附的2秒鐘內(nèi)就會(huì)發(fā)生噬菌體DNA的注入；t=1寄主DNA、RNA和蛋白質(zhì)的合成反應(yīng)被全部關(guān)閉；t=2第一個(gè)噬菌體mRNA開始合成；t=3細(xì)菌DNA開始降解；t=5噬菌體DNA合成開始啟動(dòng)；t=9“晚期”噬菌體mRNA開始合成；t=12出現(xiàn)完整的頭部和尾部結(jié)構(gòu)；t=15出現(xiàn)頭一個(gè)完整的噬菌體顆粒；t=22細(xì)菌發(fā)生溶菌作用，釋放出約300個(gè)左右的噬菌體時(shí)粒E.coliT4噬菌體的生命周期（以分鐘記）4.噬菌體的溶源生命周期溫和噬菌體（teemperatephageh）：既能進(jìn)入溶菌生命周期又能進(jìn)入溶源生命周期的噬菌體，叫做溫和噬菌體。溶源性細(xì)菌（lgsogen）：具有一套完整的噬菌體基因組的細(xì)菌叫做溶源性細(xì)菌。如果有某些噬菌體基因缺失了，那么這樣的噬菌體就不能夠完成其溶菌周期，故含有這種噬菌體的細(xì)菌叫做缺陷性的溶源性細(xì)菌。溶源化（lysogenization）：用溫和的噬菌體感染細(xì)菌培養(yǎng)物使之形成溶源性細(xì)菌的過程，叫做溶源化。整合（integration）：如果噬菌體的DNA是被包容在寄主細(xì)菌染色體DNA之中，便叫做瞄合的噬菌體DNA。這種噬菌體DNA組入細(xì)菌染色體DNA的過程，稱為噬菌體DNA的整合或插入。以游離DNA分子形式存在的噬菌體DNA，叫做非整合的噬菌體DNA。原噬菌體（prophage）：在溶源性細(xì)菌內(nèi)存在的整合的或非整合的噬菌體DNA，叫做原噬菌體。原噬菌體中如有某些基因缺失了，便稱之為缺陷性的原噬菌體。（1）基本概念（2）溶源周期的主要特征

已知存在兩種不同類型的溶源周期，其中最普遍的一種是以λ噬菌體為原型，它具有如下一些主要特性：

①噬菌體的DNA分子注入細(xì)菌細(xì)胞。②經(jīng)過短暫的轉(zhuǎn)錄期之后，需要合成一種整合酶，于是轉(zhuǎn)錄活性便被一種阻遏物所關(guān)閉。

③噬菌體的DNA分子插入到細(xì)菌染色體基因組DNA上，變成原噬菌體。④細(xì)菌繼續(xù)生長、增殖，噬菌體的基因作為細(xì)菌染色體的一部分進(jìn)行復(fù)制。溶源性細(xì)菌有兩個(gè)重要特點(diǎn)：第一，溶源性細(xì)菌不能夠被頭一次感染并使之溶源化的同種噬菌體再感染。溶源性細(xì)菌所具有的這種抗御同種噬菌體再感染的特性，叫做超感染免疫性。第二，經(jīng)過許多世代之后，溶源性的細(xì)菌便能夠開始進(jìn)入溶菌周期，這個(gè)過程叫做溶源性細(xì)菌的誘發(fā)。在誘發(fā)過程中，噬菌體基因組以單一DNA片段的形式從寄主染色體DNA上刪除下來。（3）超感染免疫性

五．重組噬菌體的分離以噬菌體DNA分子為載體，克隆含有目的基因的外源DNA片段，若不導(dǎo)致重要的噬菌體基因的失活，插入的外源DNA片段會(huì)隨著噬菌體DNA分子一起增值。利用32P標(biāo)記的特異性探針，作噬菌斑放射自顯影雜交，可檢測(cè)出含有重組DNA分子的陽性斑點(diǎn)。分離重組體噬菌體的基本過程：使用無菌消毒的金屬接種針，粘著少量的噬菌體顆粒，轉(zhuǎn)移到新鮮的細(xì)菌培養(yǎng)基中，使其在感染的細(xì)胞內(nèi)大量地增殖。采用密度梯度離心法，便可非常容易地純化出噬菌體的顆粒。噬菌體的監(jiān)測(cè)方法噬菌體是極微小的微生物，通常在光學(xué)顯微鏡下不能看見，在人工培養(yǎng)基上又不能生長。所以，對(duì)噬菌體的監(jiān)測(cè)只能用間接的方法進(jìn)行。這些方法主要是根據(jù)噬菌體的生物學(xué)特性而設(shè)計(jì)的。第一，噬菌體對(duì)寄主具有高度的特異性，可利用敏感菌株對(duì)其進(jìn)行培養(yǎng)；第二，噬菌體侵染宿主細(xì)胞后可引起裂解，通過觀察在含有敏感菌株的瓊脂平板上接種噬菌體培養(yǎng)后是否出現(xiàn)噬菌斑，或是觀察在含敏感菌的液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)物是否變清來進(jìn)行判斷。常用的方法有載片快速檢測(cè)法、單層瓊脂法和雙層瓊脂法。λ噬菌體的基因組的結(jié)構(gòu)和用途λ噬菌體線性雙鏈DNA病毒，具有末端互補(bǔ)的12nt，感染細(xì)菌后粘端互補(bǔ)成雙鏈環(huán)狀。全長48531bp，含50多個(gè)基因。第二節(jié)λ噬菌體載體伴隨分子生物學(xué)、分子遺傳學(xué)的創(chuàng)立和發(fā)展過程。DNA復(fù)制機(jī)理的闡明、轉(zhuǎn)錄的終止作用、連接酶和解旋酶的發(fā)現(xiàn)、位點(diǎn)特異的重組作用、SOS修復(fù)機(jī)制等，均是以噬菌體為材料取得的重要研究成果。構(gòu)建的多種噬菌體載體，廣泛用于基因克隆、基因文庫的構(gòu)建等，是基因工程中不可缺少的實(shí)驗(yàn)材料。研究歷史：大腸桿菌雙鏈DNA噬菌體已定位的λ噬菌體基因有61個(gè)λ噬菌體的必要基因：參與了噬菌體生命周期的活動(dòng)，占一半左右λ噬菌體的非必要的基因：被外源基因取代之后，并不影響噬菌體的生命功能除λ噬菌體載體和柯斯質(zhì)粒載體外，還有單鏈DNA噬菌體載體，如M13噬菌體載體。λ噬菌體載體的優(yōu)點(diǎn)：溶源周期中，隨寄主細(xì)胞一起復(fù)制；生物學(xué)特性及遺傳背景清楚；寄主范圍更狹窄，安全1λ噬菌體的分子生物學(xué)概述

λ噬菌體顆粒中的DNA是一線性雙鏈DNA分子，長48502bp，兩端各有12個(gè)堿基的5`凸出黏性末端是互補(bǔ)的。進(jìn)入細(xì)胞的λDNA通過兩端的黏性末端環(huán)化。

λ噬菌體上有些基因可被取代而不影響其生活周期。（1）噬菌體基因組的結(jié)構(gòu)λDNA(48.5kb)，噬菌體中：線性，宿主細(xì)胞：環(huán)狀(cos位點(diǎn))Cos位點(diǎn)：由粘性末端結(jié)合形成的雙鏈區(qū)段必須基因非必要基因左側(cè)區(qū)：蛋白合成所需基因中間區(qū)：與重組有關(guān)右側(cè)區(qū)：調(diào)控成分2、λ噬菌體基因組有基因50個(gè)以上λ噬菌體DNA的核酸內(nèi)切限制酶的限制圖（Kb）3、限制性核酸內(nèi)切酶位點(diǎn):56種4、λ噬菌體的生長途徑

溶菌生長途徑

溶原生長途徑→某種脅迫條件下→合成six

基因產(chǎn)物→λDNA脫離細(xì)菌染色體→溶菌λ噬菌體感染了寄主細(xì)胞之后，究竟是發(fā)生溶菌反應(yīng)還是溶源反應(yīng)，這是由cI基因和cro基因編碼的蛋白質(zhì)，同λ噬菌體的兩個(gè)操縱基因（OL,OR)之間的相互作用來決定的。如果這兩個(gè)操縱基因都已擺脫了阻遏狀態(tài)，那么噬菌體便可以進(jìn)入溶菌周期，否則進(jìn)行溶源周期。A,構(gòu)建依據(jù)1、λ噬菌體是一種溫和噬菌體2、能承載較大的外源DNA片段

λDNA頭部可包裝約36.4～51kb(自身的75%～105%)，且約有20kbλDNA可缺失（生長非必需）3、在λDNA上有多種限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)B,構(gòu)建的基本策略與技術(shù)路線策略:

切去部分非必需區(qū)，刪掉多余的限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)，插入選擇性標(biāo)記基因，建立體外包裝系統(tǒng)。2.載體的構(gòu)建及其主要類型技術(shù)路線1、用限制性酶切去非必需區(qū)，抹去多余識(shí)別位點(diǎn) 選定一種酶，以gtWES–λβ為例，EcoRI（如圖）。 （48.5kb）λDNAEcoRI6個(gè)片段其中：

B片段是λ噬菌體生長非必需的；

C片段缺失可阻斷溶原生長途徑，但不影響溶菌途徑；

E片段去掉min5序列（2.6kb）。兩端EcoRI別點(diǎn)經(jīng)點(diǎn)突變或甲基化處理，即得gtWES–λβ：（48.5-5.5-2.6=40.4kb）

克隆能力： 替換B：最大：51-(40.4-4.9)=15.5kb

最?。?6.4-(40.4-4.9)=0.9kb

實(shí)際應(yīng)用時(shí)克隆能力略有出入（p109,表3-5）2、在λDNA的非必需區(qū)內(nèi)插入選擇標(biāo)記基因

（1）取代red和gam基因 外源DNA取代獲Spi-表型在P2噬菌體溶原性細(xì)胞中能生長野生型λ噬菌體(Spi+表型)在P2噬菌體溶原性細(xì)胞中不能生長

局限性：只能以P2噬菌體溶原細(xì)胞作為受體（2）最常用的篩選標(biāo)記：LacZ基因3、建立重組λDNA分子體外包裝系統(tǒng) 體外重組DNA分子必須經(jīng)體外包裝成噬菌體顆粒后，才能轉(zhuǎn)導(dǎo)受體細(xì)胞。 野生型λ噬菌體感染的細(xì)胞中無多余的外殼蛋白。

D-（D基因缺失噬菌體）→受體細(xì)胞→積累除D蛋白以 外所有蛋白質(zhì)

E-（E基因缺失噬菌體）→受體細(xì)胞→積累除E蛋白以 外所有蛋白質(zhì)

混合D、E互補(bǔ)包裝λDNA分子→λ噬菌體如:菌株BHB2688(E-)+BHB2690(D-)

λ噬菌體載體主要有如下特點(diǎn)：(1)篩選簡便；(2)可克隆的片段大，最大可達(dá)23kb，而質(zhì)粒最大僅10kb左右；(3)轉(zhuǎn)化效率高。λ噬菌體載體的主要類型：插入型載體和替換型載體

1.插入型載體：外源的DNA克隆后會(huì)使噬菌體的某些生物學(xué)功能喪失效力的載體分：免疫功能失活的插入型載體

β-半乳糖苷酶失活的插入型載體

2.替換型載體：在λ噬菌體基礎(chǔ)上改建的，在其中央部分有一個(gè)可以被外源插入的DNA分子所取代的DNA片段的克隆載體5.重組λDNA分子的體外包裝（自學(xué)）4.λ噬菌體克隆載體的應(yīng)用 建立cDNA基因文庫克隆外源目的基因注意：λ噬菌載體作為載體，其重組噬菌體DNA大小只能：38kb~52kb。體外包裝：λ噬菌載體+尾部蛋白+頭部蛋白

噬菌粒質(zhì)粒單鏈?zhǔn)删w輔助噬菌體大腸桿菌寄主菌株pEMBL8pUC8f1IR171/18pRSA101πVXM13M13變異株XS127，XS101pUC118/pUC119pUC18/pUC19M13M13K07MV1184pBSpUCf1M13K07XL-Blue幾種常用的噬菌粒載體的一般特征pUC119(MCS)pUC118(MCS)pUC118和pUC119噬菌粒載體的分子結(jié)構(gòu)噬菌粒載體的優(yōu)點(diǎn)（1）具小分子量的共價(jià)、閉合、環(huán)狀的基因基因組DNA，可克隆高達(dá)10kb的外源DNA；（2）有ampr等基因作為選擇記號(hào)；（3）拷貝數(shù)高；（4）存在多克隆位點(diǎn),可克隆達(dá)10kb的外源DNA；（5）可用組織化學(xué)顯色反應(yīng)篩選重組子；（6）具質(zhì)粒復(fù)制起點(diǎn)，在無輔助噬菌體存在下，克隆外源基因可按質(zhì)粒一樣復(fù)制；（7）有單鏈?zhǔn)删w復(fù)制起點(diǎn)，在有噬菌體輔助感染的宿主細(xì)胞中，可合成出單鏈DNA拷貝，并包裝成噬菌體顆粒分泌到培養(yǎng)基中。

(8)

可直接對(duì)克隆的基因進(jìn)行核苷酸測(cè)序。（一）構(gòu)建策略

由質(zhì)粒pBR322和含cos位點(diǎn)的λDNA片段組裝成的載體，即cosmid第三節(jié)柯斯質(zhì)粒載體（二）cosmid的特征1、環(huán)形雙鏈DNA分子,≤36.4kb,一般＜10kb2、具有質(zhì)粒的性質(zhì)，可轉(zhuǎn)化大腸桿菌，并按質(zhì)粒方式復(fù)制3、含有一個(gè)cos位點(diǎn)A蛋白

cos末端→體外包裝成為噬菌體，但不含λ噬菌體溶菌生長途徑、溶原生長途徑和DNA復(fù)制系統(tǒng)，不會(huì)產(chǎn)生子代噬菌體 4、cosmid較小，可承載更大的外源DNA

若cosmid為6.5kb，則可承載44.5(51-6.5)kb外源DNA，且能被包裝成具有感染能力的噬菌體顆粒。因此，cosmid克隆廣泛用于構(gòu)建基因組文庫。（三）使用cosmid載體的基本程序 利用cosmid的質(zhì)粒性質(zhì)，可按質(zhì)粒操作轉(zhuǎn)化受體細(xì)胞 利用cosmid的λ噬菌體性質(zhì)→轉(zhuǎn)導(dǎo)受體細(xì)胞（下圖）部分柯斯質(zhì)粒的基本特性柯斯質(zhì)粒載體的特點(diǎn)：（1）具有λ噬菌體的特性（但因不含λ噬菌體的全部必需基因，因此不能通過溶菌周期，無法形成子代噬菌體顆粒）；（2）具有質(zhì)粒的特性（有質(zhì)粒復(fù)制子及抗菌素基因）；（3）具有高容量的克隆能力（本身僅5-7kb,克隆極限可達(dá)45kb左右）；（4）具有與同源序列質(zhì)粒進(jìn)行重組的能力。廣泛應(yīng)用于基因組DNA文庫的構(gòu)建?？滤箍寺。╟osmidcloning）

理論依據(jù)是：1）在線性噬菌體DNA分子的每一端，都具有一段彼此互補(bǔ)的單鏈突出序列（cos位點(diǎn))。2）在λ噬菌體的正常生命周期中，會(huì)產(chǎn)生出由數(shù)百個(gè)λDNA拷貝組成的多連體分子。在此種分子中，前后兩個(gè)λDNA基因組之間都是通過cos位點(diǎn)連接起來的。3）λ噬菌體具有的一種位點(diǎn)特異的切割體系(site-specificcuttingsystem),又叫Ter體系，能識(shí)別兩個(gè)相距適宜的cos位點(diǎn)(38-45kb)，將多連體分子切割成λ單位長度的片段，并將它們包裝到λ噬菌體頭部中去。(如EcoRI)38kb~52kb應(yīng)用柯斯質(zhì)粒作載體構(gòu)建基因組文庫的一般程序第四節(jié)單鏈DNA噬菌體載體（一）M13DNA

絲狀噬菌體，內(nèi)有一環(huán)狀單鏈DNA分子（“+”鏈DNA） 大?。?.4kb

結(jié)構(gòu)：10個(gè)區(qū)基因間隔區(qū)（IS區(qū)）

含復(fù)制起始位點(diǎn)及可插入外源DNA的位點(diǎn)（二）M13DNA復(fù)制和M13噬菌體增殖

M13DNA“+”鏈進(jìn)入雄性大腸桿菌→合成“-”鏈→產(chǎn)生雙鏈M13DNA（復(fù)制型DNA或RF-DNA）→按環(huán)狀雙鏈DNA方式復(fù)制，同時(shí)以“+”鏈DNA為模板轉(zhuǎn)錄包裝蛋白→RF-DNA達(dá)200拷貝時(shí)，單鏈DNA特異結(jié)合蛋白與“+”鏈結(jié)合而阻斷合成“-”鏈→結(jié)果只能以“-”鏈為模板合成“+”鏈→“+”鏈DNA被包裝蛋白包裝成新的M13噬菌體→擠出受體細(xì)胞→宿主細(xì)胞不被溶菌。

M13DNA復(fù)制特征：以雙鏈DNA為中間媒介 培養(yǎng)物→高速離心→上清中含噬菌體顆?！?”鏈DNA

沉淀菌體→破碎后，可提取RF-DNA（三）M13噬菌體克隆載體的構(gòu)建策略和途徑 策略：在RF-DNA的IS區(qū)插入選擇標(biāo)記基因，并組裝合適ＭＣＳ。

RF-DNA上有10個(gè)BsuI位點(diǎn)→部分酶切→獲得全長線形RF-DNA,與含LacZ`標(biāo)記的HindⅢ酶切片段進(jìn)行平末端連接→M13mp1載體。為獲得合適的克隆位點(diǎn),可在LacZ`區(qū)插入ＭＣＳ連桿構(gòu)建成對(duì)M13載體，保證外源DNA兩條鏈都能隨“+”鏈一起復(fù)制包裝。（四）M13克隆載體的優(yōu)點(diǎn)與應(yīng)用優(yōu)點(diǎn)：1、以雙鏈環(huán)形DNA為中間媒介復(fù)制，可與質(zhì)粒一樣體外純化操作2、制備的M13DNA單、雙鏈都能轉(zhuǎn)化大腸桿菌，直接轉(zhuǎn)染受體細(xì)胞3、單鏈DNA不受包裝限制，可包裝M13DNA分子6倍的DNA分子4、可產(chǎn)生大量純化的含外源DNA插入的單鏈DNA分子 主要用途：克隆、分離單鏈外源DNA片段 獲得的“+”鏈可直接用于DNA測(cè)序單鏈DNA載體，具有其它載體所不具備的優(yōu)越性：

第一，單鏈DNA噬菌體的復(fù)制，是以雙鏈環(huán)狀DNA為中間體。這種復(fù)制形式的中間體DNA，可以象質(zhì)粒DNA一樣，在體外進(jìn)行純化和操作。

第二，鏈DNA噬菌體的兩種DNA，它們都能夠轉(zhuǎn)染大腸桿菌細(xì)胞；

第三，單鏈DNA噬菌體載體不存在包裝限制問題；第四，于測(cè)定外源DNA的插入方向。(yeastartificialchromosome,YAC)

真核生物染色體的幾個(gè)最為重要的部位：①端粒重復(fù)序列（telomericrepeat，TEL）

②著絲粒（centromere，CEN）③自主復(fù)制序列（autonomouslyreplicationsequences，ARS）

YAC載體的選擇標(biāo)記主要采用營養(yǎng)缺陷型基因，如色氨酸、亮氨酸合成缺陷型基因trp1、leu2YAC本身可小至8kb（如pYAC2質(zhì)粒），克隆能力可達(dá)1000kb以上。五酵母人工染色體載體(bacterialartificialchromosome,BAC)BAC載體是建立在大腸桿菌的F因子（大小約100kb）的基因礎(chǔ)上；人工構(gòu)建的BAC較?。ㄈ鏿BeloBAC11僅有7.4kb，保留了與F因子的自主復(fù)制、拷貝數(shù)控制及質(zhì)粒分配等功能相關(guān)基因），但其克隆能力可達(dá)300kb以上，遠(yuǎn)大于柯斯質(zhì)粒，但小于YAC。六細(xì)菌人工染色體載體七、CaMV克隆載體 花椰菜花葉病病毒（CaMV）環(huán)狀雙鏈DNA分子（一）CaMV

DNA分子 大?。?kb

結(jié)構(gòu)：在病毒顆粒中呈開環(huán)形式，負(fù)鏈有一缺口，正鏈有兩缺口。進(jìn)入植物細(xì)胞后單鏈部分被酶解，缺口自行閉合，成為環(huán)狀DNA分子。（二）CaMV基因區(qū)8個(gè)閱讀框（ORF）和3個(gè)間隔區(qū)（IR1～3）

IR1－ORFVI與ORFVII之間

IR2－ORFVII與ORFI之間

IR3－ORFV與ORFVI之間

IR1和IR3區(qū)各有一個(gè)啟動(dòng)子結(jié)構(gòu)，分別啟動(dòng)同方向轉(zhuǎn)錄35SRNA和19SRNA，而兩者的終止子都在IR1區(qū)。

35S啟動(dòng)子——組成型強(qiáng)啟動(dòng)子。組裝了35S啟動(dòng)子的外源基因可在植物細(xì)胞高效表達(dá)，在藍(lán)藻細(xì)胞內(nèi)也有效表達(dá)。（三）CaMV的增殖和感染

1、增殖途徑：

CaMV顆?！料x→病毒DNA進(jìn)入植物細(xì)胞核→ 轉(zhuǎn)錄19SRNA→翻譯

35SRNA翻譯反轉(zhuǎn)錄

“-”鏈DNA→復(fù)制出“+”鏈2、CaMV-DNA可轉(zhuǎn)染植物細(xì)胞 在ORFII和ORFVII區(qū)插入外源DNA后仍能轉(zhuǎn)染植物細(xì)胞包裝成新的CaMV顆粒（四）構(gòu)建CaMV克隆載體的基本策略和途徑

策略

CaMV-DNA能侵入植物細(xì)胞而將目的基因?qū)?，并且清除CaMV對(duì)植物的致病性基因途徑1、構(gòu)建互補(bǔ)克隆載體:組裝(目的基因+標(biāo)記基因)而無感染能力+兩種基因和感染能力都無→彼此獲得對(duì)方產(chǎn)物→感染能力2、構(gòu)建置換型克隆載體置換的外源基因較小3、構(gòu)建混合型克隆載體

CaMV-DNA→合適的限制性酶切→組入Ti的T-DNA區(qū)→完成構(gòu)建4、構(gòu)建CaMV-融合基因克隆載體系統(tǒng) 將35S啟動(dòng)子與目的基因融合，高效表達(dá)目的基因。八、煙草花葉病毒（TMV）克隆載體 單鏈正義RNA，6395bp特點(diǎn)：復(fù)制量和外殼蛋白表達(dá)量高，寄主范圍廣，能在整株植物上快速擴(kuò)散TMV載體構(gòu)建策略有四種基本形式（圖3-20）九、SV40克隆載體——哺乳動(dòng)物基因克隆載體 （猿猴空泡病毒40）（一）SV40基因組雙鏈閉環(huán)DNA：5243bp酶切位點(diǎn)：早期轉(zhuǎn)錄區(qū)：BamHⅠ、BstⅠ、TapⅠ識(shí)別序列晚期轉(zhuǎn)錄區(qū)：AccⅠ、NaeⅠ、HaeⅡ、HpaⅡ

、EcoRⅠ、BanⅠ、EcoRⅤ、AflⅡ轉(zhuǎn)錄啟動(dòng)區(qū)：BglⅠ、SfiⅠ都只有一個(gè)識(shí)別序列（二）SV40-DNA復(fù)制與增殖 猿猴細(xì)胞——受納細(xì)胞 嚙齒動(dòng)物（小鼠、倉鼠）——非受納細(xì)胞；細(xì)胞癌變 人：1～2%細(xì)胞產(chǎn)生病毒顆粒，不會(huì)插入染色體，相對(duì)安全（三）構(gòu)建策略和途徑 包裝嚴(yán)格，不能包裝大于SV40-DNA的分子，只能構(gòu)建取代型載體或SV40-DNA與質(zhì)粒DNA的重組型載體1、取代型 被取代的DNA序列不能超過SV40-DNA的30%

（1）晚期轉(zhuǎn)錄區(qū)取代型：需輔助載體共同轉(zhuǎn)染受體細(xì)胞 （2）早期轉(zhuǎn)錄區(qū)取代型：輔助細(xì)胞系 （將SV40早期轉(zhuǎn)錄區(qū)DNA序列整合到敏感細(xì)胞基因組上）

2、病毒-質(zhì)粒重組克隆載體：質(zhì)粒載體的衍生物

（1）病毒-質(zhì)粒重組克隆載體（穿梭質(zhì)粒）：含SV40完整早期轉(zhuǎn)錄區(qū)和DNA復(fù)制起始點(diǎn)，及質(zhì)粒DNA的復(fù)制起始點(diǎn)和選擇性標(biāo)記 （2）微型病毒復(fù)制子質(zhì)粒載體：只含SV40復(fù)制起始點(diǎn)十、反轉(zhuǎn)錄病毒克隆載體：一類RNA病毒（一）勞斯肉瘤病毒的生物學(xué)特性RSV：含兩條相同的38SRNA（右圖）;與宿主細(xì)胞提供的tRNATrp結(jié)合處：PBS+ve、PBS-veRSV的復(fù)制與增殖：（右圖）接上長末端重復(fù)序列（LTR）策略：RNA病毒不能直接構(gòu)建，必須從感染動(dòng)物細(xì)胞中分離出原病毒DNA，按不同需求刪去部分序列，組入選擇標(biāo)記、目的基因、調(diào)控元件，再克隆入質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌，才可獲重組載體。（二）構(gòu)建RSV載體的策略和途徑1、反轉(zhuǎn)錄病毒-質(zhì)粒載體 關(guān)鍵步驟：體外刪去原病毒的gag、pol、env等序列，保留5’和3’LTR序列以及PBS+ve、PBS-ve和psi（包裝）位點(diǎn)，插入合適的選擇標(biāo)記如neo、gpt等。(如圖)需輔助反轉(zhuǎn)錄病毒↓Gag、Env蛋白↓識(shí)別包裝位點(diǎn)psi↓將重組的反轉(zhuǎn)錄病毒包裝成新的病毒顆粒新病毒能合成各種所需的蛋白質(zhì)。特點(diǎn)：更高的轉(zhuǎn)化效率，基因轉(zhuǎn)移成功率100%改進(jìn)：鑒于危險(xiǎn)性，已建立了不需輔助反轉(zhuǎn)錄病毒的克隆載體系統(tǒng)。將缺失psi位點(diǎn)的原病毒DNA轉(zhuǎn)化動(dòng)物受體細(xì)胞，獲得全部包裝蛋白質(zhì)，即輔助細(xì)胞。2、廣宿主反轉(zhuǎn)錄病毒克隆載體組入能感染多種