感染性疾病的分子診斷

感染性疾病的分子診斷第一頁，共八十五頁，編輯于2023年，星期六感染性疾?。河赡撤N病原體所致，通過不同方式引起人體發(fā)生感染并出現(xiàn)臨床癥狀的疾病。病原體：病毒、細(xì)菌、原蟲、支原體、衣原體、立克次體、螺旋體、寄生蟲。

第二頁，共八十五頁，編輯于2023年，星期六常規(guī)檢測方法：

免疫學(xué)方法微生物學(xué)方法受敏感性、特異性限制，不易早期診斷，并且不易提供病原體分型及耐藥性方面的信息。第三頁，共八十五頁，編輯于2023年，星期六感染性疾病的分子診斷策略一般性策略（檢出病原體）：判斷有無感染是何種病原體感染常用方法：PCR＋雜交完整性策略：檢出病原體分型（分類）－亞型－耐藥性常用方法：雜交、PCR、基因芯片、DNA測序第四頁，共八十五頁，編輯于2023年，星期六感染性疾病分子診斷標(biāo)志物病原體核酸分子（DNA/RNA）基因表達(dá)產(chǎn)物代謝物免疫應(yīng)答分子細(xì)胞免疫體液免疫TT致敏T細(xì)胞淋巴因子B漿細(xì)胞IgMIgGIgAIgDIgE感染早期出現(xiàn)臨近恢復(fù)期出現(xiàn)與原蟲和蠕蟲感染有關(guān)第五頁，共八十五頁，編輯于2023年，星期六二、感染性疾病分子診斷的常用方法

根據(jù)目的基因是否被放大，可分為雜交法和擴(kuò)增法。信號放大技術(shù)檢測方法

靶分子數(shù)目不變，而檢測的探針信號放大

采用多酶、多探針或二者結(jié)合等方法來增加探針標(biāo)志物的濃度使檢測信號得到放大。靶分子擴(kuò)增技術(shù)檢測方法

靶分子（RNA、DNA或探針）的擴(kuò)增PCR、替代擴(kuò)增、LCR等第六頁，共八十五頁，編輯于2023年，星期六引物A

靶RNA

引物B

RNAcDNA

RT

3'5'5'5'3'5'3'5'3'cDNA

cDNA模板

5'5'3'3'5'3'引物B

RNAseH

RT

T7RNA聚合酶

100-1000RNA擴(kuò)增子5'3'5'3'3'5'3'5'引物A

3'5'5'RNAseH

RNA

RNA

cDNA

cDNA

圖8-3NASBA原理示意圖

引物A5’端帶有T7RNA聚合酶結(jié)合位點，3’端堿基與靶RNA3’端序列互補(bǔ);引物B的堿基序列與cDNA3’端序列互補(bǔ)第七頁，共八十五頁，編輯于2023年，星期六nucleicacidsequence-basedamplification(NASBA)第八頁，共八十五頁，編輯于2023年，星期六NASBA的特點為操作簡便，不需特殊儀器，不需溫度循環(huán)。整個反應(yīng)過程由三種酶控制，循環(huán)次數(shù)少，忠實性高,其擴(kuò)增效率高于PCR，特異性好。

第九頁，共八十五頁，編輯于2023年，星期六引物A

靶RNA

引物B

RNAcDNA

RT

3'5'5'5'3'5'3'5'3'cDNA

cDNA模板

5'5'3'3'5'3'引物B

RNAseH

RT

T7RNA聚合酶

100-1000RNA擴(kuò)增子5'3'5'3'3'5'3'5'引物A

3'5'5'RNAseH

RNA

RNA

cDNA

cDNA

圖8-3NASBA原理示意圖

引物A5’端帶有T7RNA聚合酶結(jié)合位點，3’端堿基與靶RNA3’端序列互補(bǔ);引物B的堿基序列與cDNA3’端序列互補(bǔ)第十頁，共八十五頁，編輯于2023年，星期六nucleicacidsequence-basedamplification(NASBA)第十一頁，共八十五頁，編輯于2023年，星期六NASBA的特點為操作簡便，不需特殊儀器，不需溫度循環(huán)。整個反應(yīng)過程由三種酶控制，循環(huán)次數(shù)少，忠實性高,其擴(kuò)增效率高于PCR，特異性好。

第十二頁，共八十五頁，編輯于2023年，星期六三、感染性疾病分子診斷的標(biāo)本處理標(biāo)本采集處理主要包括選擇合適的標(biāo)本種類、標(biāo)本量、抗凝劑等及對標(biāo)本進(jìn)行合適的傳送、保存和預(yù)處理。第十三頁，共八十五頁，編輯于2023年，星期六四、感染性疾病分子診斷的結(jié)果解釋1.陰性結(jié)果

假陰性可能性方法的靈敏度太低方法失敗目標(biāo)分子2.陽性結(jié)果

假陽性可能性方法的特異性受到污染第十四頁，共八十五頁，編輯于2023年，星期六3.定性檢測結(jié)果

有時不能提供病原體活力相關(guān)信息臨床治療病情緩解后一定時間內(nèi)，在患者樣本中仍可以檢測出相應(yīng)的病原體。有些病原體潛伏在進(jìn)體內(nèi)，沒有臨床癥狀。4.疾病狀況的判斷

檢測出病原體的存在并不能說此病原體就是引起疾病的直接原因。該病原體可能是一種正常菌群

第十五頁，共八十五頁，編輯于2023年，星期六五、感染性疾病分子診斷的臨床應(yīng)用及評價用于感染性疾病治療的監(jiān)控和預(yù)測、病情發(fā)展過程的危險性評價及疾病預(yù)后等。耐藥性的檢測細(xì)菌的分型流行病調(diào)查第十六頁，共八十五頁，編輯于2023年，星期六第一節(jié)病毒的基因檢測人類許多感染疾病由病毒引起，如病毒性肝炎、腦炎、流行性感冒等等，占人類傳染疾病的75%左右。400多種不同病毒。病毒結(jié)構(gòu)：大小：20-300nm

核心區(qū)：核酸（DNA或RNA）外周衣殼：蛋白質(zhì)包膜：脂質(zhì)（鑲嵌有蛋白質(zhì)）第十七頁，共八十五頁，編輯于2023年，星期六

我國是HBV高流行區(qū)，50%－70%的人受過感染，8%－10%是HBV攜帶者，肝炎患者中60%是慢性肝炎患者，導(dǎo)致肝硬變，HBV又與原發(fā)性肝癌密切相關(guān)。外殼（HBsAg):外殼蛋白成分為表面抗原核心（HBcAg)：DNADNA聚合酶

HBcAg一、乙型肝炎病毒第十八頁，共八十五頁，編輯于2023年，星期六Dane顆粒（完整的病毒）形態(tài)HBsAgHBcAgHBVDNADNAPol（外膜蛋白）（核衣殼蛋白）完整的乙肝病毒顆粒直徑42納米由雙層外殼和一個核心組成的，核心直徑為27納米，內(nèi)含DNA雙鏈和DNA多聚酶第十九頁，共八十五頁，編輯于2023年，星期六（一）病毒基因組結(jié)構(gòu)3.2kb雙鏈DNA病毒不完全雙連環(huán)狀DNA

長鏈L為負(fù)鏈：有4個開放閱讀框S、C、P、XS區(qū)編碼外膜蛋白（HBsAg）

C區(qū)編碼HBeAg、HBcAgp區(qū)編碼DNA聚合酶

X區(qū)位編碼X蛋白，可能與病毒蛋白表達(dá)有關(guān)。

短鏈S為正鏈：長短不一第二十頁，共八十五頁，編輯于2023年，星期六pre-s1

pre-s2S

P

C

pre-c

XHBVDNA3.2kbpre-S1pre-S1蛋白pre-S2

pre-S2蛋白S

HBsAg

pre-C

HBeAg

C

HBcAgPDNAPX

HBxAgHBV基因組結(jié)構(gòu)第二十一頁，共八十五頁，編輯于2023年，星期六HBV基因分型HBV基因序列差異的多少，可將HBV劃分為不同的基因型，至今為止已發(fā)現(xiàn)A、B、C、D、E、F、G、H共8種基因型：A型主要存在于白人，B型和C型主要存在于亞洲人群E型主要存在于西非F型僅見于中南美洲的土著人G型和H型很少見不同基因型序列長度不同，主要是前S1區(qū)的不同。我國流行的主要是B和C基因型，長江以北以C型為主，長江以南以B型為主，另又少量的A型、D型和混合型。西北和西南尤其是西北有較高比例的D型第二十二頁，共八十五頁，編輯于2023年，星期六HBV在肝細(xì)胞內(nèi)的復(fù)制A(n)mRNAcccDNAHBsAg

包膜負(fù)鏈DNA包裹后的前基因

mRNA傳染性HBV病毒顆粒傳染性HBV病毒顆粒部分雙鏈DNA逆轉(zhuǎn)錄酶DNA聚合酶肝細(xì)胞第二十三頁，共八十五頁，編輯于2023年，星期六（二）分子診斷常用的免疫學(xué)檢測方法，即二對半的檢測存在窗口期，不易早期診斷。1.PCR

采用普通PCR、FQ-PCR、競爭性PCR、免疫雜交PCR，可提供直接、準(zhǔn)確的病原學(xué)診斷證據(jù)。引物是根據(jù)S、C、P、X基因中高度保守序列設(shè)計，決定擴(kuò)增的特異性和敏感度。第二十四頁，共八十五頁，編輯于2023年，星期六擴(kuò)增位置引物序列擴(kuò)增片斷（bp)

P、X基因5’-ATACTGCGGAACTCCTAGC-3’2785’-CCGCGTAAAGAGAGGTGCG-3’

C基因5’-ATACCACAGAGTCTAGACTCGTGGTGGACT-3’4775’-AAGCCCTACGAACCACTGAACAAATGGCAC-3’

C基因5’-GCTTTGGGGCATGGACATTGACCCCTATAA-3’2585’-ATGGGATCCCTGGAATGCGGGTCTTCCAAA-3’

第二十五頁，共八十五頁，編輯于2023年，星期六

有時為了證實擴(kuò)增產(chǎn)物的特異性，對擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行以下分析：

RLFP

斑點雜交

Southern雜交

第二十六頁，共八十五頁，編輯于2023年，星期六2.支鏈DNA信號放大技術(shù)(bDNA）原理:①捕獲探針檢測②靶探針1

體系③靶探針2④bDNA分子:DNA主鏈上結(jié)合多個側(cè)鏈

第二十七頁，共八十五頁，編輯于2023年，星期六捕獲探針固化在微孔板上靶探針1分別與捕獲探針及待測核酸雜交靶探針2分別與待測核酸及bDNA雜交形成復(fù)合物：固相支持物捕獲探針靶探針1CEs待測核酸靶探針2LEsbDNA復(fù)合物第二十八頁，共八十五頁，編輯于2023年，星期六分支鏈DNA信號放大技術(shù)(bDNA)第二十九頁，共八十五頁，編輯于2023年，星期六信號檢測：bDNA可結(jié)合很多酶標(biāo)探針，酶催化底物（1,2-二惡二酮，dioxetane）發(fā)光，使核酸信號放大，且發(fā)光強(qiáng)度與DNA量成正比。優(yōu)點：放大倍數(shù)確定陽性檢出率高穩(wěn)定性和可重復(fù)性好操作簡便，省時，易于普及第三十頁，共八十五頁，編輯于2023年，星期六3.基因芯片技術(shù)

標(biāo)本經(jīng)PCR擴(kuò)增后與芯片上的特異探針進(jìn)行雜交，可以檢測：是否有病毒感染感染病毒的種類及亞型病毒的耐藥情況特點：可同時進(jìn)行大量標(biāo)本的檢測第三十一頁，共八十五頁，編輯于2023年，星期六近年來陸續(xù)上市的核苷(酸)類似物對HBV的治療壓力集中在P區(qū)。干擾素治療對HBV的壓力主要集中在前C/C區(qū)及前S區(qū)。HBV耐藥突變lamivudineadefovirentecavirtelbivudine第三十二頁，共八十五頁，編輯于2023年，星期六YMDD

(酪氨酸-蛋氨酸-天冬氨酸-天冬氨酸)

HBV對拉米夫定耐藥是HBVDNA聚合酶突變所致。耐藥基因位點(YMDD)位于聚合酶的C區(qū)(rtM2041或rtM204V)，分別是YMDD中的蛋氨酸(M)被異亮氨酸(I)或纈氨酸(V)所替代，形成YIDD或YVDD變異.拉米夫定作用靶位為HBVDNA聚合酶C區(qū)。有研究表明，拉米夫定與HBV逆轉(zhuǎn)錄酶的親和力與位于第552位氨基酸側(cè)鏈長度有關(guān)，異亮氨酸和纈氨酸取代蛋氨酸，使側(cè)鏈氨基酸長度縮短，使逆轉(zhuǎn)錄酶dNTP結(jié)合區(qū)增大，不適于拉米夫定結(jié)合，從而誘發(fā)耐藥性。第三十三頁，共八十五頁，編輯于2023年，星期六HBV耐藥檢測（YMDD突變檢測方法）第三十四頁，共八十五頁，編輯于2023年，星期六YMDD突變檢測方法1.基因測序法2.熒光定量PCR方法基本原理確定探針特定的TM值來區(qū)分是否突變常用方法覆蓋突變位點熒光雙探針雜交

YIDDYMDDYVDD46.91℃54.64℃50.74℃第三十五頁，共八十五頁，編輯于2023年，星期六（三）臨床意義1.早期診斷免疫學(xué)檢測敏感性：0.1μg/ml

核酸雜交檢測敏感性：0.1pg/mlPCR檢測：0.1fg/ml

因此，在感染早期即可通過DNA檢測證實病毒的存在。第三十六頁，共八十五頁，編輯于2023年，星期六2.監(jiān)測治療效果:HBVDNA>107拷貝/ml提示病毒復(fù)制活躍；

HBVDNA＜104拷貝/ml治療有一定療效；

HBVDNA＜103拷貝/ml、HBeAg陰轉(zhuǎn)、轉(zhuǎn)氨酶正常為乙型肝炎臨床治愈指標(biāo)；3.判斷病情，指導(dǎo)制定合理的治療方案第三十七頁，共八十五頁，編輯于2023年，星期六4.病毒耐藥性的檢測乙肝病毒DNA聚合酶YMDD處的突變是病毒產(chǎn)生耐藥性的重要原因，通過監(jiān)測YMDD的突變情況，可以獲得病毒耐藥性方面的信息，指導(dǎo)抗病毒治療。第三十八頁，共八十五頁，編輯于2023年，星期六二、流行性感冒病毒

流行性感冒病毒(Influenzavirus)，是引起流行性感冒的病原體;分為甲(A)、乙(B)和丙(C)3個型別;根據(jù)病毒顆粒表面血凝素(Haemagglutinin

，HA)和神經(jīng)氨酸酶(Neuramiridase，NA)的抗原性，甲型流感病毒又可分為不同的亞型。甲型流感病毒易發(fā)生變異，致病力強(qiáng)，1918年發(fā)生在西方國家的大流感殺死了幾千萬人，即是由甲型流感病毒引起。

Thereare16differentH

antigens

(H1toH16)andninedifferentNantigens(N1toN9).第三十九頁，共八十五頁，編輯于2023年，星期六第四十頁，共八十五頁，編輯于2023年，星期六（一）流感病毒基因組結(jié)構(gòu)

單鏈RNA病毒，RNA為負(fù)鏈；有8個RNA片段或7個RNA片段；所有RNA片段5’末端和3’末端高度保守；兩種不同亞型病毒感染宿主時，會生成基因重配的新病毒；RNA基因在復(fù)制過程中常會發(fā)生點突變。

第四十一頁，共八十五頁，編輯于2023年，星期六（二）分子診斷方法

可采用RT-PCR、FQ-PCR檢測流感病毒RNA。引物常按流感病毒保守的非結(jié)構(gòu)基因（NS）的序列進(jìn)行設(shè)計。為證實PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的特異性或提高檢測的靈敏度，可用限制性內(nèi)切酶分析法、斑點雜交法、Southern印跡法進(jìn)行擴(kuò)增產(chǎn)物的分析。

第四十二頁，共八十五頁，編輯于2023年，星期六擴(kuò)增位置引物序列擴(kuò)增片段大小NS基因

5’-AAGGGCTTTCACCGAAGAGG-3’190(bp)5’-CCCATTCTCATTACTGCTTC-3’

NS基因

5’-ATGGCCATCGGATCCTCAAC-3’241(bp)

5’-TGTCAGCTATTATGGAGCTG-3’

第四十三頁，共八十五頁，編輯于2023年，星期六（三）臨床意義流感病毒的診斷過去主要靠雞胚羊膜腔培養(yǎng)和血清學(xué)血凝抑制試驗，這些方法比較費時，靈敏度低，難以作出早期診斷。

PCR法敏感、特異、簡便、快速，并且可用于流感病毒的分型和流行病學(xué)調(diào)查。

第四十四頁，共八十五頁，編輯于2023年，星期六三.人類免疫缺陷病毒（HIV)HIV，humanimmunodeficiencyvirusAIDS，acquiredimmunodeficiencysyndromeHIV為艾滋病的病原體?，F(xiàn)已發(fā)現(xiàn)引起艾滋病的病毒有HIV-1、HIV-2、HIV-3三種。1998年底艾滋病感染者和艾滋病患者總數(shù)為3.340萬，已死亡1.390萬，是全球十大主要死因之一。第四十五頁，共八十五頁，編輯于2023年，星期六最外層為囊膜，雙層脂蛋白，是病毒識別攻擊宿主細(xì)胞所必不可少的；其內(nèi)為核衣殼。第四十六頁，共八十五頁，編輯于2023年，星期六第四十七頁，共八十五頁，編輯于2023年，星期六2.基因組結(jié)構(gòu)逆轉(zhuǎn)錄病毒，兩個拷貝的單股正鏈RNA；每個RNA長約9.7Kb，有5’帽，3’端有多聚尾；

HIV是一種高度變異的病毒；含有g(shù)ag、env和pol三個基因以及6種調(diào)控基因tat,vif,vpr,vpx,nef,rev。

第四十八頁，共八十五頁，編輯于2023年，星期六①gag基因編碼病毒的核心蛋白；②pol基因編碼病毒復(fù)制所需要的酶類（逆轉(zhuǎn)錄酶、整合酶和蛋白酶）；③env基因所編碼病毒包膜蛋白，是HIV免疫學(xué)診斷的主要檢測抗原。④調(diào)控基因編碼輔助蛋白，調(diào)節(jié)病毒蛋白合成和復(fù)制。

第四十九頁，共八十五頁，編輯于2023年，星期六（二）分子診斷方法抗體的檢測：酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）和免疫熒光檢測法（IFA）；感染2周后才能逐漸產(chǎn)生病毒抗體；抗原的檢測：酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）檢測P24抗原，靈敏度低第五十頁，共八十五頁，編輯于2023年，星期六1.病毒載量檢測感染者體內(nèi)HIV的定量檢測，對病情判斷和治療效果檢測極有價值。目前常用三種技術(shù)：

RT-PCR最低檢測限50拷貝/mlbDNA最低價測限50拷貝/mlNASBA最低檢測限20拷貝/ml第五十一頁，共八十五頁，編輯于2023年，星期六PCRRNA逆轉(zhuǎn)錄cDNA整合到宿主基因組中復(fù)制，以被感染細(xì)胞DNA為模板PCR擴(kuò)增；

HIV為高變異病毒，不同患者體內(nèi)分離的病毒基因結(jié)構(gòu)有差異，引物設(shè)計應(yīng)根據(jù)各編碼區(qū)的保守序列設(shè)計；靈敏度高，特別是用于無癥狀HIV感染者。

第五十二頁，共八十五頁，編輯于2023年，星期六擴(kuò)增位置引物序列擴(kuò)增片斷（bp)

gag基因5’-GAACTTTAAATGCATGGGTAAA-3’3425’-CCAGTAGGAGAAATCTATAAAA-3’

gap基因5’-ATAATCCACCTATCCCAGATAGGAGAAATC-3’1155’-TTTGGTCCTTGTCTTATGTCCAGAATCC-3’

pol基因5‘-TAGAATTCCTCAGATCACTCTT-3’3605’-GCAAGCTTATGGGCCATCCATTCC-3’

第五十三頁，共八十五頁，編輯于2023年，星期六2.病毒表型和耐藥檢測HIV表型主要依據(jù)逆轉(zhuǎn)錄酶和蛋白酶基因突變的檢測最常用的耐藥檢測方法是基因型檢測方法,即查找與病毒耐藥有關(guān)的基因突變。檢測病毒逆轉(zhuǎn)錄酶（RT）和蛋白酶（PI）基因的序列，然后把這些結(jié)果與已知的沒有發(fā)生突變的HIV（稱為野生株）基因序列進(jìn)行比較，與之不同的基因序列就認(rèn)為發(fā)生了突變。檢測出的任何突變都有可能導(dǎo)致形成HIV耐藥性，但具體結(jié)果的解釋必須要有非常有經(jīng)驗的專家和醫(yī)師來進(jìn)行。第五十四頁，共八十五頁，編輯于2023年，星期六（三）臨床意義1.原位雜交：可以顯示病毒感染的部位；2.PCR：可對無癥狀的感染者進(jìn)行早期診斷；3.病毒載量檢測：在臨床進(jìn)展情況的判定及療效觀察上極有價值。第五十五頁，共八十五頁，編輯于2023年，星期六第九章：細(xì)菌感染的分子生物學(xué)檢驗概述正常菌群：存在于人體表及與外界相通部位的細(xì)菌；條件致病菌：正常菌群與人體平衡破壞，引起疾病的一類細(xì)菌；病原菌：具有毒性和侵襲力的細(xì)菌，造成人體感染；第五十六頁，共八十五頁，編輯于2023年，星期六病原菌的診斷方法：①直接涂片法②生化試驗③血清學(xué)試驗④分離培養(yǎng)⑤動物實驗⑥分子生物學(xué)：靈敏、特異，可進(jìn)行早期診斷、分型、耐藥性檢測；不能確診或進(jìn)行分型、耐藥性的檢測，或費時等第五十七頁，共八十五頁，編輯于2023年，星期六

全世界1/5人口感染，每年約300萬死于結(jié)核，中國占70%，免疫低下個體特別是HIV感染者更易于感染結(jié)核分枝桿菌。結(jié)核分枝桿菌為革蘭氏陽性菌，細(xì)長略帶彎曲，分枝狀，有莢膜，抗酸染色陽性，對多種抗生素有抵抗力。一.結(jié)核分枝桿菌第五十八頁，共八十五頁，編輯于2023年，星期六形態(tài)

第五十九頁，共八十五頁，編輯于2023年，星期六(一)基因組結(jié)構(gòu)

1.TBH37Rv株基因組是環(huán)狀雙鏈DNA，共有4411529bp;2.共有4033基因，功能已知的有1734個,1694個可能為新基因;3.基因組中有許多藥物抗性因子的編碼序列，包括水解酶或者藥物修飾酶。

第六十頁，共八十五頁，編輯于2023年，星期六第六十一頁，共八十五頁，編輯于2023年，星期六第六十二頁，共八十五頁，編輯于2023年，星期六（二）分子診斷方法

普通PCR、FQ-PCR、競爭性PCR、免疫雜交PCR

擴(kuò)增靶序列：

65KDa抗原基因（細(xì)菌細(xì)胞壁上蛋白）

MPB蛋白基因（結(jié)核桿菌復(fù)合群特有）

rRNA基因（種屬鑒定）

ISDNA6110插入序列第六十三頁，共八十五頁，編輯于2023年，星期六靶序列引物序列擴(kuò)增片斷（bp）

IS6110插入5‘-CCTGCGAGCGTAGGCGTCGG-3’3175’-TCAGCCGCGTCCACGCCGCCA-3’

16SrRNA5’-GGTGGTTTGTCGCGTTGTTC-3’4635’-TGCACACAGGCCACAAGGGA-3’

DNA重復(fù)序列5’-CGTGAGGGCATCGAGGTGGC-3’2455’-GCGTAGGCGTCGGTGACAAA-3’

第六十四頁，共八十五頁，編輯于2023年，星期六TB耐藥檢測利福平耐藥-RNA聚合酶rpoB基因異煙肼耐藥-katG基因鏈霉素耐藥-S12的rpsL基因

16SrRNA的rrs基因喹諾酮的耐藥-DNA解旋酶的gyrA和gyrB基因水解酶或藥物修飾酶（β-內(nèi)酰胺酶、氨基糖苷乙酰基轉(zhuǎn)移酶和藥物外排系統(tǒng)等）第六十五頁，共八十五頁，編輯于2023年，星期六細(xì)菌耐藥基因的檢測

細(xì)菌耐藥性的產(chǎn)生導(dǎo)致治療失敗、感染復(fù)發(fā)、增加昂貴抗生素的使用。機(jī)理：由于細(xì)菌基因組的變異，導(dǎo)致

1.細(xì)菌細(xì)胞外膜通透性改變；

2.產(chǎn)生滅活酶和鈍化酶，如-內(nèi)酰胺酶；

3.藥物作用靶位改變；

4.代謝途徑改變；第六十六頁，共八十五頁，編輯于2023年，星期六（三）臨床意義1.準(zhǔn)確、快速、早期診斷TB2.區(qū)分TB與其它分枝桿菌3.疫情監(jiān)控和抗癆治療療效的評價

第六十七頁，共八十五頁，編輯于2023年，星期六二、淋球菌

淋球菌是淋病的病原菌，人是淋球菌的唯一自然宿主。淋病在我國性傳播疾病種中，發(fā)病率居首位。淋球菌耐藥菌株的出現(xiàn)和流行對淋病的控制帶來很大困難。傳播途徑：1.直接性接觸感染

2.間接接觸感染

第六十八頁，共八十五頁，編輯于2023年，星期六第六十九頁，共八十五頁，編輯于2023年，星期六（一）基因組結(jié)構(gòu)

1.染色體分子量980M，可編碼約5000個基因，GC含量為50%；

2.無操縱子結(jié)構(gòu)

3.含有1至數(shù)個質(zhì)粒（2.6MDa，24.5MDa），通過質(zhì)粒介導(dǎo)耐藥性在不同菌株間的轉(zhuǎn)移；

第七十頁，共八十五頁，編輯于2023年，星期六第七十一頁，共八十五頁，編輯于2023年，星期六（二）分子診斷1.PCR:

擴(kuò)增的靶序列：編碼外膜蛋白Ⅲ的結(jié)構(gòu)基因，或16SrRNA基因、CPPB基因（同時存在于染色體及質(zhì)粒上）

第七十二頁，共八十五頁，編輯于2023年，星期六靶序列引物序列擴(kuò)增片斷（bp）

CPPB基因5’-GTTTGGCTGGTTGATTCAAG-3’6335’-GCAAGATTTCCGATTTGGCG-3’

外膜蛋白Ⅲ5’-TAAAGCAAGCCAAGGTCGCG-3’4945’-TTTTCACATCTACGCGGCGG-3’

5’-CCGAAGCTCAAGACAACCTC-3’

181第七十三頁，共八十五頁，編輯于2023年，星期六2.LCR（Ligasechainreaction

）連接酶鏈反應(yīng)(Ligasechainreaction，LCR)，是一種新的DNA體外擴(kuò)增和檢測技術(shù)，主要用于點突變的研究及靶基因的擴(kuò)增.

第七十四頁，共八十五頁，編輯于2023年，星期六原理：在PCR反應(yīng)體系中加入二對引物，加熱(94～95℃)使DNA變性，雙鏈打開，然后降溫退火(65℃)，引物與模板DNA結(jié)合并留下一缺口，如果引物與模板完全互補(bǔ)，DNA連接酶即連接封閉缺口，PCR反應(yīng)接著進(jìn)行，擴(kuò)增出大量的目標(biāo)DNA.若有點突變，引物不能與模板精確結(jié)合，缺口附近核苷酸的空間結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，連接酶不能封閉缺口，PCR反應(yīng)不能進(jìn)行，無擴(kuò)增產(chǎn)物生成，據(jù)此可判斷模板DNA中有無突變.第七十五頁，共八十五頁，編輯于2023年，星期六第七十六頁，共八十五頁，編輯于2023年，星期六（三）臨床意義

1.分子診斷技術(shù)具有靈敏性高、快速、特異性好的優(yōu)點，可檢測極微量的淋球菌。2.應(yīng)用于以下幾方面：對菌株進(jìn)行分型和耐藥性分析。抗生素治療效果的觀察。進(jìn)行流行病學(xué)分析。對疑似病例的診斷和鑒別診斷。第七十七頁，共八十五頁，編輯于2023年，星期六