演示文稿第三章外植體的選擇和滅菌

演示文稿第三章外植體的選擇和滅菌當(dāng)前第1頁(yè)\共有35頁(yè)\編于星期四\3點(diǎn)第三章外植體的選擇和滅菌ppt課件當(dāng)前第2頁(yè)\共有35頁(yè)\編于星期四\3點(diǎn)第一節(jié)外植體的選擇

1外植體部位2取材季節(jié)3器官的生理狀態(tài)和發(fā)育年齡4選取適宜的大小當(dāng)前第3頁(yè)\共有35頁(yè)\編于星期四\3點(diǎn)1外植體部位植物體的各個(gè)部位，如莖尖、莖段、皮層及維管組織、髓細(xì)胞、表皮、塊莖的貯藏薄壁細(xì)胞、花瓣、根、葉、子葉、鱗莖、胚珠和花藥等。不同種類的植物以及同一植物的不同器官對(duì)誘導(dǎo)條件反應(yīng)不一致的。大多數(shù)植物來(lái)說(shuō)，莖尖是較好的部位，其形態(tài)已基本建成，生長(zhǎng)速度快，遺傳性穩(wěn)定，是獲得無(wú)病毒苗的重要途徑。當(dāng)前第4頁(yè)\共有35頁(yè)\編于星期四\3點(diǎn)外植體選擇的原則培養(yǎng)材料的來(lái)源是否保證是否會(huì)引起不良變異。葉片的來(lái)源最有保證，許多植物的組織培養(yǎng)以葉片為外植體。對(duì)一些培養(yǎng)較困難的植物，可以通過(guò)子葉或下胚軸來(lái)建立其組織培養(yǎng)再生體系。當(dāng)前第5頁(yè)\共有35頁(yè)\編于星期四\3點(diǎn)2取材季節(jié)

在生長(zhǎng)開始的季節(jié)取材，若在生長(zhǎng)末期或已進(jìn)入休眠時(shí)取樣，則外植體可能對(duì)誘導(dǎo)反應(yīng)遲鈍或無(wú)反應(yīng)。當(dāng)前第6頁(yè)\共有35頁(yè)\編于星期四\3點(diǎn)3器官的生理狀態(tài)和發(fā)育年齡植物上部器官的生長(zhǎng)時(shí)間雖短，其生理年齡卻較老，更接近發(fā)育上的成熟，越容易形成花器官。而越向基部，則生理年齡越小。下部組織越易形成營(yíng)養(yǎng)器官，上部組織易形成花器官。通常年幼組織比年老組織有較高的形態(tài)發(fā)生能力，容易培養(yǎng)，有較大的再生能力。當(dāng)前第7頁(yè)\共有35頁(yè)\編于星期四\3點(diǎn)4選取適宜的大小

材料太大易污染；材料太小，難于成活。。如果是胚胎培養(yǎng)或脫毒培養(yǎng)的材料，則應(yīng)更小當(dāng)前第8頁(yè)\共有35頁(yè)\編于星期四\3點(diǎn)第三章外植體的選擇和滅菌

第一節(jié)外植體的選擇第二節(jié)外植體的滅菌方法

第三節(jié)污染原因和預(yù)防措施

當(dāng)前第9頁(yè)\共有35頁(yè)\編于星期四\3點(diǎn)1外植體的滅菌方法預(yù)處理：先對(duì)植物組織修整，去掉不需要的部分，流水中沖洗干凈。預(yù)處理的植物材料的滅菌：原則：充分滅菌，但不傷外植體不同的外植體，滅菌的要求也不一樣當(dāng)前第10頁(yè)\共有35頁(yè)\編于星期四\3點(diǎn)2常用滅菌藥劑的使用和效果滅菌劑使用濃度（%）清除的難易消毒時(shí)間（min）效果次氯酸鈉10-30易5—30很好次氯酸鈣2易5—30很好漂白粉飽和濃度易5—30很好氯化汞0.01—1較難2—10最好酒精70—75易0.2—2好過(guò)氧化氫10—12最易5—15好溴水1—2易2—10很好硝酸銀1較難5—30好抗菌素4—50mg/L中30—60較好當(dāng)前第11頁(yè)\共有35頁(yè)\編于星期四\3點(diǎn)常規(guī)的表面滅菌處理方法①把材料放進(jìn)70%的酒精中約30s。②用0.1%的升汞（HgCl2）中浸泡5-10min?；蛴?0%的漂白粉上清液中浸10min～15min。③無(wú)菌蒸餾水沖洗3～5次。④滅菌時(shí)進(jìn)行攪動(dòng)，使植物材料與滅菌劑有良好的接觸。⑤在滅菌劑里滴入數(shù)滴0.1%的Tween20（吐溫）或Tween80濕潤(rùn)劑，則滅菌效果更好。

當(dāng)前第12頁(yè)\共有35頁(yè)\編于星期四\3點(diǎn)1）表面消毒劑對(duì)植物組織是有害的，應(yīng)正確選擇消毒劑的濃度和處理時(shí)間，以減少組織的死亡。2）與消毒劑接觸過(guò)的切面在轉(zhuǎn)移到無(wú)菌基質(zhì)前需將其切除，因?yàn)橄緞?huì)阻礙植物細(xì)胞對(duì)基質(zhì)中營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的吸收。3）若外植體污染嚴(yán)重則應(yīng)先用流水漂洗1小時(shí)以上或先種子培養(yǎng)得到無(wú)菌種苗，然后用其各個(gè)部分建立組織培養(yǎng)。4）HgCl2效果最好，但對(duì)實(shí)驗(yàn)材料的危害最大，要用水沖洗至少5次。消毒注意事項(xiàng)當(dāng)前第13頁(yè)\共有35頁(yè)\編于星期四\3點(diǎn)第三章外植體的選擇和滅菌

第一節(jié)外植體的選擇第二節(jié)外植體的滅菌方法

第三節(jié)污染原因和預(yù)防措施

當(dāng)前第14頁(yè)\共有35頁(yè)\編于星期四\3點(diǎn)第三節(jié)污染原因和預(yù)防措施1、污染的原因污染——是指在組織培養(yǎng)過(guò)程中培養(yǎng)基和培養(yǎng)材料滋生雜菌，導(dǎo)致培養(yǎng)失敗的現(xiàn)象。當(dāng)前第15頁(yè)\共有35頁(yè)\編于星期四\3點(diǎn)1.1污染的原因：從病源菌方面：主要有細(xì)菌及真菌兩大類；從污染的途徑：外植體帶菌培養(yǎng)基器皿滅菌不徹底操作人員未遵守操作規(guī)程等引起的。當(dāng)前第16頁(yè)\共有35頁(yè)\編于星期四\3點(diǎn)1.2細(xì)菌污染的特點(diǎn)：菌斑呈粘液狀物，而且在接種后1～2天即可發(fā)現(xiàn)。原因：材料帶菌培養(yǎng)基滅菌不徹底操作人員未遵守操作規(guī)程因此接種人員的手應(yīng)經(jīng)常用70%酒精擦凈，鑷子和接種針在使用前必須在火焰上燒紅。當(dāng)前第17頁(yè)\共有35頁(yè)\編于星期四\3點(diǎn)1.3真菌污染的特點(diǎn)：污染部分長(zhǎng)有不同顏色的霉菌，在接種后3～10天才能發(fā)現(xiàn)。原因：周圍環(huán)境不清潔超凈工作臺(tái)的過(guò)濾裝置失效培養(yǎng)用器皿的口徑過(guò)大等為了減少損失，提高工作效率，必須在每個(gè)操作環(huán)節(jié)注意防止污染的發(fā)生。當(dāng)前第18頁(yè)\共有35頁(yè)\編于星期四\3點(diǎn)污染后的措施發(fā)現(xiàn)污染的材料應(yīng)及時(shí)處理，否則將導(dǎo)致培養(yǎng)室環(huán)境污染。對(duì)一些特別寶貴的材料，可以取出再次進(jìn)行更嚴(yán)格的滅菌，然后接入新鮮的培養(yǎng)基中重新培養(yǎng)。要處理的污染培養(yǎng)瓶最好在打開瓶蓋前，先集中進(jìn)行高壓滅菌，再清除污染物，然后洗凈備用。當(dāng)前第19頁(yè)\共有35頁(yè)\編于星期四\3點(diǎn)2污染的防治措施2.1防止材料帶菌的措施2.2外植體的滅菌2.3玻璃器皿的滅菌2.4金屬器械的滅菌2.5布質(zhì)制品的滅菌2.6無(wú)菌操作室的滅菌2.7操作當(dāng)前第20頁(yè)\共有35頁(yè)\編于星期四\3點(diǎn)

2.1防止材料帶菌的措施（1）用莖尖作外植體時(shí)，可在室內(nèi)或無(wú)菌條件下對(duì)枝條先進(jìn)行預(yù)培養(yǎng)。枝條插入無(wú)糖的營(yíng)養(yǎng)液或自來(lái)水，以新抽嫩枝條作為外植體；或暗培養(yǎng)，待抽出徒長(zhǎng)的黃化枝條時(shí)采枝接種。當(dāng)前第21頁(yè)\共有35頁(yè)\編于星期四\3點(diǎn)

（2）選擇合適的時(shí)間去田間采取外植體避免陰雨天去田間采取外植體。在晴天采取外植體時(shí)，下午采取的外植體要比早晨采的污染少，因材料經(jīng)過(guò)日曬后可殺死部分細(xì)菌或真菌。當(dāng)前第22頁(yè)\共有35頁(yè)\編于星期四\3點(diǎn)

但目前對(duì)材料內(nèi)部污染還沒(méi)有令人滿意的滅菌方法。在菌類長(zhǎng)入組織內(nèi)部時(shí)，不要去年生的鱗片，甚至要除去韌皮組織，只接種內(nèi)部的分生組織，可以收到一定的防污染效果。當(dāng)前第23頁(yè)\共有35頁(yè)\編于星期四\3點(diǎn)2.2外植體的滅菌（1）多次滅菌法：如咖啡成熟葉片的滅菌。除去主脈、葉的頂端、基部和邊緣部分，這樣可大大減少污染；消毒處理次日再次消毒對(duì)層積過(guò)的種子也可用多次滅菌法，在種子吸脹前后都要滅菌，當(dāng)前第24頁(yè)\共有35頁(yè)\編于星期四\3點(diǎn)（2）多種藥液交替浸泡法

對(duì)容易污染而難滅菌的材料：當(dāng)前第25頁(yè)\共有35頁(yè)\編于星期四\3點(diǎn)2.3玻璃器皿的滅菌濕熱滅菌法——即將玻璃器皿包扎后置入蒸汽滅菌鍋中進(jìn)行高溫高壓滅菌，滅菌時(shí)間可延長(zhǎng)達(dá)25min—30min。干熱滅菌法——即將玻璃器皿置入電熱烘箱中進(jìn)行滅菌。煮沸滅菌——即將玻璃器皿放入水中煮沸進(jìn)行滅菌。當(dāng)前第26頁(yè)\共有35頁(yè)\編于星期四\3點(diǎn)2.4金屬器械的滅菌

火焰滅菌法：即把金屬器械放在95%的酒精中浸一下，然后放在火焰上燃燒滅菌。這一步驟應(yīng)當(dāng)在無(wú)菌操作過(guò)程中反復(fù)進(jìn)行。干熱滅菌法：即將拭凈或烘干的金屬器械用紙包好，盛在金屬盒內(nèi)，放在烘箱中滅菌。當(dāng)前第27頁(yè)\共有35頁(yè)\編于星期四\3點(diǎn)濕熱滅菌法：工作服、口罩、帽子等布質(zhì)品均用濕熱滅菌法，即將洗凈晾干的的布質(zhì)品，放入高壓鍋中，用1.1公斤/厘米2

（即15磅/英寸2），121℃的溫度，滅菌20min～30min。2.5布質(zhì)制品的滅菌

當(dāng)前第28頁(yè)\共有35頁(yè)\編于星期四\3點(diǎn)2.6無(wú)菌操作室的滅菌

無(wú)菌操作室的地面、墻壁和工作臺(tái)的滅菌可用2%的新潔爾敏或70%的酒精擦洗，然后用紫外燈照射約20min。使用前用70%酒精噴霧，使空間灰塵落下。一年中要定期一、二次用甲醛和高錳酸鉀熏蒸。當(dāng)前第29頁(yè)\共有35頁(yè)\編于星期四\3點(diǎn)2.7操作人員在接種時(shí)一定要嚴(yán)格按照無(wú)菌操作的程序進(jìn)行當(dāng)前第30頁(yè)\共有35頁(yè)\編于星期四\3點(diǎn)防止操作帶來(lái)的污染A、整個(gè)接種操作應(yīng)在近火焰處進(jìn)行，且動(dòng)作要迅速正

確

錯(cuò)

誤當(dāng)前第31頁(yè)\共有35頁(yè)\編于星期四\3點(diǎn)B、接種過(guò)程中盡可能達(dá)到懸空要求防止操作帶來(lái)的污染正

確

錯(cuò)

誤當(dāng)前第32頁(yè)\共有35頁(yè)\編于星期四\3點(diǎn)C、接種時(shí)不得用手接觸瓶蓋內(nèi)壁或瓶口防止操作帶來(lái)的污染正

確

錯(cuò)

誤當(dāng)前第33頁(yè)\共有35頁(yè)\編于星期四\3點(diǎn)小結(jié)：常用的滅菌方法物理方法化學(xué)方法干熱滅菌(烘燒和灼燒)濕熱滅菌(常壓或高壓蒸煮)射線處理(紫外線、超聲波、微波)過(guò)濾除菌