臨床血液學(xué)檢驗技術(shù)-第五章-第一節(jié)-白細(xì)胞功能檢驗-課件

第一章造血及造血調(diào)控第一節(jié)造血器官與造血微環(huán)境臨床血液學(xué)檢驗技術(shù)第五章白細(xì)胞檢驗技術(shù)第一節(jié)白細(xì)胞功能檢驗?zāi)夸?/p>

一、粒細(xì)胞及單核細(xì)胞功能檢查

二、粒細(xì)胞動力學(xué)檢驗

三、淋巴細(xì)胞功能檢查第一節(jié)白細(xì)胞功能檢驗一、粒細(xì)胞及單核細(xì)胞功能檢查（一）墨汁吞噬試驗【實驗原理】中性粒細(xì)胞及單核細(xì)胞對細(xì)菌、異物等具有吞噬作用。墨汁吞噬試驗(inkphagocytosistest)是在一定量的肝素抗凝血中，加入一定量的墨汁，經(jīng)37℃溫育4小時，涂片染色，鏡下觀察200個吞噬細(xì)胞對墨汁的吞噬情況，并計算吞噬率及吞噬指數(shù)?！緟⒖挤秶?.成熟中性粒細(xì)胞吞噬率74%±15%，吞噬指數(shù)126±60；2.成熟單核細(xì)胞吞噬率95%±5%，吞噬指數(shù)313±86。第一節(jié)白細(xì)胞功能檢驗（一）墨汁吞噬試驗【臨床意義】1.急性單核細(xì)胞白血病M5a為弱陽性，M5b吞噬指數(shù)明顯增高；2.急性粒細(xì)胞白血病(M2)、急性淋巴細(xì)胞白血病(ALL)和急性早幼粒細(xì)胞白血病(M3)的原始及幼稚細(xì)胞多無吞噬能力，吞噬試驗為陰性；3.急性粒-單核細(xì)胞白血病(M4)呈陽性反應(yīng)，慢性粒細(xì)胞白血病(CML)的成熟中性粒細(xì)胞吞噬能力明顯減低。【應(yīng)用評價】該試驗方法簡單、實用、經(jīng)濟。利用該試驗可了解細(xì)胞的吞噬能力，從而協(xié)助白血病的診斷和鑒別診斷。此法還可以檢測吞噬細(xì)胞的非特異性吞噬功能。第一節(jié)白細(xì)胞功能檢驗

【實驗原理】制備白細(xì)胞懸液，將待測的中性粒細(xì)胞與葡萄球菌混合，37℃溫育一定時間后，細(xì)菌可被中性粒細(xì)胞吞噬。在油鏡下觀察中性粒細(xì)胞吞噬細(xì)菌的情況，根據(jù)吞噬率和吞噬指數(shù)即可反映中性粒細(xì)胞的吞噬功能，該試驗即細(xì)菌吞噬試驗?！緟⒖挤秶?.吞噬率(％)：健康者為62.8%±1.4%。2.吞噬指數(shù)：健康者為1.06±0.05。（二）細(xì)菌吞噬試驗第一節(jié)白細(xì)胞功能檢驗

【臨床意義】吞噬率和吞噬指數(shù)增高，反映中性粒細(xì)胞吞噬異物功能的增強。常見于細(xì)菌性感染，對疑有中性粒細(xì)胞吞噬功能低下者，有輔助確診的價值?！緫?yīng)用評價】細(xì)菌吞噬試驗簡單、方便，不需要特殊儀器設(shè)備，可了解中性粒細(xì)胞的吞噬功能。（二）細(xì)菌吞噬試驗第一節(jié)白細(xì)胞功能檢驗

【實驗原理】溶菌酶能水解革蘭陽性球菌細(xì)胞壁中的乙酰氨基多糖成分，使細(xì)胞失去細(xì)胞壁而破裂。血清溶菌酶活性試驗利用對溶菌酶較敏感的微球菌懸液為作用底物，根據(jù)微球菌的溶解程度來檢測血清或尿中溶菌酶的活性，主要方法有瓊脂平板法、比濁測定法及免疫測定法?！緟⒖挤秶勘葷岱ǎ?1.8±2.2mg/L；平板法：20.4±2.7mg/L；免疫測定法：10～40mg/L。第一節(jié)白細(xì)胞功能檢驗（三）血清溶菌酶活性試驗【臨床意義】1.急性單核細(xì)胞白血病的血清和尿液溶菌酶含量明顯增高；2.急性粒-單核細(xì)胞白血病血清溶菌酶含量也明顯增高；3.急性粒細(xì)胞白血病的血清溶菌酶的含量可正常或增高；4.急性淋巴細(xì)胞白血病多數(shù)減低，少數(shù)正常；5.慢性髓細(xì)胞白血病血清溶菌酶含量正常，但急變時下降?！緫?yīng)用評價】該試驗通常用瓊脂平板法、比濁測定法檢測酶的活性，免疫測定法檢測酶的量，兩者可以結(jié)合分析。免疫測定法具有特異、靈敏、準(zhǔn)確及可定量等優(yōu)點。（三）血清溶菌酶活性試驗第一節(jié)白細(xì)胞功能檢驗【實驗原理】采用Boyden小室法又稱為濾膜小室法。該方法運用特殊的小盒裝置，用一塊3~5微米孔徑的微孔濾膜將盒分為上下兩個小室，在微孔濾膜的一側(cè)放入粒細(xì)胞，另一側(cè)放入趨化因子(細(xì)菌菌體或其產(chǎn)物、補體C3a、淋巴因子等)，檢測粒細(xì)胞經(jīng)濾膜微孔到達(dá)趨化因子這一側(cè)的定向移動能力。【參考范圍】趨化指數(shù)3.0～3.5?！九R床意義】趨化功能降低見于Chediak-Higashi綜合征、糖尿病、燒傷、新生兒、慢性皮膚粘膜白色念珠菌感染、高IgE綜合征等。【應(yīng)用評價】本試驗是體外檢測粒細(xì)胞和單核-巨噬細(xì)胞趨化性強弱的方法。Boyden小室法比瓊脂糖法敏感，能檢測出納克（ng）水平的趨化因子活性，且所需時間短、重復(fù)性好。第一節(jié)白細(xì)胞功能檢驗（四）趨化功能試驗【實驗原理】

硝基四氮唑藍(lán)(NBT)是一種染料，其水溶液呈淡黃色。中性粒細(xì)胞殺菌過程中能量消耗增多，耗氧量也增加，細(xì)胞內(nèi)磷酸己糖旁路代謝增強。NBT被吞入或滲入中性粒細(xì)胞后，可接受葡萄糖-6-磷酸在已糖磷酸旁路代謝中NADPH氧化脫下的氫，而被還原成非水溶性的藍(lán)黑色顆粒沉著在胞質(zhì)內(nèi)，可在顯微鏡下觀察并計數(shù)陽性細(xì)胞百分比?！緟⒖挤秶?/p>

正常成人的陽性細(xì)胞數(shù)在10%以下。若有10%以上中性粒細(xì)胞能還原NBT，即為NBT還原試驗陽性；低于10%則為陰性。第一節(jié)白細(xì)胞功能檢驗（五）硝基四氮唑藍(lán)還原試驗（五）硝基四氮唑藍(lán)還原試驗【臨床意義】兒童慢性肉芽腫、葡萄糖-6-磷酸脫氫酶缺乏癥、髓過氧化物酶缺乏癥和Job綜合癥，NBT還原試驗陽性；全身性細(xì)菌感染時，病人的NBT還原陽性細(xì)胞在10%以上，而病毒感染或其他原因發(fā)熱的患者則在10%以下；器官移植后發(fā)熱，若非細(xì)菌感染所致，其NBT還原試驗陰性，若為陽性，則提示可能有細(xì)菌感染。【應(yīng)用評價】本試驗簡單、快速、重復(fù)性好，但易出現(xiàn)假陽性或假陰性。該方法可用來篩檢中性粒細(xì)胞吞噬和殺菌功能異常的疾病，也可輔助鑒別細(xì)菌性和病毒性感染。第一節(jié)白細(xì)胞功能檢驗二、粒細(xì)胞動力學(xué)檢驗（一）氚標(biāo)記脫氧胸苷(3H-TdR)測定【實驗原理】3H-TdR是DNA合成的前期物質(zhì)，可準(zhǔn)確而穩(wěn)定地標(biāo)記細(xì)胞核。在體外培養(yǎng)過程中加入絲裂原植物血凝素(PHA)或特異性抗原刺激后，粒細(xì)胞進入有絲分裂期，加入3H-TdR，其可被S期的幼稚粒細(xì)胞攝入?yún)⑴cDNA合成，攝入量與DNA合成的量及增殖細(xì)胞數(shù)成正比，用液體閃爍計數(shù)器測定3H-TdR的攝入量，即可判定粒細(xì)胞的增殖水平?！緟⒖挤秶看碳ぶ笖?shù)SI＜2。第一節(jié)白細(xì)胞功能檢驗【臨床意義】給急性白血病患者連續(xù)靜脈輸入3H-TdR，8～10d后觀察，若有8%～10%的白血病細(xì)胞未被標(biāo)記，說明這一小部分白血病細(xì)胞增殖相當(dāng)緩慢，提示白血病細(xì)胞是一群非同步化增殖的細(xì)胞?！緫?yīng)用評價】3H-TdR可選擇性地協(xié)同進入分化細(xì)胞的DNA中，具有高標(biāo)記和穩(wěn)定的特點，用于放射自顯影非常理想。第一節(jié)白細(xì)胞功能檢驗（一）氚標(biāo)記脫氧胸苷(3H-TdR)測定【實驗原理】正常骨髓中粒細(xì)胞儲備量是外周血中的10～15倍。潑尼松具有刺激骨髓中性粒細(xì)胞由儲備池向外周血釋放的功能。如果受檢者的骨髓粒細(xì)胞儲備池正常，服用潑尼松后經(jīng)過一定時間，中性粒細(xì)胞由儲備池大量釋放至外周血而使外周血中性粒細(xì)胞的絕對值明顯增高。反之，則無此作用或作用不明顯?！緟⒖挤秶糠幒笾行粤＜?xì)胞最高絕對值＞20×109/L(服藥后5h為中性粒細(xì)胞上升到高峰的時間)。第一節(jié)白細(xì)胞功能檢驗（二）潑尼松刺激試驗【臨床意義】潑尼松試驗可反應(yīng)骨髓中性粒細(xì)胞儲備池的容量。中性粒細(xì)胞減少患者，如服用潑尼松后外周血中性粒細(xì)胞最高絕對值大于20×109/L，表明患者中性粒細(xì)胞的儲備池正常，粒細(xì)胞減少可能是由于骨髓釋放障礙或其他因素所致。反之，則反映儲備不足?！緫?yīng)用評價】操作方便，結(jié)果可靠，能準(zhǔn)確反映骨髓中粒細(xì)胞的儲備。第一節(jié)白細(xì)胞功能檢驗（二）潑尼松刺激試驗【實驗原理】中性粒細(xì)胞進入血流后，約半數(shù)進入循環(huán)池，半數(shù)黏附于血管壁成為邊緣池粒細(xì)胞，此部分粒細(xì)胞在外周血白細(xì)胞計數(shù)中不能得到反映，注射腎上腺素后血管收縮，黏附于血管壁上的粒細(xì)胞脫落，從邊緣池進入循環(huán)池，致外周血白細(xì)胞數(shù)增高?！緟⒖挤秶苛＜?xì)胞上升值一般低于(1.5～2)×109/L。第一節(jié)白細(xì)胞功能檢驗（三）腎上腺素激發(fā)試驗【臨床意義】粒細(xì)胞減少者，注射腎上腺素后，如外周血粒細(xì)胞較注射前增加1倍以上，或粒細(xì)胞上升值超過(1.5～2)×109/L，表示患者粒細(xì)胞在血管壁粘附增多，提示病人粒細(xì)胞分布異常，即邊緣池粒細(xì)胞增多，如無脾大，可考慮為“假性”粒細(xì)胞減少。如果增高低于上述值，則應(yīng)進行其他檢查，進一步確定粒細(xì)胞減少的原因?！緫?yīng)用評價】本方法操作簡單，可用于鑒別粒細(xì)胞減少癥是否為“假性”減少，是粒細(xì)胞減少癥患者常用的實驗檢查方法之一第一節(jié)白細(xì)胞功能檢驗（三）腎上腺素激發(fā)試驗【實驗原理】利用含有放射性磷的二異丙酯氟磷酸(diisopropylfluorophosphate，DF32P)作為膽堿酯酶的抑制劑，其能與細(xì)胞上的膽堿酯酶結(jié)合。結(jié)合了DF32P的粒細(xì)胞崩解后不再與其他細(xì)胞相結(jié)合。作粒細(xì)胞動力學(xué)研究時，采血制成標(biāo)記物后，立即靜脈注射DF32P。經(jīng)過一段時間再次采血，分離粒細(xì)胞，追蹤觀察其放射活性的變化，可測知外周血中有關(guān)粒細(xì)胞的參數(shù)。第一節(jié)白細(xì)胞功能檢驗（四）二異丙酯氟磷酸鹽標(biāo)記(DF32P)測定【參考范圍】粒細(xì)胞總數(shù)的測定1.標(biāo)記粒細(xì)胞半衰期(T1/2)：4～10h；血中滯留時間：10～14h。2.全血粒細(xì)胞池(totalbloodgranulocytepoolTBGP)：(35～70)×107/kg3.循環(huán)粒細(xì)胞池(circulationgranulocytepoolCGP)：(20～30)×107/kg4.邊緣粒細(xì)胞池(marginalgranulocytepoolMGP)：(15～40)×107/kg5.粒細(xì)胞周轉(zhuǎn)率(granulocyteturnoverrateGTR)：(60～160)×107/(kg.d)第一節(jié)白細(xì)胞功能檢驗（四）二異丙酯氟磷酸鹽標(biāo)記(DF32P)測定【臨床意義】在慢性白血病、真性紅細(xì)胞增多癥和骨髓纖維化時，TBGP及GTR顯著增加，粒細(xì)胞半衰期明顯延長。急性粒細(xì)胞白血病時粒細(xì)胞半衰期有輕微的延長，而再生障礙性貧血時各指數(shù)測定值均偏低?！緫?yīng)用評價】

本方法操作繁瑣，但結(jié)果可靠?？捎糜隗w內(nèi)、體外標(biāo)記。不能用于標(biāo)記淋巴細(xì)胞。

第一節(jié)白細(xì)胞功能檢驗（四）二異丙酯氟磷酸鹽標(biāo)記(DF32P)測定【實驗原理】用5-溴脫氧尿嘧啶(5-BrdU)摻入到S期細(xì)胞的DNA中，然后用熒光標(biāo)記的抗5-BrdU的抗體，通過流式細(xì)胞儀準(zhǔn)確測定細(xì)胞的DNA合成速率。【結(jié)果】精確測定大量細(xì)胞的DNA含量，準(zhǔn)確區(qū)分G1、S、G2+M細(xì)胞周期各時相分布的動態(tài)參數(shù)，間接了解DNA的合成情況。第一節(jié)白細(xì)胞功能檢驗（五）流式細(xì)胞儀檢測DNA合成【臨床意義】可直接用于白血病患者體內(nèi)細(xì)胞增殖的動態(tài)研究，據(jù)此設(shè)計化療藥物的最佳治療方案；因靜止期腫瘤細(xì)胞對化療藥物不敏感，而增殖期的細(xì)胞則敏感，可將G0期細(xì)胞誘導(dǎo)浸潤增殖期，再予以藥物治療，以達(dá)到最佳殺傷瘤細(xì)胞的效果。第一節(jié)白細(xì)胞功能檢驗（五）流式細(xì)胞儀檢測DNA合成【實驗原理】細(xì)胞在增殖周期的不同階段，其DNA含量是不同的。熒光染料碘化丙啶可嵌入到死細(xì)胞雙鏈DNA和RNA的堿基對中與DNA結(jié)合。利用流式細(xì)胞儀可將細(xì)胞按不同的熒光強度（即反映DNA含量）分類，并繪出DNA直方圖，從DNA直方圖可以得出在細(xì)胞周期中處于不同階段的細(xì)胞所占的百分比?！窘Y(jié)果】1.細(xì)胞DNA含量細(xì)胞中DNA含量用DNA指數(shù)（DNAindex,DI）來表示。根據(jù)DI值來判斷細(xì)胞DNA的倍體。2.計算細(xì)胞周期各時相比率包括G0/1期、S期和G2+M期。第一節(jié)白細(xì)胞功能檢驗（六）流式細(xì)胞儀檢測DNA含量【臨床意義】1.DNA非整倍體細(xì)胞是腫瘤細(xì)胞的特異性標(biāo)志從FCM的DNA圖形分析可得知血細(xì)胞和骨髓細(xì)胞DNA的相對含量，從而了解白血病細(xì)胞的倍體水平及增殖活動。2.監(jiān)測白血病化療后療效用FCM監(jiān)測對比化療后的細(xì)胞內(nèi)DNA含量變化，可迅速得出是否敏感的結(jié)論，從而指導(dǎo)臨床對初治或復(fù)發(fā)白血病患者選用和更換化療方案。3.了解白細(xì)胞G0/1期、S期和G2+M期細(xì)胞的百分比。白血病患者外周血白血病細(xì)胞多處于G0或G1期，S期細(xì)胞百分率高者對常用周期特異性藥物較為敏感，患者的完全緩解率高，但容易復(fù)發(fā)；反之則對化療不敏感，到一旦緩解不宜復(fù)發(fā)。根據(jù)增殖其細(xì)胞對周期特異性藥物比對靜止期細(xì)胞為敏感，應(yīng)用G-CSF來復(fù)蘇G0期白血病細(xì)胞，有利于提高化療效果。第一節(jié)