DDP細胞順鉑敏感性的影響及機制探討

聲敏劑血卟啉對COC1/DDP細胞順鉑敏感性的影響及機制探討聲敏劑血卟啉對COC1/DDP細胞順鉑敏感性的影響及機制探討

：周曉莉,唐良萏,王燕,彭麗欽

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聲敏劑血卟啉對COC1/DDP細胞順鉑敏感性的影響及機制探討

接滅活耐藥卵巢癌細胞是醫(yī)學(xué)工亟待解決的關(guān)鍵問題,更是腫瘤康復(fù)中提高女性生產(chǎn)率和改善女性生活質(zhì)量的迫切需要。聲動力療法（SDT）是一種很有應(yīng)用前景的治療腫瘤的方法。大量討論表明,超聲加血卟啉(hematoporphyrin,Hp)比單獨超聲對腫瘤細胞更具有殺傷效果,血卟啉則無抗腫瘤效應(yīng)［1,2］。有報道說這種殺傷作用機制是通過誘導(dǎo)細胞凋亡［3］。在本試驗中,把超聲激活的血卟啉聯(lián)合順鉑作用于人卵巢癌順鉑耐藥細胞,觀看其殺傷的作用,以期降低卵巢癌對順鉑化療的耐藥。

1材料、儀器與方法

1.1材料

1.1.1試劑和儀器超聲增敏劑血卟啉購自Sigma公司,注射用順鉑購自齊魯制藥有限公司（國藥準字H37021358）,四甲基偶氮唑藍（MTT）、姆薩色素為Sigma公司。血卟啉和MTT均以生理鹽水配成5mg/ml的溶液,過濾除菌后4℃避光保存。超聲裝置為陜西師范高校聲學(xué)討論所研制,探頭面積為4.7cm2.1.1.2細胞系及培育腫瘤細胞株為人卵巢癌順鉑耐藥細胞株COC1/DDP（購自中科院上海細胞生物學(xué)討論所）。COC1/DDP在含有0.5μg/ml順鉑的完全培育基（50μg/ml青霉素,50μg/ml鏈霉素和10%胎牛血清的RPMI1640細胞培育基）37℃,5%CO2常規(guī)細胞培育、傳代。試驗前1周換用不含順鉑的完全培育基培育。

1.2方法

1.2.1MTT法檢測各試驗組對COC1/DDP細胞增殖的影響把細胞制成單細胞懸液,以每孔0.2×104個接種于96孔板中,每孔200μl完全培育基。12h后進行試驗干預(yù),按以下分組進行試驗干預(yù),A組(對比組):單純培育COC1/DDP細胞;B組(單純順鉑組):在細胞中加入順鉑,順鉑選0.625、1.25、2.5、5μg／ml4個濃度;C組(血卟啉+超聲組):血卟啉選0.0125、0.025、0.05、0.1mg/ml4個濃度,同時進行超聲照耀60s;D組(順鉑+血卟啉+超聲組):細胞液中加入順鉑和血卟啉,使其終濃度分別為0.625、1.25、2.5、5μg／ml和0.0125、0.025、0.05、0.1mg/ml,同時進行超聲照耀60s.每組設(shè)5個復(fù)孔,此時記為0d;于37℃、5%CO2的飽和濕度箱中連續(xù)培育和觀看,于3d后取出96孔板,1200r/min離心10min.去上清,加入180μl完全培育基和20μlMTT,37℃連續(xù)培育4h,離心后當心吸棄上清。再加入150μlDMSO,振蕩10min,充分溶解。選擇490nm,在酶標儀測定各孔吸光率。試驗重復(fù)3次。按下列公式求出增殖抑制率:腫瘤細胞增殖抑制率=［1(藥物處理組OD值空白對比組OD值)／(細胞對比組OD值空白對比組OD值)］×100％.

1.2.2PI/Hoechst染色檢測細胞凋亡狀況細胞生長達80%融合時消化傳代,以每孔0.3×104個接種于96孔板中,每孔200μl完全培育基。12h后進行試驗干預(yù),分組同前,72h后,每孔依次加入細胞染色緩沖液100μl、Hoechst染色液0.5μl、PI染色液0.5μl冰浴30min,PBS洗滌1次,再在熒光顯微鏡下觀看。計數(shù)凋亡細胞比例。

1.2.3免疫細胞化學(xué)檢測試驗干預(yù)后COC1/DDP細胞內(nèi)bcl2和bax表達的變化選取對數(shù)生長期的COC1/DDP細胞,制成單細胞懸液,按2×104/ml接種于24孔培育板,連續(xù)培育12h后按前述方法進行分組處理。各組細胞經(jīng)試驗處理后置于37℃,5%CO2孵箱中連續(xù)培育8h,收集細胞,涂布細胞于經(jīng)多聚賴氨酸處理過的載玻片上,室溫風(fēng)干,純丙酮室溫固定30min.按免疫組化試劑盒使用說明書分別進行:純甲醇加過氧化氫至0.5%,室溫30min以滅活內(nèi)源性過氧化物酶,蒸餾水洗滌后，滴加

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免抗bcl2(或bax)基因抗原的抗體,置濕盒中37℃,20min,0.01NPBS洗2min×3次后，滴加生物素化羊抗兔IgG,置濕盒中37℃,20min.0.01NPBS洗2min×3次后滴加SABC37℃,20min,0.01NPBS洗5min×4次后，DAB顯色10min,蒸餾水洗滌，蘇木素輕度復(fù)染、脫水、透亮?????、封片。光學(xué)顯微鏡下觀看細胞漿著色呈棕黃色的為陽性細胞,每張片隨機計數(shù)3個視野,每樣品取5張片的平均值為陽性表達率。

1.3統(tǒng)計學(xué)方法

所獲試驗數(shù)據(jù)均以均數(shù)±標準差(±s)表示,采納SPSS12.0統(tǒng)計軟件進行單因素方差分析,進行單因素方差分析和顯著性檢驗。預(yù)先用HomogeneityofVariances進行方差齊性檢驗,如方差齊采納LSD檢驗,如方差不齊采納TamhaaeT2檢驗,P0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2結(jié)果

2.1MTT法檢測各試驗組對COC1/DDP細胞增殖的影響

順鉑、血卟啉、順鉑和血卟啉聯(lián)用對COC1/DDP細胞增殖的影響（見表1、2）,兩種方法聯(lián)用的增殖抑制率隨著各自濃度的增加而增加,各組與對比組差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.01)。表1順鉑和血卟啉聯(lián)合作用下COC1/DDP細胞的細胞增殖MTT試驗OD值表2順鉑和血卟啉聯(lián)合作用下COC1/DDP細胞的增殖抑制率

2.2順鉑和血卟啉聯(lián)合應(yīng)用對COC1/DDP細胞凋亡的影響

順鉑組和血卟啉組的凋亡率高于空白對比組,其差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05);血卟啉＋順鉑組與血卟啉組和順鉑組相比,其凋亡率高于血卟啉組和順鉑組,其差異均有顯著性(P0.05)。提示血卟啉和順鉑都對COC1/DDP細胞有促進凋亡的作用,而且血卟啉和

順鉑聯(lián)用能夠加強這種促進作用(見表3、圖1)。表3順鉑和血卟啉聯(lián)合作用下COC1/DDP細胞的凋亡率

2.3免疫細胞化學(xué)檢測試驗干預(yù)后COC1/DDP細胞內(nèi)bcl2和bax表達的變化

bcl2免疫組化染色光學(xué)顯微鏡下觀看到空白對比組和順鉑組中可見很多細胞內(nèi)胞漿呈棕黃色,高倍鏡下可見胞漿內(nèi)有大量棕黃色顆粒,而血卟啉+超聲組和順鉑+血卟啉+超聲組此種細胞明顯削減。Bax蛋白的免疫組化染色可見在血卟啉+超聲組和順鉑+血卟啉+超聲組中有較多的胞漿呈棕黃色顆粒的細胞,而對比組和順鉑中的此種細胞較少,bcl2蛋白及bax表達陽性率（見表4）。統(tǒng)計分析結(jié)果表明:血卟啉+超聲組和順鉑+血卟啉+超聲組的bcl2蛋白陽性表達率顯著降低(P0.05),而空白對比組和順鉑組的細胞內(nèi)bcl2蛋白陽性表達率差異無顯著性(P0.05)。bax蛋白陽性表達率在各組表達差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)(見表4、圖2)。表4順鉑和血卟啉聯(lián)合作用下COC1/DDP細胞的bcl2蛋白及bax表達陽性率

3爭論

聲動力療法（SDT）是指對腫瘤患者靜脈注射聲敏劑,而后用肯定頻率和強度超聲輻射腫瘤部位,使聚集在腫瘤部位聲敏劑產(chǎn)生抗腫瘤因子而殺傷腫瘤細胞,抑制腫瘤的生長。有學(xué)者認為由于超聲發(fā)生空化作用,其結(jié)果是來源于聲敏劑的自由基,再與氧分子反應(yīng)生成過氧基和烷氧基,過氧基和烷氧基與溶液中的有機分子反應(yīng)活性低,更易于到達靶細胞的表面,破壞癌細胞的脂質(zhì)和細胞膜,導(dǎo)致膜通透性增加而損傷細胞,此外,過氧基和烷氧基還可以導(dǎo)致癌細胞內(nèi)蛋白質(zhì)變性,染色體變異等破壞細胞。目前認為較好的聲敏劑仍是卟啉類為主［4］,因此本試驗選擇血卟啉做聲敏劑能對超聲有良好的敏感性,產(chǎn)生大量活性氧對細胞進行殺傷作用。

本試驗發(fā)覺,CO

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C1／DDP細胞對順鉑明顯耐藥,血清峰值濃度(2.5g／ml)以下的順鉑對COC1／DDP細胞增殖未見明顯影響,這與文獻報道基本全都［5］。但與血卟啉合用時,血清峰值濃度以下的順鉑明顯抑制了COC1／DDP細胞增殖。提示超聲激活的血卟啉能夠提高耐藥的卵巢癌細胞COC1／DDP對順鉑的敏感性,從而增加順鉑對該細胞的殺傷作用。干擾細胞周期并誘導(dǎo)凋亡是順鉑治療腫瘤的重要途徑,而血清峰值濃度的順鉑對COC1／DDP的凋亡率幾乎無影響,但與血卟啉合用時,可致細胞凋亡率明顯上升，這提示超聲激活的血卟啉提高耐藥細胞株COC1／DDP對順鉑敏感性的機制可能是恢復(fù)了耐藥細胞株的凋亡途徑,從而恢復(fù)了順鉑治療腫瘤的作用。

細胞凋亡是在基因掌握下的細胞自身消亡過程,涉及一系列的基因表達的級聯(lián)反應(yīng),受凋亡抑制基因（bc12/bax）和凋亡促進基因的調(diào)控。順鉑可以誘導(dǎo)細胞凋亡,但耐藥卵巢癌細胞中bc12/bax明顯增高,這是導(dǎo)致細胞耐藥的重要緣由之一。因此,抗腫瘤治療中,有效地降低bc12/bax含量是取得療效的關(guān)鍵之一。

已有討論發(fā)覺,提高細胞內(nèi)活性氧的水平,細胞凋亡的發(fā)生率明顯增加,認為細胞內(nèi)的ROS作為一種信使分子在調(diào)控細胞生存及凋亡過程中起關(guān)鍵作用［6,7］。1988年,Vaux等［8］首先證明bcl2基因高表達可明顯延長細胞的生存周期。體外討論亦表明bcl2可阻擋很多刺激物誘發(fā)的細胞凋亡,且bcl2的抑制可能是細胞凋亡的共同通道［9］。bax是bcl2家族的另一成員,與bcI2形成異二聚體,也對細胞凋亡進行調(diào)控［10］。在體內(nèi),bcl2與bax相互影響,相互拮抗,其作用并不直接表現(xiàn)為單獨的bcl2和bax對凋亡的影響,而是由bcl2／bax來打算細胞是否發(fā)生凋亡。討論顯示，bc12／bax比值降低,可使腫瘤細胞發(fā)生凋亡,作為細胞調(diào)亡調(diào)控的主要因子bcl2蛋白家族,尤其是bcl2和bax的相互作用在調(diào)亡的調(diào)整中起關(guān)鍵作用。本試驗的bcl2蛋白及bax蛋白免疫細化染色結(jié)果顯示，超聲激活的血卟啉聯(lián)合順鉑作用人卵巢癌細胞株COC1/DDP，bcl2蛋白水平顯著低于對比組(P0.05);而順鉑組和對比組比較,bcl2蛋白陽性表達率差異無統(tǒng)計學(xué)意義。說明超聲激活的血卟啉聯(lián)合順鉑作用可以降低人卵巢癌細胞株COC1/DDP的bcl2蛋白的表達水平,bax蛋白表達水平在試驗組及對比組差異均無統(tǒng)計學(xué)意義,提示聲動力作用是通過下凋bcl2蛋白的水平,使bcl2／bax的比值下降來促進人卵巢癌細胞株COC1/DDP發(fā)生凋亡。

聲動力療法（SDT）是繼手術(shù)、放療、化療后新興的一種腫瘤治療手段,具有無創(chuàng)、細胞毒性低、選擇性殺傷等優(yōu)點。本試驗僅初步討論了超聲激活的血卟啉聯(lián)合順鉑對耐藥的卵巢癌細胞的作用,還需要進一步增加超聲的劑量,將血卟啉的濃度范圍擴大,找出三者協(xié)同作用的最佳比例,為以后應(yīng)用于臨床供應(yīng)理論基礎(chǔ)。

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