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IP屬地：廣東 上傳時(shí)間：2023-05-29 格式：PPT 頁(yè)數(shù)：102 大?。?6.03MB 積分：15 舉報(bào) 版權(quán)申訴

第九章核酸的分離與提純?cè)斀庋菔疚母瀹?dāng)前第1頁(yè)\共有102頁(yè)\編于星期三\9點(diǎn)優(yōu)選第九章核酸的分離與提純當(dāng)前第2頁(yè)\共有102頁(yè)\編于星期三\9點(diǎn)核酸的種類

脫氧核糖核酸（DNA）：細(xì)胞核，單鏈或雙鏈

核糖體RNA

核糖核酸（RNA）轉(zhuǎn)運(yùn)RNA

信使RNA細(xì)胞質(zhì)，單鏈或雙鏈當(dāng)前第3頁(yè)\共有102頁(yè)\編于星期三\9點(diǎn)但無(wú)論哪核酸，在生物體中一般以核蛋白的形式存在，因此，為了提取制備核酸，必須將核蛋白解聯(lián)（即利用接聯(lián)劑將核蛋白裂解為核酸和蛋白）并去除蛋白，同時(shí)必須維持核酸的天然性狀，不使核酸發(fā)生變性或降解，操作上盡量簡(jiǎn)化操作步驟，縮短操作時(shí)間，以減少各種不利因素對(duì)核酸的破壞，同時(shí)要求去蛋白迅速?gòu)氐住榱吮ＷC分離核酸的完整性及純度，在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，應(yīng)注意以下條件和要求：當(dāng)前第4頁(yè)\共有102頁(yè)\編于星期三\9點(diǎn)（1）盡量避免化學(xué)因素對(duì)核酸的降解

過(guò)酸或過(guò)堿以及其他化學(xué)因素將破壞多聚核苷酸鏈的磷酸二酯鍵，使核酸降解；核酸（特別是RNA）在堿性溶液中十分容易降解.因此抽提介質(zhì)的pH常以5.5-9.0為宜。當(dāng)前第5頁(yè)\共有102頁(yè)\編于星期三\9點(diǎn)（2）減少物理因素對(duì)核酸的降解

物理因素主要是機(jī)械剪切力，包括強(qiáng)烈震蕩、攪拌、細(xì)胞突然置于低滲溶液中，以及讓溶液快速通過(guò)狹長(zhǎng)的孔道；其次是凍融、高溫煮沸和輻射等，均將導(dǎo)致核酸的降解。機(jī)械剪切力主要破壞大分子量的線性DNA分子，而對(duì)分子量小的環(huán)狀質(zhì)粒DNA及RNA分子，破壞相對(duì)較小。當(dāng)前第6頁(yè)\共有102頁(yè)\編于星期三\9點(diǎn)(3)防止核酸的生物降解細(xì)胞內(nèi)外各種核酸酶可作用于磷酸二酯鍵，直接破壞核酸的一級(jí)結(jié)構(gòu)，使其降解；DNA酶需要Mg2+、Ca2+的激活，因此實(shí)驗(yàn)中常加入EDTA、檸檬酸鹽，以絡(luò)合核酸酶作用時(shí)所必需的Mg2+離子，以抑制DNA酶的活性；制備RNA則需克服核糖核酸酶（RNase）的降解作用。因?yàn)镽Nase不但分布廣泛，極易污染，而且耐高溫，即使加熱到蛋白變性，Rnase的活力也不會(huì)完全喪失，且具有驚人的回復(fù)力，而細(xì)胞內(nèi)的核蛋白又總是和它聯(lián)在一起，若去除不徹底，它將部分恢復(fù)活力，導(dǎo)致RNA降解。當(dāng)前第7頁(yè)\共有102頁(yè)\編于星期三\9點(diǎn)生物降解是RNA提取過(guò)程的主要危害，儲(chǔ)存的RNA制品也不例外，因此，為了抑制核酸酶的活性，一般在低溫下（4℃或0℃，甚至-20℃左右）進(jìn)行。進(jìn)行核酸分離時(shí)最好用新鮮生物組織或細(xì)胞樣品，若不能馬上進(jìn)行提取，應(yīng)將材料置液氮中或-80℃冰箱保存。當(dāng)前第8頁(yè)\共有102頁(yè)\編于星期三\9點(diǎn)分離純化核酸總的原則一是應(yīng)保證核酸一級(jí)結(jié)構(gòu)的完整性，這是研究核酸結(jié)構(gòu)與功能的最基本要求；二是要排除蛋白質(zhì)、脂類、糖類等其他物質(zhì)的污染。純化的樣品不應(yīng)存在對(duì)酶有抑制作用的有機(jī)溶劑或過(guò)高濃度的金屬離子；蛋白質(zhì)、脂類、糖類等的污染應(yīng)降低到最低程度；無(wú)其他核酸的污染，如提取DNA時(shí)，應(yīng)去除RNA。當(dāng)前第9頁(yè)\共有102頁(yè)\編于星期三\9點(diǎn)一般程序

1、供體的核酸分離

供體細(xì)胞培養(yǎng)收集(菌體)細(xì)胞細(xì)胞破碎分離總DNA分離細(xì)胞器分離總RNA分離細(xì)胞器DNARNApoly(A)RNA特異性RNA

染色體DNA(組建基因組文庫(kù))當(dāng)前第10頁(yè)\共有102頁(yè)\編于星期三\9點(diǎn)2、載體DNA分離

載體DNA感染或轉(zhuǎn)染細(xì)胞（病毒型）轉(zhuǎn)化細(xì)菌細(xì)胞（質(zhì)粒型）分離病毒顆粒培養(yǎng)轉(zhuǎn)化細(xì)胞、收集菌體

病毒載體DNA分離與純化破碎細(xì)胞

質(zhì)粒DNA分離與純化當(dāng)前第11頁(yè)\共有102頁(yè)\編于星期三\9點(diǎn)3、DNA片段的分離DNA限制酶切凝膠電泳分離特定DNA片段的回收4、質(zhì)量評(píng)估

1）

凝膠電泳2）光密度值測(cè)定3）限制酶切分析當(dāng)前第12頁(yè)\共有102頁(yè)\編于星期三\9點(diǎn)第二節(jié)核酸制備的基本方法當(dāng)前第13頁(yè)\共有102頁(yè)\編于星期三\9點(diǎn)核酸制備的步驟（1）抽提組織或細(xì)胞的破碎、消融。抽提核酸必須事先將生物材料破碎或消融，這關(guān)系到核酸回收率的高低。破碎與消融組織細(xì)胞，通常有使用勻漿器、搗碎器的機(jī)械方法以及溫和的反復(fù)凍融法，使用表面活性劑或各種酶處理的方法。當(dāng)前第14頁(yè)\共有102頁(yè)\編于星期三\9點(diǎn)（2）抽提核酸，去除與核酸結(jié)合的蛋白質(zhì)、多糖、脂類，去除鹽、有機(jī)溶劑等雜質(zhì)，以及去除其他不需要的核酸分子；（3）核酸的精制純化。當(dāng)前第15頁(yè)\共有102頁(yè)\編于星期三\9點(diǎn)一、細(xì)胞的破碎一般動(dòng)物組織的細(xì)胞膜較脆弱，易破碎，而植物和微生物的細(xì)胞比較牢固。細(xì)胞破碎的方法很多，可根據(jù)組織特性和核酸分離目的加以選擇。當(dāng)前第16頁(yè)\共有102頁(yè)\編于星期三\9點(diǎn)1．物理方法(1)機(jī)械碾碎對(duì)于動(dòng)物組織(如鼠肝、兔肝等)，一般多采用勻漿的方法。即將組織剪碎置研缽中，研碎。為了提高研磨效果，可加入一定量的石英砂。但要注意石英砂對(duì)有效成分的吸附作用。用勻漿器處理，也能把動(dòng)物細(xì)胞破碎，此法較溫和，適于實(shí)驗(yàn)室應(yīng)用。若需大規(guī)模生產(chǎn)，則可用電動(dòng)研磨法，酵母、植物組織的細(xì)胞破碎也可用此法。當(dāng)前第17頁(yè)\共有102頁(yè)\編于星期三\9點(diǎn)(2)組織搗碎器法是一種劇烈的破碎細(xì)胞的方法。搗碎器(8000-10000r/min)處理30～45s，植物和動(dòng)物細(xì)胞能完全破碎。若用它破碎酵母菌和細(xì)菌的細(xì)胞，則需加入石英砂方才有效。在搗碎期間必須保持低溫，以防溫度升高引起有效成分變性，同時(shí)搗碎的時(shí)間不宜太長(zhǎng)。當(dāng)前第18頁(yè)\共有102頁(yè)\編于星期三\9點(diǎn)(3)超聲波法是借助聲波的振動(dòng)力破碎細(xì)胞壁和細(xì)胞器的有效方法。由于細(xì)菌的外部有一層細(xì)胞壁，破壁較為困難，因此用超聲波處理細(xì)菌和酵母的時(shí)問(wèn)要長(zhǎng)一點(diǎn)。有些菌體破碎需要5～l0min或更長(zhǎng)，如果在細(xì)胞浮液中加石英砂則可縮短時(shí)間。為了防止電器長(zhǎng)時(shí)間運(yùn)轉(zhuǎn)產(chǎn)生過(guò)多的熱量，常采用間歇處理和降低溫度的方法進(jìn)行。當(dāng)前第19頁(yè)\共有102頁(yè)\編于星期三\9點(diǎn)(4)壓榨法是一種溫和、徹底破碎細(xì)胞的方法。即用高壓迫使幾十毫升細(xì)胞懸液通過(guò)一個(gè)小于細(xì)胞直徑的小孔，致使細(xì)胞被擠壓破碎。當(dāng)前第20頁(yè)\共有102頁(yè)\編于星期三\9點(diǎn)2．溶脹和自溶當(dāng)前第21頁(yè)\共有102頁(yè)\編于星期三\9點(diǎn)(1)溶脹概念：在低滲溶液，如低濃度的稀鹽溶液中，由于存在滲透壓差，溶劑分子將大量進(jìn)入細(xì)胞，致使細(xì)胞膜膨脹破裂的現(xiàn)象稱為溶脹。步驟：將細(xì)胞置低溫下冰凍一定時(shí)間，然后取出至室溫下(或40℃左右)迅速融解。如此反復(fù)凍融多次，細(xì)胞可在形成冰粒和增高胞液鹽濃度的同時(shí)，發(fā)生溶脹，以致破碎。當(dāng)前第22頁(yè)\共有102頁(yè)\編于星期三\9點(diǎn)(2)自溶概念：細(xì)胞結(jié)構(gòu)在本身所具有的各種水解酶作用下，發(fā)生溶解的現(xiàn)象稱為自溶。注意：應(yīng)用此法時(shí)要特別小心操作，因?yàn)樗饷覆粌H可破壞細(xì)胞壁、細(xì)胞膜，同時(shí)也可使某些有效成分在自溶時(shí)分解。當(dāng)前第23頁(yè)\共有102頁(yè)\編于星期三\9點(diǎn)3．化學(xué)處理用脂溶性的溶劑(如丙酮、氯仿、甲苯等)或表面活性劑(如十二烷基硫酸鈉)處理細(xì)胞時(shí)，可使細(xì)胞壁和細(xì)胞膜的結(jié)構(gòu)部分溶解，導(dǎo)致整個(gè)細(xì)胞破碎。當(dāng)前第24頁(yè)\共有102頁(yè)\編于星期三\9點(diǎn)4．生物酶降解生物酶有降解細(xì)菌細(xì)胞壁的功能。在用此法處理細(xì)菌細(xì)胞時(shí)，先是細(xì)胞壁消融，隨之而來(lái)的是因滲透壓差引起的細(xì)胞膜破裂，最后導(dǎo)致細(xì)胞完全破碎。當(dāng)前第25頁(yè)\共有102頁(yè)\編于星期三\9點(diǎn)二、核酸提取的基本方法當(dāng)前第26頁(yè)\共有102頁(yè)\編于星期三\9點(diǎn)1．去垢劑(SDS)法SDS(sodiumdodecylsulfate)：即十二烷基硫酸鈉，是一種有效的細(xì)胞消溶劑、核酸酶抑制和蛋白變性劑，也是一種去污劑。去垢劑法由Marmur于1961年創(chuàng)建，最早用于從細(xì)菌中提取DNA。當(dāng)前第27頁(yè)\共有102頁(yè)\編于星期三\9點(diǎn)原理：抽提核酸時(shí)利用SDS的非極性基團(tuán)破壞蛋白質(zhì)分子的次級(jí)鍵，使蛋白質(zhì)變性，達(dá)到使核蛋白解聯(lián)、變性和去除蛋白的目的。變性后的蛋白仍留在溶液中不生成沉淀。為了將同時(shí)存在于溶液中的核酸和蛋白分開(kāi)，可在室溫條件下加入1/2體積飽和硫酸銨使蛋白沉淀。特點(diǎn)：此法得率高，對(duì)核酸影響小，但制品中仍殘留微量蛋白。SDS在低溫或有兩價(jià)金屬離子或鉀離子存在時(shí)將形成沉淀，使用時(shí)應(yīng)該注意。當(dāng)前第28頁(yè)\共有102頁(yè)\編于星期三\9點(diǎn)2．酚抽提法酚也是一種蛋白表面變性劑。球狀蛋白在水溶液中其親水性氨基酸殘基的側(cè)鏈位于外側(cè)，疏水性氨基酸的側(cè)鏈位于內(nèi)側(cè)，酚法于1957年為Kirby建立，最早用于DNA的抽提。當(dāng)前第29頁(yè)\共有102頁(yè)\編于星期三\9點(diǎn)酚的作用機(jī)制:可能是插入蛋白結(jié)構(gòu)的內(nèi)部，破壞各種氨基酸殘基側(cè)鏈基團(tuán)問(wèn)的次級(jí)鍵，使蛋白的結(jié)構(gòu)翻轉(zhuǎn)，即原來(lái)存在于內(nèi)側(cè)的疏水性氨基酸殘基側(cè)鏈轉(zhuǎn)向外側(cè)，而外側(cè)的親水性氨基酸殘基側(cè)鏈則轉(zhuǎn)向內(nèi)側(cè)，導(dǎo)致蛋白質(zhì)變性。酚還能使核酸酶失活。當(dāng)前第30頁(yè)\共有102頁(yè)\編于星期三\9點(diǎn)3．CTAB法CTAB(eetyltriethylammoniumbromide):即十六烷基三乙基溴化銨，是一種去污劑。特點(diǎn)：此法相對(duì)較為簡(jiǎn)單，特別適用于植物材料，已成功地從一系列的單子葉和雙子葉植物中提取出總DNA。此法提取植物DNA時(shí)，可采用氯仿/異戊醇反復(fù)抽提去蛋白，通過(guò)高鹽緩沖液的選擇性沉淀去除多糖類雜質(zhì).當(dāng)前第31頁(yè)\共有102頁(yè)\編于星期三\9點(diǎn)機(jī)制：可溶解細(xì)胞膜，能與核酸形成復(fù)合物，該復(fù)合物在高鹽溶液中(0.7mol/LNaCl)是可溶的，當(dāng)溶液鹽濃度降低到一定程度(0.3mol/I．NaCl)時(shí)，卻會(huì)從溶液中沉淀出來(lái)，因此通過(guò)離心便可將CTAB與核酸的復(fù)合物同蛋白質(zhì)、多糖類物質(zhì)分開(kāi)。然后將此復(fù)合物沉淀溶解于高鹽溶液，再加入乙醇使核酸沉淀，因CTAB溶解于乙醇，離心后即可得DNA沉淀。當(dāng)前第32頁(yè)\共有102頁(yè)\編于星期三\9點(diǎn)優(yōu)點(diǎn)既適用于新鮮的植物，也可用于經(jīng)脫水處理的材料，能夠很好地去除多糖類雜質(zhì)，對(duì)于含糖較高的植物材料可優(yōu)先采用。另一優(yōu)點(diǎn)是提取的前期能同時(shí)得到高含量的DNA及RNA，如果后續(xù)實(shí)驗(yàn)對(duì)兩者都有需要，則可分別進(jìn)行純化。如只需要DNA，則加入RNase除去RNA；若只需RNA，則加入DNase去掉DNA。該法制得的DNA雖然純度不很高，但仍能滿足限制性內(nèi)切核酸酶分析、PCR反應(yīng)以及DNA重組克隆的要求。當(dāng)前第33頁(yè)\共有102頁(yè)\編于星期三\9點(diǎn)4．濃鹽法機(jī)制：高濃度的鹽可以破壞核酸和蛋白質(zhì)之間的次級(jí)鍵，使核蛋白解聯(lián)。一般先用lmol/LNaCl或lmol/LNaClO4進(jìn)行抽提，再加入氯仿/異戊醇離心去蛋白，最后用甲醇或異丙醇使核酸沉淀。其中的氯仿可以使蛋白表面變性，幫助去蛋白。異戊醇可以消泡以維持離心層的穩(wěn)定。特點(diǎn)：該法對(duì)核酸的損傷較小，但由于去除蛋白不夠徹底，常與其他方法結(jié)合使用。當(dāng)前第34頁(yè)\共有102頁(yè)\編于星期三\9點(diǎn)5．高通量的RNA分離技術(shù)當(dāng)前第35頁(yè)\共有102頁(yè)\編于星期三\9點(diǎn)(1)微量移液法(micropipeting)由Karrwer等人于1995年建立的一種方法。特點(diǎn)：此法借助毛細(xì)管或微量移液管直接提取細(xì)胞的內(nèi)含物，進(jìn)行RNA抽提。當(dāng)前第36頁(yè)\共有102頁(yè)\編于星期三\9點(diǎn)操作過(guò)程用激光移液管拉伸器(1aserpipettepuller)將毛細(xì)石英管拉成孔徑為l0um的微量移液管，將其頂端彎曲23°，以便穿透細(xì)胞壁。微量移液管被安裝在連接了氣泵的微操縱器上，通過(guò)負(fù)壓將大約1ulRNA提取液(100mmol/LTris-HCl，pH8.0；500mmol/LLiCl；10mmol/LEDTA；1%SDS；5mmol/LDTT)壓入微量移液管。裝有提取液的微量移液管被降低到葉片表面，微量移液管頂點(diǎn)的那一小滴提取液在275kPa氣壓作用下被排出.當(dāng)前第37頁(yè)\共有102頁(yè)\編于星期三\9點(diǎn)一旦微量移液管尖端被清空后，立即供給1.3kPa的負(fù)壓，這時(shí)微量移液管就插入到目的細(xì)胞內(nèi)。一經(jīng)插入，細(xì)胞內(nèi)含物就被吸進(jìn)微量移液管?？梢悦黠@地看到，細(xì)胞立刻癟了下去。然后，微量移液管離開(kāi)細(xì)胞，內(nèi)含物被注入到10u1RNA提取液中，用69kPa和1.3kPa正、負(fù)壓反復(fù)作用，以便將微量移液管頂端漂洗干凈。此法可直接從葉片的表皮細(xì)胞、防御細(xì)胞以及葉肉細(xì)胞中提取mRNA，而葉片卻不受到損傷。當(dāng)前第38頁(yè)\共有102頁(yè)\編于星期三\9點(diǎn)隨后，再加入10u1RNA提取液，其中含有50ug連接了oligo(dT)-的磁力珠，混合均勻，22℃下靜置l0min。再用2ou11倍的反轉(zhuǎn)錄緩沖液(50mmol/Ltris-HCl，pH8.3；75mmol/LKCl；3mmol/LMgCl2；10mmol/LDTT)洗兩次，即可將結(jié)合在磁力珠上的mRNA洗脫下來(lái)。當(dāng)前第39頁(yè)\共有102頁(yè)\編于星期三\9點(diǎn)當(dāng)前第40頁(yè)\共有102頁(yè)\編于星期三\9點(diǎn)(2)激光微解剖法(1aser—capturemicrodissection，LCM)該法是將一塊被冷凍或被石蠟包埋的組織切成薄片，然后所需要的部位被激光解剖下來(lái)，再利用黏膜通過(guò)靜電作用迅速地將其吸附，并立即轉(zhuǎn)移到RNA提取液中。當(dāng)前第41頁(yè)\共有102頁(yè)\編于星期三\9點(diǎn)當(dāng)前第42頁(yè)\共有102頁(yè)\編于星期三\9點(diǎn)優(yōu)點(diǎn)：①它減少了對(duì)組織的處理，可避免RNA表達(dá)輪廓(profile)的改變；②因?yàn)槟承?shí)驗(yàn)，特別是對(duì)時(shí)鐘基因的研究，時(shí)間因素至關(guān)重要，采用此法可減少采樣時(shí)間對(duì)實(shí)驗(yàn)的影響。當(dāng)前第43頁(yè)\共有102頁(yè)\編于星期三\9點(diǎn)(3)原生質(zhì)體分離法(protoplastingandsorting)特點(diǎn)：是一種快速而準(zhǔn)確地從分生組織的細(xì)胞中提取RNA的技術(shù)，已應(yīng)用于擬南芥根系全球性基因表達(dá)圖譜的制作。原理：首先需將熒光蛋白基因轉(zhuǎn)入受體細(xì)胞，用酶處理破壁后，通過(guò)紫外照射使那些表達(dá)綠色熒光蛋白的細(xì)胞產(chǎn)生熒光，再通過(guò)熒光感受分離儀(flurescence-activatedcellsorter，簡(jiǎn)稱FACS)將其從特定組織或區(qū)域中分離出來(lái)，進(jìn)而制得RNA當(dāng)前第44頁(yè)\共有102頁(yè)\編于星期三\9點(diǎn)當(dāng)前第45頁(yè)\共有102頁(yè)\編于星期三\9點(diǎn)三、核酸的濃縮和沉淀當(dāng)前第46頁(yè)\共有102頁(yè)\編于星期三\9點(diǎn)1．核酸的濃縮若溶液中DNA含量低，而且容積較大時(shí)，常需進(jìn)行濃縮，以便進(jìn)一步沉淀和純化。常用的核酸濃縮方法是真空干燥法。此法比較溫和，特別適用于小量樣品的濃縮。此外，還有以下兩種方法：當(dāng)前第47頁(yè)\共有102頁(yè)\編于星期三\9點(diǎn)(1)丁醇抽提濃縮法正丁醇或仲丁醇能吸收大量水，而DNA不溶于丁醇。利用該特性，向DNA溶液中反復(fù)加入等體積正丁醇或仲丁醇，振蕩混合后離心，去除有機(jī)相，可顯著減少DNA溶液的體積并濃縮DNA。當(dāng)前第48頁(yè)\共有102頁(yè)\編于星期三\9點(diǎn)(2)聚乙二醇(PEG)水沉淀法聚乙二醇同樣具有吸水能力。將DNA溶液裝入透析袋，包埋在聚乙二醇(分子量6000～12000為宜)中，聚乙二醇吸水液化，同時(shí)DNA溶液體積減小、可通過(guò)更換PEG干粉達(dá)到濃縮的目的。當(dāng)前第49頁(yè)\共有102頁(yè)\編于星期三\9點(diǎn)2．核酸的沉淀沉淀是濃縮核酸最常用的方法。其最大優(yōu)點(diǎn)是通過(guò)沉淀來(lái)改變和重新調(diào)節(jié)核酸溶液的濃度，并可去除溶液中某些鹽類和雜質(zhì)，在一定程度上將核酸純化。核酸是多聚陰陽(yáng)離子的水溶性化合物，它與鈉、鉀、鎂形成的鹽在多種有機(jī)溶劑中不溶解，也不會(huì)變性。常用的有機(jī)溶劑有乙醇、異丙醇、聚乙二醇等。當(dāng)前第50頁(yè)\共有102頁(yè)\編于星期三\9點(diǎn)(1)常用于沉淀核酸的鹽類及其濃度1)NaAc：沉淀DNA、RNA最常用的鹽類，終濃度為0．3mol/L(pH5.0)。2)NaCl：對(duì)于含有SDS的DNA樣品是優(yōu)先選用的試劑，終濃度為0.2mol/L。3)NHAc：4種dNTP在NHAc溶液中均具較高的溶解度，通過(guò)乙醇沉淀DNA，可去除大部分dNTP。當(dāng)前第51頁(yè)\共有102頁(yè)\編于星期三\9點(diǎn)4)KAc：沉淀效果與NaAc相同。終濃度為0.3mol/L。但核酸的鉀鹽很難溶于含SDS的溶液，若在下一步選用含SDS的緩沖液溶解核酸沉淀時(shí)，則不宜選用此法沉淀核酸。5)LiCl：在乙醇中溶解度非常好，在70％乙醇中不與DNA共沉淀，且高濃度0.8mol/L)時(shí)可直接沉淀大分子RNA(包括rRNA、mRNA)，故常用于RNA的沉淀。當(dāng)前第52頁(yè)\共有102頁(yè)\編于星期三\9點(diǎn)6)MgCl2：Mg2+是核酸沉淀中的有效離子，當(dāng)核酸濃度低于0.1ug/ml或其長(zhǎng)度小于100個(gè)核苷酸時(shí)，加入l0mmol/L的Mg2+可明顯提高核酸沉淀的回收率。Mg2+對(duì)核酸的沉淀并不需要低溫條件。即使在室溫條件下，10min之內(nèi)也比NaAc在0℃時(shí)沉淀DNA的效率高2倍。當(dāng)前第53頁(yè)\共有102頁(yè)\編于星期三\9點(diǎn)(2)沉淀核酸的有機(jī)溶劑1)乙醇：沉淀DNA一般首選乙醇，它對(duì)鹽類沉淀較少，含在DNA沉淀中的少量乙醇易被蒸發(fā)去除，不影響后續(xù)的實(shí)驗(yàn)。在適當(dāng)?shù)柠}濃度下，兩倍樣品容積的乙醇可有效沉淀DNA，對(duì)于RNA則需將乙醇用量增至2.5倍。當(dāng)前第54頁(yè)\共有102頁(yè)\編于星期三\9點(diǎn)優(yōu)點(diǎn)是所需的用量較少且速度快，適用于濃度低而體積大的DNA沉淀。0.54～1.0倍的異丙醇可選擇性地沉淀DNA和大分子rRNA和mRNA，但對(duì)5SRNA、tRNA及多糖不產(chǎn)生沉淀，一般不需在低溫條件下長(zhǎng)時(shí)間放置。缺點(diǎn)是易使鹽類與DNA共沉淀，在DNA沉淀中的異丙醇難以揮發(fā)除去，所以通常要用70％乙醇漂洗DNA沉淀數(shù)次.(2)異丙醇:當(dāng)前第55頁(yè)\共有102頁(yè)\編于星期三\9點(diǎn)(3)聚乙二醇(PEG)：可用不同濃度的PEG選擇沉淀不同分子量的DNA片段。應(yīng)用PEG6000進(jìn)行沉淀時(shí)，其使用濃度與DNA片段的大小成反比。PEG沉淀一般需要加入0.5mol/LNaCl或10mmol/LMgCl2。除去DNA沉淀中PEG的最簡(jiǎn)單有效的辦法是用70％的乙醇漂洗2次。當(dāng)前第56頁(yè)\共有102頁(yè)\編于星期三\9點(diǎn)(4)精胺(spermine)：精胺不是有機(jī)溶劑，但可快速有效地沉淀DNA，適用于少量DNA的純化。原理:精胺與DNA結(jié)合后，使DNA在溶液中結(jié)構(gòu)凝縮而發(fā)生沉淀，并可使單核苷酸和蛋白質(zhì)雜質(zhì)與DNA分子分開(kāi)，達(dá)到純化DNA的目的。對(duì)于大于60bp的DNA片段，其濃度在0.1～100ug/ml左右，也有很好的效果。沉淀DNA的要求是溶液中無(wú)鹽或低鹽(小于0.1mol/L)，最后可用70％的乙醇漂洗2次以去除DNA沉淀中的精胺。當(dāng)前第57頁(yè)\共有102頁(yè)\編于星期三\9點(diǎn)(3)核酸沉淀的離心力與離心時(shí)間大多數(shù)DNA的沉淀在0～4℃、12000g離心10min即可。若DNA片段小于100個(gè)核苷酸時(shí)，則需要超速離心。對(duì)于pg水平的核酸沉淀，應(yīng)加入tRNA作為載體共沉淀。當(dāng)前第58頁(yè)\共有102頁(yè)\編于星期三\9點(diǎn)四、核酸的純化當(dāng)前第59頁(yè)\共有102頁(yè)\編于星期三\9點(diǎn)方法:很多，如超速離心、柱層析、免疫沉淀、凝膠電泳等。實(shí)驗(yàn)室最常用的純化方法:酚/氯仿抽提法。該方法的標(biāo)準(zhǔn)程序是用酚抽提一次，酚/氯仿(1:1)抽提一次，氯仿抽提一次。如果情況需要可再重復(fù)幾次?；驹?是通過(guò)交替使用酚、氯仿這兩種不同的蛋白質(zhì)變性劑來(lái)增加去除蛋白質(zhì)的效果。當(dāng)前第60頁(yè)\共有102頁(yè)\編于星期三\9點(diǎn)1．低分子物質(zhì)的去除可以通過(guò)加入乙醇或用鹽溶液選擇性沉淀進(jìn)行分離，也可以通過(guò)透析除去。例如:在醋酸根離子存在下加入乙醇，或在高濃度的鹽溶液中，或于低溫下的33%硫酸銨介質(zhì)中，高分子量的RNA都可以沉淀。當(dāng)前第61頁(yè)\共有102頁(yè)\編于星期三\9點(diǎn)高分子物質(zhì)主要指蛋白質(zhì)和黏多糖.2．高分子物質(zhì)的去除當(dāng)前第62頁(yè)\共有102頁(yè)\編于星期三\9點(diǎn)去此類高分子物質(zhì)常用的方法有:如果核酸不是采用酚法制備的，可在對(duì)氨基水楊酸等化合物存在的條件下，將核酸制品連續(xù)用苯酚進(jìn)行處理，此時(shí)DNA和RNA均進(jìn)入水相，蛋白質(zhì)沉淀留在酚相。然后取水相加入乙醇或2-乙氧基乙醇沉淀RNA或DNA，也可以用酚或SDS反復(fù)搖蕩抽提。如果是用酚法制得的核酸，則大部分蛋白質(zhì)已被除去，若要進(jìn)一步除去其中的微量蛋白，可用氯仿/異戊醇或辛醇振蕩抽提，同時(shí)加熱處理使蛋白質(zhì)凝固形成沉淀，離心分離，核酸即留在溶液中。

當(dāng)前第63頁(yè)\共有102頁(yè)\編于星期三\9點(diǎn)第二個(gè)方法是Kirby創(chuàng)建并經(jīng)Ralph和Bellamy等改良的有機(jī)溶劑法。即在pH8的1.25mol/L磷酸緩沖液中，用2-甲氧基乙醇抽提，多糖溶于水相，核酸在有機(jī)相，加入CTAB(十六烷基三乙基溴化銨)沉淀核酸，然后在70%乙醇中用醋酸鈉處理，以鈉鹽的形式回收核酸。此外，也可以用鈣鹽沉淀DNA，再用草酸鉀處理形成DNA鉀鹽回收，然后用離子交換層析法吸附DNA使之與多糖分離。當(dāng)前第64頁(yè)\共有102頁(yè)\編于星期三\9點(diǎn)3．不同類型核酸的分離通?？刹捎妹柑幚?、有機(jī)溶劑抽提、鹽分步沉淀和密度梯度離心等方法。從DNA中除去RNA的有效方法是利用RNase選擇性地降解RNA。但由于RNase中常含有極微量的DNase，因而必須先將RNase試劑于80～100℃)加熱處理5～10min。反之，為了從RNA制品中除去DNA，可加入DNase降解DNA，加入的酶則利用酚法除去。其他除去DNA的常用方法是苯酚抽提法。當(dāng)前第65頁(yè)\共有102頁(yè)\編于星期三\9點(diǎn)4．同類核酸的分離在初步純化的RNA制品中，常含有各種RNA和某些降解RNA的混合物；在DNA制品中則往往含有變性或降解的DNA，通常多采用梯度離心、電泳、柱層析及反復(fù)萃取抽提等方法進(jìn)一步純化或分級(jí)分離。當(dāng)前第66頁(yè)\共有102頁(yè)\編于星期三\9點(diǎn)五、超離心技術(shù)在核酸分離中的應(yīng)用當(dāng)前第67頁(yè)\共有102頁(yè)\編于星期三\9點(diǎn)核酸的分離和純化，通常采用密度梯度離心法。密度梯度離心是一種帶狀分離法。密度梯度離心法包括密度梯度差速離心、等密度離心和浮力密度梯度離心。梯度溶液所使用的成分有蔗糖、甘油、氯化銫、氯化銣、右旋糖酐和蔗糖多聚物等。這些物質(zhì)本身對(duì)核酸、蛋白質(zhì)等具有化學(xué)惰性，因此不會(huì)導(dǎo)致其分子間的聚集，而且由于這些物質(zhì)的黏性大，可以維持重力的穩(wěn)定性，防止由于局部溫度變化或機(jī)械振動(dòng)所產(chǎn)生的對(duì)流,起著穩(wěn)定離心液保證分離效果的作用.

當(dāng)前第68頁(yè)\共有102頁(yè)\編于星期三\9點(diǎn)第三節(jié)DNA與RNA的制備當(dāng)前第69頁(yè)\共有102頁(yè)\編于星期三\9點(diǎn)一、供體DNA的分離與純化

要求：盡可能地保持其高分子量，無(wú)其它污染物.1、

基因組大?。寒?dāng)前第70頁(yè)\共有102頁(yè)\編于星期三\9點(diǎn)染色體細(xì)菌3300~4200kb酵母15,000kb果蠅1.28x105kb人3x106kb植物2x105~1x108kb天花病毒288kb痘病毒196kb質(zhì)體幾~100以上kb線粒體

藻類線狀15kb酵母環(huán)狀19~78kb植物環(huán)狀100~150kb動(dòng)物(扁蟲到人)環(huán)狀15~18kb錐蟲網(wǎng)狀6000

kb(幼體)短膜蟲網(wǎng)狀30,000

kb(幼體)(Kinetoplast）葉綠體雙子葉植物121（菠菜）~154kb（豌豆）單子葉植物151（玉米）~182kb（浮萍）藻類132（裸藻）~191kb（衣藻）當(dāng)前第71頁(yè)\共有102頁(yè)\編于星期三\9點(diǎn)

1、

DNA分離純化過(guò)程

破碎細(xì)胞+DNA抽提液(EDTA、去污劑、還原劑)65℃溫育20’冰浴冷卻離心去細(xì)胞碎片苯酚抽提法①

CsCl密度梯度離心②當(dāng)前第72頁(yè)\共有102頁(yè)\編于星期三\9點(diǎn)2)CsCl密度梯度離心上清液加入固體CsCl與EtBr溶液室溫下超速離心(45,000rpm）16小時(shí)穿孔取出DNA（320nm）異丙醇抽提溴乙錠緩沖液透析除去殘余CsCl兩倍體積冷乙醇沉淀DNA離心、洗滌、干燥1)苯酚抽提法上清液緩沖液用水飽和苯酚抽提2~3次上層液相用氯仿抽至界面無(wú)蛋白變性物上層液相用兩倍體積冷乙醇沉淀沉淀物用70%冷乙醇洗滌,干燥溶于緩沖液加入RNAase處理除去RNA苯酚氯仿抽提沉淀干燥

當(dāng)前第73頁(yè)\共有102頁(yè)\編于星期三\9點(diǎn)*兩種方法比較：CsCl法操作步驟少，分離DNA分子量大，耗財(cái)多，且需超速離心機(jī)。苯酚法耗時(shí)少，不需昂貴儀器，但操作步驟多，易使DNA分子斷裂。若小心操作，所獲DNA亦符合要求。**上述兩種分離方法都包含了下述四個(gè)分離步驟ⅰ.可溶與不可溶物分離：高速離心除去細(xì)胞碎片，保留上清液。ⅱ.使蛋白質(zhì)分離：苯酚抽提或超速離心ⅲ.使RNA分離：RNase處理或超速離心ⅳ.使DNA與其它可溶物分離當(dāng)前第74頁(yè)\共有102頁(yè)\編于星期三\9點(diǎn)2、細(xì)胞器DNA的分離

植物組織用核分離緩沖液勻漿過(guò)濾濾液離心(2000g,10’,4℃)核緩沖液使核裂解(含0.5%TritonX-100)抽提DNA植物組織細(xì)胞器緩沖液勻漿離心(100g,10’,4℃)除去細(xì)胞核離心(1800g,10’,4℃)分離葉綠體離心(10,000g,10’,4℃)分離線粒體DNase除去細(xì)胞器外DNA加入EDTA使DNase失活純化細(xì)胞器細(xì)胞器裂解提取DNA當(dāng)前第75頁(yè)\共有102頁(yè)\編于星期三\9點(diǎn)二、

載體DNA的分離與純化1、質(zhì)粒載體DNA的分離關(guān)鍵：如何使質(zhì)粒DNA與宿主染色體DNA分開(kāi)原理：質(zhì)粒DNA比染色體DNA小得多，在DNA抽提過(guò)程中，染色體DNA斷裂成小片段(線狀)，質(zhì)粒DNA仍保持超螺旋構(gòu)型.

當(dāng)前第76頁(yè)\共有102頁(yè)\編于星期三\9點(diǎn)

方法：ⅰ.超速離心：利用兩種DNA分子的大小和空間構(gòu)型ⅱ.變性法：在變性條件下使染色體DNA變?yōu)閱捂湥|(zhì)粒DNA仍保持環(huán)狀結(jié)構(gòu)，當(dāng)變性條件發(fā)生迅速變化時(shí)，前者仍不能復(fù)性，而后者又可回復(fù)到天然構(gòu)型。變性條件可采用加熱煮沸法或堿變性法上述方法亦可用于ss環(huán)狀病毒DNARF型的分離,質(zhì)粒DNA的氯霉素?cái)U(kuò)增使用并不廣泛（菌株和載體）當(dāng)前第77頁(yè)\共有102頁(yè)\編于星期三\9點(diǎn)2、噬菌體載體DNA的分離純凈病毒顆粒病毒載體DNAM13mp載體可采用質(zhì)粒DNA的分離方法。當(dāng)前第78頁(yè)\共有102頁(yè)\編于星期三\9點(diǎn)二、RNA的分離與純化1.

制備RNA的關(guān)鍵-防止內(nèi)外源RNase的作用1)

RNase的特點(diǎn)：抗酸抗堿,具很廣pH作用范圍;抗高溫嚴(yán)寒(0~65℃均具活性）；抗變性劑2)

解決辦法：外源RNase—高溫，焦磷酸二乙酯(DEPC)處理所有溶液（Tris·HCl除外）和器皿，操作者帶手套。內(nèi)源RNase—高溫抽提，強(qiáng)蛋白質(zhì)變性劑，RNase抑制劑，蛋白酶K等。當(dāng)前第79頁(yè)\共有102頁(yè)\編于星期三\9點(diǎn)2.

總RNA的制備根據(jù)所用蛋白質(zhì)變性劑種類不一樣分為以下三種制備方法：1）熱苯酚抽提法2）胍鹽法：異硫氰酸胍和硫氰酸胍3）LiCl/尿素法其中以胍鹽法最好，對(duì)于從那些RNase含量很高的組織（胰臟）中提取RNA特別有效，可使RNase迅速變性，制備的RNA有較高翻譯活性。在RNA制備中，細(xì)胞破碎與蛋白質(zhì)變性是同步進(jìn)行的。當(dāng)前第80頁(yè)\共有102頁(yè)\編于星期三\9點(diǎn)3.

多聚核糖體RNA的制備1)

多聚核糖體的分離①超速離心法（30-40萬(wàn)g，離心2-3h）②鎂鹽沉淀法（0.1MMg++）③分級(jí)分離法—分離特異性多聚核糖體

當(dāng)前第81頁(yè)\共有102頁(yè)\編于星期三\9點(diǎn)i.結(jié)合與游離核糖體的分離,這種方法可避免溶酶體破裂.ii.核糖體大小分級(jí)分離，利用連續(xù)密度梯度分離特大和特小的多聚核糖體iii.核糖體免疫沉淀法

*直接免疫沉淀法新生肽鏈+抗體蔗糖密度梯度離心

**間接免疫沉淀法新生肽鏈+抗體+抗-抗體（二抗）不可溶復(fù)合物離心分離

當(dāng)前第82頁(yè)\共有102頁(yè)\編于星期三\9點(diǎn)***免疫親和層析法新生肽鏈-抗體復(fù)合物不溶性交聯(lián)抗原基質(zhì)親和層析柱吸附洗脫免疫沉淀法優(yōu)點(diǎn)：可分離到含量?jī)H為1%的mRNA，但必須使用高純度的抗體，不能發(fā)生交叉反應(yīng)和污染核酸酶2)

多聚核糖體RNA的分離純化多聚核糖體+SDS蔗糖密度梯度離心或蛋白酶K-苯酚抽提當(dāng)前第83頁(yè)\共有102頁(yè)\編于星期三\9點(diǎn)4.

RNA的分級(jí)分離1)

分子量大小分級(jí)分離i.

蔗糖密度梯度離心ii.凝膠電泳2)

核酸序列分級(jí)分離i.

分子雜交法：適用于同源性很高的RNA的分離DNA分子變性結(jié)合到NCFRNA·DNA雜交洗滌洗膜乙醇沉淀當(dāng)前第84頁(yè)\共有102頁(yè)\編于星期三\9點(diǎn)ii.

親和層析法：低聚dT纖維素:用于poly(A)較長(zhǎng)的mRNA；多聚U瓊脂糖:用于poly(A)較短的mRNA（<20A）RNA進(jìn)樣吸附洗滌洗脫收集260nm處吸收峰樣品

乙醇沉淀iii.

無(wú)poly(A)mRNA的分離純化多聚核糖體核糖體亞基+mRNP離心mRNP蛋白酶KmRNA低聚（dT）纖維素層析洗出液乙醇沉淀（無(wú)多聚AmRNA）當(dāng)前第85頁(yè)\共有102頁(yè)\編于星期三\9點(diǎn)細(xì)胞裂解物

胍鹽法

總RNA分子雜交法—

特異RNA分子

熱苯酚法凝膠電泳圍RNA大小分級(jí)分離大小范蔗糖密度梯度離心

一定

LiCl/核酸序列

尿素法離心分級(jí)分離親和層析法—poly（A）RNA分子

高速離心法

全部多聚核糖體

上清液鎂鹽沉淀法蔗糖密度梯度離心—結(jié)合與游離多聚核糖體分級(jí)分離法

蔗糖連續(xù)密度—一定范圍大小核糖體多聚核糖體RNA免疫沉淀法——特異性多聚核糖體

當(dāng)前第86頁(yè)\共有102頁(yè)\編于星期三\9點(diǎn)第四節(jié)核酸電泳

當(dāng)前第87頁(yè)\共有102頁(yè)\編于星期三\9點(diǎn)1.

種類

1)按凝膠材料分:聚丙烯酰胺凝膠和瓊脂糖凝膠電泳(普通瓊脂糖和低熔點(diǎn)瓊脂糖)2)按電泳裝置分:水平式/瓊脂糖凝膠;豎式/聚丙烯酰胺凝膠3)兩種方法比較：分離效果和分離范圍;操作難易2.

用途

瓊脂糖凝膠用于DNA和RNA的常規(guī)分析；聚丙烯酰胺凝膠常用于小分子核酸分析。3.

凝膠電泳的一般程序制膠點(diǎn)樣電泳染色觀察當(dāng)前第88頁(yè)\共有102頁(yè)\編于星期三\9點(diǎn)二、DNA電泳1.

DNA分子種類1)線狀DNA—單鏈與雙鏈，ss-DNA電泳時(shí)要注意局部區(qū)域形成ds-DNA，造成遷移距離不確定2)環(huán)狀DNA-單鏈（如M13mp）和雙鏈（質(zhì)粒DNA）

3)線狀ds-DNA電泳:使用頻率最高的一種電泳當(dāng)前第89頁(yè)\共有102頁(yè)\編于星期三\9點(diǎn)

這類DNA分子在電泳過(guò)程中遷移的距離受以下幾個(gè)因素的影響：i.

分子量的大小:遷移距離與分子量的常用對(duì)數(shù)成反比ii.凝膠濃度:濃度越高，移動(dòng)距離越短，適合分離低分子量DNA濃度越低，移動(dòng)距離越長(zhǎng)，適合分離高分子量DNAiii.電壓:低電壓時(shí)，遷移率與電壓成正比；電壓增高時(shí)，不同大小DNA片段遷移率增大是不同的。iv.堿基組成與溫度:不受影響,溫度高可導(dǎo)致DNA帶變形或解鏈。當(dāng)前第90頁(yè)\共有102頁(yè)\編于星期三\9點(diǎn)4)環(huán)狀ds-DNA電泳:常用于質(zhì)粒DNA的初步鑒定5)線狀ss-DNA電泳鏈分離凝膠：化學(xué)定序時(shí)，用于單鏈分離。DNA雙鏈互補(bǔ)，但組成不一樣，仍可分離（機(jī)理不詳），電泳時(shí)形成三條帶：變性雙鏈，兩條單鏈。

核酸定序凝膠(染料指示劑)：為避免局部區(qū)域產(chǎn)生二級(jí)結(jié)構(gòu)，可采用各種變性措施，如煮沸樣品，提高電泳溫度，凝膠中加入變性劑（尿素、甲醛、甲胺等）當(dāng)前第91頁(yè)\共有102頁(yè)\編于星期三\9點(diǎn)三.RNA凝膠電泳

方法：不同的RNA電泳方法是依據(jù)使RNA分子變性所采取的方法。這些方法不僅要使RNA分子在點(diǎn)樣時(shí)是一級(jí)結(jié)構(gòu)，而且在整個(gè)電泳過(guò)程中也保持一級(jí)結(jié)構(gòu)。1.

乙二醛/二甲基亞砜法原理：乙二醛可以與核酸、核苷酸及堿基發(fā)生反應(yīng)，特別是鳥(niǎo)苷形成一個(gè)穩(wěn)定的附加環(huán)，從而阻止GC堿基的互補(bǔ)作用發(fā)生步驟：RNA+10mM羥甲基醛和50%DMSO混合50℃、1h變性點(diǎn)樣電泳染色觀察

2.

羥甲基汞法原理：羥甲基汞可與RNA分子的嘌呤或嘧啶堿基發(fā)生反應(yīng)，反應(yīng)部位是在可形成氫鍵的亞氨基處。步驟：RNA+10mM羥甲基醛點(diǎn)樣在含4mM羥甲基醛的瓊脂糖凝膠上電泳染色觀察當(dāng)前第92頁(yè)\共有102頁(yè)\編于星期三\9點(diǎn)3.

甲醛法步驟：RNA+2.2M甲醛+50%甲胺點(diǎn)樣在含2.2M甲醛瓊脂糖凝膠上MOPS緩沖液電泳染色觀察其它變性劑，如尿素、甲胺等也可用于RNA電泳.4.

三種方法的比較第一種方法安全，但由于反應(yīng)是不可逆的，由此回收的RNA樣品用于體外翻譯效果不好。第二、三種方法的反應(yīng)可逆，回收RNA樣品可用于體外翻譯反應(yīng)，但操作必須小心，因兩種變性劑有毒。當(dāng)前第93頁(yè)\共有102頁(yè)\編于星期三\9點(diǎn)五、蛋白