實(shí)驗(yàn)室常用幾種細(xì)胞實(shí)驗(yàn)的實(shí)驗(yàn)步驟和細(xì)胞熒光染色方法小結(jié)詳解演示文稿

實(shí)驗(yàn)室常用幾種細(xì)胞實(shí)驗(yàn)的實(shí)驗(yàn)步驟和細(xì)胞熒光染色方法小結(jié)詳解演示文稿當(dāng)前第1頁\共有38頁\編于星期三\22點(diǎn)（優(yōu)選）實(shí)驗(yàn)室常用幾種細(xì)胞實(shí)驗(yàn)的實(shí)驗(yàn)步驟和細(xì)胞熒光染色方法小結(jié)當(dāng)前第2頁\共有38頁\編于星期三\22點(diǎn)人臍帶縱剖面和直觀圖當(dāng)前第3頁\共有38頁\編于星期三\22點(diǎn)實(shí)驗(yàn)操作步驟將滅菌后的實(shí)驗(yàn)物品按操作順序擺放在超凈工作臺內(nèi)（超凈工作臺內(nèi)事先UV滅菌）

注意：紫外滅菌時應(yīng)關(guān)閉日光燈，送風(fēng)機(jī)，人員要離開生化間，20分鐘后返回關(guān)閉紫外燈，打開日光燈，風(fēng)機(jī)。5分鐘后進(jìn)行實(shí)驗(yàn)

當(dāng)前第4頁\共有38頁\編于星期三\22點(diǎn)打開NS.，點(diǎn)燃酒精燈（不建議使用），將酒精棉鋪開在操作臺中央，方便將所有器械和瓶蓋的擺放。當(dāng)前第5頁\共有38頁\編于星期三\22點(diǎn)3將半月盤內(nèi)倒入少許無菌NS.,取出新鮮臍帶輕輕放入半月盤內(nèi)，用滅菌后的脫脂棉球?qū)⒛殠庵艿难E擦干，將臍帶兩端血跡擦干以便暴露靜脈血管。將圓頭不銹鋼針頭輕緩的插入兩端靜脈血管內(nèi)，并順勢用止血鉗夾死固定。注意：本實(shí)驗(yàn)操作時要戴好橡膠手套，操作前進(jìn)行醫(yī)用酒精擦拭消毒，當(dāng)臍帶過短時，只要一端插入圓頭針，另一端用止血鉗夾死。當(dāng)前第6頁\共有38頁\編于星期三\22點(diǎn)當(dāng)前第7頁\共有38頁\編于星期三\22點(diǎn)用無菌NS.,將臍帶靜脈血管內(nèi)的淤血沖洗干凈，直到?jīng)_出的NS.無色為止，接著將血管內(nèi)的空氣抽空，兩端固定。當(dāng)前第8頁\共有38頁\編于星期三\22點(diǎn)當(dāng)前第9頁\共有38頁\編于星期三\22點(diǎn)5將Ⅱ型膠原酶注入臍帶靜脈血管內(nèi)，此步驟操作時，注意兩端的注射器要來回做活塞運(yùn)動以便使血管內(nèi)壁與Ⅱ型膠原酶充分接觸，注入的Ⅱ型膠原酶比例為8ml/15cm。注意：一般本步消化時間為10分鐘左右，Ⅱ型膠原酶的溫度保證在37℃左右消化能力最好。特別提醒的是在消化過程中要用手來回揉搓臍帶外壁，有助于內(nèi)皮細(xì)胞的脫落，此細(xì)節(jié)至關(guān)重要，決定了實(shí)驗(yàn)成敗當(dāng)前第10頁\共有38頁\編于星期三\22點(diǎn)當(dāng)前第11頁\共有38頁\編于星期三\22點(diǎn)此細(xì)節(jié)至關(guān)重要當(dāng)前第12頁\共有38頁\編于星期三\22點(diǎn)終止消化，將靜脈內(nèi)含有EC細(xì)胞的消化液注入含有小牛血清的離心液里終止消化，兩者比例為1:1，并用離心液沖洗靜脈血管兩次，并將收集的細(xì)胞懸液裝入離心管，封口

離心，將離心管放入離心機(jī)，設(shè)定離心速度和時間。一般1200r/min,8分鐘。

待離心機(jī)完全停穩(wěn)后，打開，取出離心管。小心取放，避免震動幅度過大，倒去上清液，將貼壁細(xì)胞用新鮮的培養(yǎng)基全液吹打垂懸，放入細(xì)胞培養(yǎng)瓶（一般5ml/瓶）當(dāng)前第13頁\共有38頁\編于星期三\22點(diǎn)937℃,5%，CO2孵箱培養(yǎng)，第二天換液，去除未貼壁細(xì)胞，繼續(xù)培養(yǎng)。待細(xì)胞幾乎鋪滿瓶底時傳代約為3/4。一傳二當(dāng)前第14頁\共有38頁\編于星期三\22點(diǎn)二SMC的原代培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)前準(zhǔn)備器械消化酶FD-12培養(yǎng)基其他大號止血鉗：2把小號止血鉗：2把小號培養(yǎng)皿：2個眼科剪（直）：2把眼科剪（彎）：2把眼科鑷（直）：2把眼科鑷（彎）：2把

胰酶Try(2.5mg/ml)FD-12培養(yǎng)原液85mlFBS15mlL-Glu1ml濃度為200mmol/L細(xì)胞培養(yǎng)瓶NS.6孔板當(dāng)前第15頁\共有38頁\編于星期三\22點(diǎn)SMC細(xì)胞來源采用方法：組織貼壁法當(dāng)前第16頁\共有38頁\編于星期三\22點(diǎn)實(shí)驗(yàn)操作步驟將滅菌后的實(shí)驗(yàn)物品按操作順序擺放在超凈工作臺內(nèi)（超凈工作臺內(nèi)事先UV滅菌）

注意：紫外滅菌時應(yīng)關(guān)閉日光燈，送風(fēng)機(jī)，人員要離開生化間，30分鐘后返回關(guān)閉紫外燈，打開日光燈，風(fēng)機(jī)。5分鐘后進(jìn)行實(shí)驗(yàn)

將實(shí)驗(yàn)過程中需要的用到的器械依次擺放在酒精燈周圍取出臍帶（5CM即可），放入半月盤內(nèi)，用滅菌后脫脂棉擦去臍帶周圍血跡

注意：個體差異性大，選取臍帶時無明顯水腫，淤血，無結(jié)節(jié)現(xiàn)象當(dāng)前第17頁\共有38頁\編于星期三\22點(diǎn)觀察臍帶縱面，找到臍帶內(nèi)兩根動脈，從中間小心剪一豁口。用組織剪牽拉兩部分，直至分離出動脈血管。

將剖離的動脈轉(zhuǎn)移到一干凈的6孔板內(nèi),孔內(nèi)加入少許NS.當(dāng)前第18頁\共有38頁\編于星期三\22點(diǎn)剝離血管外膜，小心用一眼科直鑷夾住血管一端，用另一把彎鑷輕輕向下牽拉血管外壁，直到明顯可見一層狀組織與內(nèi)層組織分離。此時應(yīng)夾緊該層組織，迅速向下剝離。

注意：此步驟最為關(guān)鍵，直接決定細(xì)胞組織的增殖活力7將剩下的血管組織再次轉(zhuǎn)移到另一孔內(nèi)，孔內(nèi)加入少許NS.,用彎鑷夾住血管一端輕輕地套在眼科剪前端，漸次將組織依次剪開，用一滅菌脫脂棉輕輕擦拭血管內(nèi)壁，除去血管內(nèi)皮細(xì)胞當(dāng)前第19頁\共有38頁\編于星期三\22點(diǎn)8將血管中層再次轉(zhuǎn)移到一孔內(nèi),孔內(nèi)加入少許培養(yǎng)基，用眼科剪（直）將組織盡數(shù)剪成1mm×1mm的小組織塊當(dāng)前第20頁\共有38頁\編于星期三\22點(diǎn)將剪好的組織塊用一彎頭吸管吸出來放進(jìn)細(xì)胞培養(yǎng)瓶內(nèi)，小心將培養(yǎng)基吸出來，將組織塊輕輕地均勻的貼在細(xì)胞瓶底。

加入新鮮的培養(yǎng)基，小心不要將瓶底的組織塊沖刷掉。

將細(xì)胞培養(yǎng)瓶放入37℃,5%，CO2孵箱培養(yǎng)

注意：此時的細(xì)胞培養(yǎng)瓶是倒置的，第二天翻轉(zhuǎn)培養(yǎng)瓶時才使得組織塊浸入培養(yǎng)基里12培養(yǎng)到第六天時可見組織塊周圍有細(xì)胞攀爬出來，此后兩天便可進(jìn)行初次傳代當(dāng)前第21頁\共有38頁\編于星期三\22點(diǎn)三MSC的原代培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)前準(zhǔn)備器械消化酶FD-12培養(yǎng)基其他大號止血鉗：2把小號止血鉗：2把小號培養(yǎng)皿：2個大號組織剪：2把眼科剪（直）：1把眼科鑷（直）：2把

胰酶Try(2.5mg/ml)α-MEM培養(yǎng)原液85mlFBS15mlL-Glu1ml濃度為200mmol/LSD大鼠一只細(xì)胞培養(yǎng)瓶NS.5ml注射器當(dāng)前第22頁\共有38頁\編于星期三\22點(diǎn)培養(yǎng)方法全骨髓培養(yǎng)法和密度梯度離心法實(shí)驗(yàn)步驟1將滅菌后的實(shí)驗(yàn)物品按操作順序擺放在超凈工作臺內(nèi)（超凈工作臺內(nèi)事先UV滅菌）

注意：紫外滅菌時應(yīng)關(guān)閉日光燈，送風(fēng)機(jī)，人員要離開生化間，30分鐘后返回關(guān)閉紫外燈，打開日光燈，風(fēng)機(jī)。5分鐘后進(jìn)行實(shí)驗(yàn)

將實(shí)驗(yàn)過程中需要的用到的器械依次擺放在酒精燈周圍當(dāng)前第23頁\共有38頁\編于星期三\22點(diǎn)將老鼠引頸處死，放入事先配好的醫(yī)用酒精內(nèi)浸泡15分鐘后，轉(zhuǎn)移到超凈室內(nèi)。用大號止血鉗夾住鼠尾，用無菌NS.將大鼠身上的酒精沖洗干凈后，放入無菌半月盤內(nèi)，轉(zhuǎn)移至超凈臺內(nèi)。剪去鼠尾。用第一套器械，小心剝離老鼠四肢表皮，露出肌肉層。

用第二套器械，小心剝離老鼠四肢上的肌肉層，露出股骨和脛骨當(dāng)前第24頁\共有38頁\編于星期三\22點(diǎn)用第三套器械，小心剝離老鼠的脛骨和股骨注意：此步驟很關(guān)鍵，在分離四肢股骨、脛骨時要格外小心，最好用眼科剪，不可暴露骨髓腔將股骨和脛骨轉(zhuǎn)移到小培養(yǎng)皿內(nèi)，里面倒入少許NS.，用眼科剪和眼科鑷將骨頭周圍的肌肉組織剝離

將剝離后的股骨和脛骨轉(zhuǎn)移到一新的培養(yǎng)皿內(nèi)，小心并迅速用大號組織剪剪斷骨頭兩端，暴露骨髓腔。不建議使用酒精，此步驟以前各步在保證無菌操作情況下可避免染菌當(dāng)前第25頁\共有38頁\編于星期三\22點(diǎn)將剪斷的骨髓，用5ml的注射器吸取無血清培養(yǎng)基反復(fù)沖洗骨髓腔。收集骨髓懸液的培養(yǎng)基。

在50ml離心管內(nèi)加入Ficoll人淋巴細(xì)胞分離液，將細(xì)胞懸液小心的鋪在分離液上層注意：在操作此步驟時，要戴好手套，口罩，在Ficoll液面上鋪細(xì)胞時眼睛要與頁面平齊小心封口離心管，離心機(jī)內(nèi)離心，設(shè)定為2000r/min,30分鐘

離心后取出離心管，小心吸取離心管內(nèi)中間白色云霧層，用無血清培養(yǎng)基混勻后再次離心，設(shè)定為1500r/min,10分鐘當(dāng)前第26頁\共有38頁\編于星期三\22點(diǎn)將離心后的上清液棄除，用新鮮的全培養(yǎng)基垂懸細(xì)胞，裝入細(xì)胞培養(yǎng)瓶15將細(xì)胞培養(yǎng)瓶放入37℃,5%，CO2孵箱培養(yǎng)24小時后將細(xì)胞瓶內(nèi)的培養(yǎng)基吸出放入新的培養(yǎng)瓶內(nèi)，讓尚未貼壁的細(xì)胞繼續(xù)貼壁

一般在24h后細(xì)胞便可見梭型形，一周后傳代當(dāng)前第27頁\共有38頁\編于星期三\22點(diǎn)EPC的原代培養(yǎng)方法同MSC，培養(yǎng)基內(nèi)加入VEGF誘導(dǎo)因子即可SPC的原代培養(yǎng)方法同上，培養(yǎng)基內(nèi)加入PDGF-BB誘導(dǎo)因子即可

外周血來源的EPC的培養(yǎng)同MSC的操作步驟（11—17）

人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞的培養(yǎng)同SMC組織貼壁法。去除動脈血管和靜脈血管后組織貼壁即可當(dāng)前第28頁\共有38頁\編于星期三\22點(diǎn)八細(xì)胞試驗(yàn)中注意的要點(diǎn)關(guān)于傳代問題atry配置時PH=7.4時效果較好btry使用時的溫度37度時效果較好，過低不易消化，導(dǎo)致細(xì)胞死亡ctry消化后離心重新垂懸細(xì)胞活性高當(dāng)前第29頁\共有38頁\編于星期三\22點(diǎn)d細(xì)胞傳代時要充分混勻上圖為傳代時沒有充分混勻?qū)е录?xì)胞團(tuán)聚嚴(yán)重當(dāng)前第30頁\共有38頁\編于星期三\22點(diǎn)關(guān)于血清問題aEC培養(yǎng)時血清含量不要高于20%。否則老化速度過快bsmc培養(yǎng)時原代血清含量控制在15%，傳代后控制10%左右，可有效控制其老化速度c干細(xì)胞培養(yǎng)時同SMC，在細(xì)胞旺盛期血清含量可進(jìn)一步下調(diào)至5%當(dāng)前第31頁\共有38頁\編于星期三\22點(diǎn)關(guān)于染菌問題a常見的多為真菌感染，細(xì)胞瓶內(nèi)可見白色菌絲。一旦出現(xiàn)此種情況，需要立刻丟棄細(xì)胞瓶。孵箱內(nèi)重新進(jìn)行滅菌處理b常見細(xì)菌感染如桿菌球菌支原體等c最近實(shí)驗(yàn)室出現(xiàn)黑膠蟲染菌現(xiàn)象當(dāng)前第32頁\共有38頁\編于星期三\22點(diǎn)對于“黑膠蟲”的處理方法：

首先，血清買回來滅活前凍融應(yīng)逐級凍融，即按照-20℃——4℃完全融化后，再置入水浴中，與室溫一起升高到56度，這樣的目的是避免溫度驟變，導(dǎo)致血清中的營養(yǎng)物質(zhì)喪失活性。

第二，血清滅活后分裝保存。按照每次用血清的量分裝，盡量減少血清凍融的次數(shù)。分裝時注意無_第三，細(xì)胞培養(yǎng)時血清濃度稍大一些。通常細(xì)胞培養(yǎng)血清濃度為10%-15%，但如果血清凍融次數(shù)過多，那營養(yǎng)物質(zhì)喪失活性，按15%的濃度配制事實(shí)上達(dá)不到15%的營養(yǎng)成分，故培養(yǎng)基配置時一般用18%-20%的血清。當(dāng)前第33頁\共有38頁\編于星期三\22點(diǎn)4關(guān)于細(xì)胞凍存a10%的DMSO、40%胎牛血清、50%培養(yǎng)基b4℃,40分鐘;-20℃,30分鐘;-80℃,24h后液氮罐保存

c如果凍存細(xì)胞多要先把凍存液配好放四度冰箱(因?yàn)镈MSO放熱，剛加進(jìn)去和容易損傷細(xì)胞，常溫DMSO對細(xì)胞毒性也大。)

d凍存的原則是慢凍快蘇

當(dāng)前第34頁\共有38頁\編于星期三\22點(diǎn)關(guān)于熒光染色實(shí)驗(yàn)步驟

1細(xì)胞取出固定2h后，也可4℃保存多日后一起染色2將孔板內(nèi)固定液（2.5%戊二醛或者4%多聚甲醛）吸出，用PBS清洗3次，每次5分鐘3用triton脫細(xì)胞液（0.1%濃度）包被樣品5分鐘，目的是增加細(xì)胞通透性，后用PBS清洗3次當(dāng)前第35頁\共有38頁\編于星期三\22點(diǎn)BSA封閉液封閉（具體看抗體的種屬來選擇包被液)37℃4h,也可以4℃過夜

Ⅰ抗30um/well即可，37℃30分鐘

取出樣品清洗3次，每次