乙醇對谷氨酸棒桿菌EGFP表達和生長的作用 谷氨酸 桿菌 乙醇 生長 表達

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乙醇對谷氨酸棒桿菌EGFP表達和生長的作用本文簡介：摘要：谷氨酸棒桿菌是一種傳統(tǒng)的工業(yè)微生物。為研究乙醇對谷氨酸棒桿菌表達外源蛋白的影響,將組成型表達增強綠色熒光蛋白(enhancedgreenfluorescentprotein,EGFP)的谷氨酸棒桿菌接入含有不同濃度乙醇的培養(yǎng)基中培養(yǎng),發(fā)現(xiàn)低濃度(1%)乙醇在被利用的過程中可以顯著進步菌體的單

乙醇對谷氨酸棒桿菌EGFP表達和生長的作用本文內(nèi)容：

摘要：谷氨酸棒桿菌是一種傳統(tǒng)的工業(yè)微生物。為研究乙醇對谷氨酸棒桿菌表達外源蛋白的影響,將組成型表達增強綠色熒光蛋白(enhancedgreenfluorescentprotein,EGFP)的谷氨酸棒桿菌接入含有不同濃度乙醇的培養(yǎng)基中培養(yǎng),發(fā)現(xiàn)低濃度(1%)乙醇在被利用的過程中可以顯著進步菌體的單位熒光強度。將乙醇與常見的幾種營養(yǎng)物質(zhì)進展了比照,發(fā)現(xiàn)乙醇在促進菌體生長以及蛋白表達方面表現(xiàn)更好。此外,根據(jù)乙醇被利用時異檸檬酸裂合酶(Isocitratelyase,ICL)被強烈誘導(dǎo)的特性構(gòu)建了一個表達才能較強、誘導(dǎo)效果較好的自誘導(dǎo)表達載體。

關(guān)鍵詞：谷氨酸棒桿菌;乙醇;蛋白表達;碳源;

Abstract：Corynebacteriumglutamicumisatraditionalindustrialmicroorganism.InordertostudytheinfluenceofethanolontheexpressionofexogenousproteininCorynebacteriumglutamicum,thestrainthatcanconstitutivelyexpresstheenhancedgreenfluorescentprotein(EGFP)wasinoculatedintotheculturemediumcontainingdifferentconcentrationsofethanol,anditwasfoundthattheunitfluorescenceintensitycouldbesignificantlyelevatedintheprocessoftheutilizationoflowconcentration(1%)ethanol.Herewealsodemonstratedthatethanolhadbetterperformancesbothincellgrowthandproteinproductionparedwithseveralmonnutrients.Inaddition,anauto-inducibleexpressionvectorwithhighexpressionabilityandinducibleratewasconstructedaccordingtothestronginductionoftheisocitratelyase(ICL)inthepresenceofethanolutilization.

Keyword：Corynebacteriumglutamicum;ethanol;proteinexpression;carbonsource;

谷氨酸棒桿菌是一種兼性厭氧的革蘭氏陽性工業(yè)微生物，廣泛用于一些有機酸的合成【1】。因具有無內(nèi)毒素、抗逆性強、蛋白酶程度較低等優(yōu)勢，近年來谷氨酸棒桿菌也正逐漸被開發(fā)用于生物燃料的消費以及外源重組蛋白的表達[2,3]。

乙醇是各種分子伴侶的強烈誘導(dǎo)劑，分子伴侶表達程度的進步可以促進重組蛋白的可溶性表達[4,5]。盡管也有一些添加乙醇后對大腸桿菌蛋白表達產(chǎn)生有益效果的報道，但這一策略往往會因為大腸桿菌的乙醇耐受性較差而無法實現(xiàn)[6,7]。相比之下，革蘭氏陽性菌株的有機溶劑耐受性要高于革蘭氏陰性菌株，谷氨酸棒桿菌又擁有較強的乙醇脫氫酶活性，可以利用乙醇作為唯一碳源生長[8]。為了研究添加乙醇的策略是否可以對谷氨酸棒桿菌表達重組蛋白產(chǎn)生促進作用，筆者就乙醇添加對于谷氨酸棒桿菌EGFP的表達以及菌體生長等方面的影響進展了研究。

1、材料與方法

1.1、材料

1.1.1、菌株、質(zhì)粒和引物

谷氨酸棒桿菌CGMCC1.15647(CorynebacteriumglutamicumCGMCC1.15647)、大腸桿菌DH5alpha;、質(zhì)粒pXMJ19由本實驗室保藏。質(zhì)粒p19-0(pXMJ19-mut△Ptac，△lacI,T7Isolator)、pXMJ19-EGFP(pXMJ19-mut，△lacI,EGFP)由本實驗室構(gòu)建和保藏[9]。自誘導(dǎo)載體PICL-B-EGFP在本研究中構(gòu)建。所用引物見表1，引物的合成和測序工作均由蘇州金唯智公司完成。

表1本試驗所用的引物

1.1.2、培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件

大腸桿菌使用LB培養(yǎng)基在37℃培養(yǎng)。除非另有說明，谷氨酸棒桿菌使用LBB(LB+1%腦心浸出液)培養(yǎng)基在30℃培養(yǎng)，轉(zhuǎn)速為200r/min。抗生素使用氯霉素，作用終濃度在大腸桿菌中為34mg/L，在谷氨酸棒桿菌中為10mg/L。

1.1.3、酶和試劑

限制性內(nèi)切酶(ThermoFisherScientific);Q5高保真DNA聚合酶(NewEnglandBiolabs);EsTaqMasterMix(康為世紀生物科技);T4DNA連接酶(TaKaRaBio);質(zhì)粒提取試劑盒、PCR產(chǎn)物純化試劑盒和膠回收試劑盒(AxygenScientific);基因組提取試劑盒(天根生化科技)。

1.1.4、主要耗材和儀器

高速冷凍離心機和PCR儀(ThermoFisherScientific);超聲波細胞破碎儀:VCX800(SONICS);熒光分光光度計(上海棱光技術(shù))。

1.2、方法

1.2.1、質(zhì)粒構(gòu)建

利用引物PICL-B-EGFP-UF/R對谷氨酸棒桿菌基因組進展PCR擴增，得到帶有HindⅢ/以及bsaⅠ接頭的異檸檬酸裂合酶編碼基因的啟動子區(qū)域(從ATG上游500bp到ATG下游59bp，包含了轉(zhuǎn)錄起始位點以及完好的5'末端非翻譯區(qū))。利用引物PICL-B-EGFP-DF/R對含有EGFP的質(zhì)粒pXMJ19-EGFP[9]進展PCR擴增，得到含有bsaⅠ以及BamHⅠ接頭的EGFP片段(其5'末端含有一個保守的核糖體結(jié)合位點AAAGGAGGA)。將得到的啟動子片段和EGFP片段分別用上述接頭對應(yīng)的內(nèi)切酶處理。酶切、純化后將兩片段與HindⅢ和BamHⅠ處理過的p19-0載體一起進展連接反響。轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5alpha;，構(gòu)建得到乙醇誘導(dǎo)載體PICL-B-EGFP。

1.2.2、生長曲線的繪制

將過夜培養(yǎng)的谷氨酸棒桿菌接種于50mL新穎培養(yǎng)基中，使初始OD600值為0.3。用移液器準(zhǔn)確分裝48mL培養(yǎng)物至24多孔培養(yǎng)板中，每孔2mL。置于30℃，200r/min搖床中培養(yǎng)，每隔2h從對應(yīng)的孔中汲取培養(yǎng)物用于OD600和熒光強度檢測。

1.2.3、增強型綠色熒光蛋白強度的測定

將待測的谷氨酸棒桿菌培養(yǎng)物用PBS緩沖液洗滌兩次，重懸并將OD600調(diào)至0.5左右，使用熒光分光光度計測定熒光強度。激發(fā)波長為488nm，發(fā)射波長為507nm。

1.2.4、SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳樣品的制備

搜集所有用于蛋白膠檢測的樣品，棄去上清。用PBS緩沖液洗滌兩遍，稱取一樣濕重的菌體(約0.03g)。參加1mLPBS緩沖液重懸，利用超聲波破碎樣品(間隔2s，破碎1s,25%功率，15min)至不再渾濁，破碎過程置于冰水混合物上。破碎后12000r/min,4℃離心15min。取適量上清參加5x蛋白膠上樣緩沖液混勻，置于沸水浴煮5min。

2、結(jié)果與分析

2.1、不同乙醇濃度對tac啟動子表達EGFP的影響

檢測了含有pXMJ19-EGFP載體、tac啟動子組成型表達EGFP的谷氨酸棒桿菌在0%、1%、3%和5%乙醇培養(yǎng)基中培養(yǎng)24h后的OD600以及熒光強度。如圖1所示，顯然較高濃度的乙醇(4%、5%)對于谷氨酸棒桿菌的生長和外源蛋白表達都是有阻礙的。低濃度的乙醇(1%、2%)不但能促進生物量大幅提升，而且可以顯著進步外源蛋白的表達程度。有趣的是，谷氨酸棒桿菌在3%乙醇濃度下培養(yǎng)24h后，熒光強度和菌體OD600與不加乙醇的對照相比都根本一致，似乎展現(xiàn)出了某種平衡性。

圖1不同濃度乙醇對單位熒光強度和OD600的影響

Figure1EffectsofethanolconcentrationonunitfluorescenceintensityandOD600

由此可見，乙醇的添加對谷氨酸棒桿菌存在著正反兩個方面的效應(yīng):高于某個"平衡濃度";時，菌體生長量和外源蛋白表達程度下降。低于"平衡濃度";時，生物量進步、外源蛋白表達程度進步。需要說明的是，這一"平衡濃度";的詳細數(shù)值理所當(dāng)然會與菌株、含有的質(zhì)粒以及培養(yǎng)條件等因素有關(guān)。同時，"平衡濃度";所指的不僅僅是單純的使菌體生長與對照組最接近時的乙醇添加濃度，這一濃度某種程度上也反映了菌體在脅迫環(huán)境中的總體生長過程。實驗中發(fā)現(xiàn):培養(yǎng)至16h之后，"平衡濃度";及以上的實驗組和不加乙醇的對照組菌體生長根本都已停滯或極為緩慢，但初始添加了低濃度乙醇的樣本此時還沒有到達發(fā)酵終點，仍有較高的生長速率(圖2)。

2.2、乙醇在被利用的過程中促進了綠色熒光蛋白的表達

鑒于低濃度乙醇的添加對谷氨酸棒桿菌EGFP表達展現(xiàn)出了有益效果，筆者對其做了進一步的討論。谷氨酸棒桿菌具有較強的乙醇脫氫酶活性，乙醇會經(jīng)過乙醇脫氫酶和醛脫氫酶轉(zhuǎn)化為乙酸，然后通過乙酸激酶(acetatekinase,AK)和磷酸轉(zhuǎn)乙?；?Phosphotransacetylase,PTA)轉(zhuǎn)化為乙酰輔酶A繼而進入乙醛酸循環(huán)和三羧酸循環(huán)途徑被菌體利用。并且，谷氨酸棒桿菌存在著與大腸桿菌中葡萄糖效應(yīng)類似的機制，即菌體會優(yōu)先利用速效碳源[10]。上述表達EGFP的谷氨酸棒桿菌的生長和單位熒光強度變化曲線如圖2所示，不難看出EGFP程度相比對照的進步發(fā)生在菌體的二次生長過程中，這一階段乙醇作為最主要的遲效碳源被菌體利用。葡萄糖的存在可以顯著抑制乙醇脫氫酶等乙醇代謝途徑關(guān)鍵酶的表達從而抑制乙醇的利用[8,11]。如圖3所示，在培養(yǎng)基中額外添加1%的葡萄糖、培養(yǎng)24h后，菌體量相比對照大幅增長，但EGFP表達程度下降。而在已含有1%葡萄糖的培養(yǎng)基中再參加1%乙醇后，菌體量和EGFP相比單純添加葡萄糖的培養(yǎng)基卻有所降低。由此可見，乙醇是在被利用的過程中促進了EGFP表達的進步，乙醇對菌體的一些脅迫刺激作用例如對分子伴侶的誘導(dǎo)并不是熒光強度進步的原因。

圖2生長曲線和單位熒光強度的變化

Figure2Growthcurvesandchangesofunitfluorescenceintensity

2.3、乙酸無法完全替代乙醇誘導(dǎo)EGFP的表達

乙醇的利用會促進菌體的生長，熒光蛋白表達程度的提升也許只是更多代次的菌體增殖所致。乙酸是乙醇代謝過程的中間產(chǎn)物，谷氨酸棒桿菌同樣可以充分利用乙酸作為唯一碳源生長。在Arndt等的報道中，谷氨酸棒桿菌在含有1%乙醇的合成培養(yǎng)基中生長速率要略低于含有同樣濃度乙酸作為唯一碳源的培養(yǎng)基[8]。如圖4所示，添加1%乙酸培養(yǎng)上述EGFP表達菌株48h后，單位熒光強度相比對照只進步了約20%。在不添加葡萄糖的MM合成培養(yǎng)基[8]中，以乙醇為唯一碳源培養(yǎng)時的單位熒光強度仍會比乙酸高出約70%。因此，無法完全用乙酸的利用去解釋乙醇對EGFP表達的誘導(dǎo)效應(yīng)。在Arndt等的表達譜數(shù)據(jù)中，有39個基因在以乙醇為唯一碳源的培養(yǎng)基中表達程度顯著高于葡萄糖或乙酸碳源培養(yǎng)基，這些基因的功能涉及了鋅、鎂、錳離子的吸收以及三羧酸循環(huán)途徑[8]。此外，一些脫氫酶(如琥珀酸脫氫酶、乙醇脫氫酶、乙醛脫氫酶等)的表達程度也會在以乙醇為唯一碳源時大幅進步，因此乙醇利用所導(dǎo)致的熒光蛋白表達進步或許和胞內(nèi)復(fù)原力程度有關(guān)。

圖3添加葡萄糖對單位熒光強度的影響

Figure3Effectofglucosesupplementationonunitfluorescenceintensity

圖4乙酸和乙醇對EGFP表達影響的比照

Figure4parisonoftheinfluenceonEGFPexpressionbetweenacetateandethanol.Statisticallysignificantdifferencesparedwithcontrolsamplewereindicatedwithasterisks

*:Ple;0.05;**:Ple;0.01

2.4、幾種常見培養(yǎng)基的效果比擬

考慮到低濃度的乙醇一方面能在菌體的二次生長階段作為碳源被利用刺激谷氨酸棒桿菌大量生長，另一方面又對外源蛋白表達有顯著的促進作用。因此當(dāng)利用谷氨酸棒桿菌進展外源蛋白表達時，乙醇或許更適宜作為補料碳源。如前文所述，谷氨酸棒桿菌的蛋白表達與大腸桿菌一樣會受到速效碳源的抑制，因此培養(yǎng)基中添加葡萄糖對于外源蛋白表達不利。利用大腸桿菌表達蛋白時往往會以甘油為碳源補料，然而谷氨酸棒桿菌很多關(guān)于外源蛋白表達的研究仍舊會以葡萄糖作為主要的碳源和能源，所使用的半合成培養(yǎng)基也大多是在酵母粉或LB培養(yǎng)基的根底上進展改良，例如添加腦心浸出液(brainheartinfusion,BHI)等物質(zhì)[13]。因此就乙醇和其他營養(yǎng)物質(zhì)的添加對谷氨酸棒桿菌熒光蛋白表達和菌體生長量的影響進展了比照。如圖5所示，培養(yǎng)48h后，無論是OD600還是單位的熒光蛋白表達強度，在LB培養(yǎng)基的根底上添加乙醇都要比添加昂貴的腦心浸液要好。有趣的是，完全由4%腦心浸出液構(gòu)成的BHI培養(yǎng)基雖然也能顯著促進菌體生長，但腦心浸出液的添加似乎會對蛋白表達產(chǎn)生一定的抑制作用。

圖5不同營養(yǎng)物質(zhì)的添加對EGFP和OD600影響的比照

Figure5parisonoftheinfluenceonOD600andEGFPlevelbetweenvariousnutrients

2.5、乙醇誘導(dǎo)啟動子的構(gòu)建

如圖6所示，在對圖2中36h的樣品進展的SDS檢測中，1%乙醇的添加會使得菌體胞內(nèi)蛋白多出一條蛋白條帶，該條帶相比其他被1%乙醇誘導(dǎo)的蛋白更為顯著，這意味著乙醇對該啟動子的誘導(dǎo)幅度較大又或者該基因的翻譯效率較高。經(jīng)質(zhì)譜檢測該條帶是乙醛酸循環(huán)中的異檸檬酸裂合酶(Isocitratelyase,ICL)。為了對乙醇作為遲效碳源及其誘導(dǎo)外源蛋白表達的效應(yīng)加以利用，實驗用該基因啟動子以雙順反子的形式構(gòu)建了EGFP的表達載體，并對其誘導(dǎo)表達熒光蛋白的才能進展了測試。其中雙順反子構(gòu)造的應(yīng)用有助于進步翻譯效率以及mRNA穩(wěn)定性(構(gòu)建原理見圖7)[14,15]。如圖8所示，在含有1%乙醇的LBB培養(yǎng)基中培養(yǎng)36h后，相比不添加乙醇的對照該表達載體具有9.5倍的誘導(dǎo)效果，相比自身對數(shù)期(4h)的表達程度有著21.1倍自誘導(dǎo)效果。添加1%乙醇的條件下該自誘導(dǎo)載體的表達程度到達了tac啟動子約65%的強度，高出不添加1%乙醇時的tac啟動子約30%。Kim等開發(fā)并優(yōu)化的谷氨酸棒桿菌自誘導(dǎo)載體表達sfGFP時的自誘導(dǎo)倍數(shù)為3.5倍，但由于該報道并沒有與傳統(tǒng)的tac啟動子進展比照，培養(yǎng)條件和表達的蛋白種類也有差異，因此無法對兩種自誘導(dǎo)啟動子的表達強度進展直接比照[16]。

圖6SDS檢測乙醇利用引起的胞內(nèi)蛋白表達變化

Figure6SDSanalysisofintracellularproteinchangeinducedbyethanolutilization

圖7PICL-B-EGFP雙順反子表達載體構(gòu)造示意圖

Figure7ArchitectureofbicistronicexpressionvectorPICL-B-EGFPTSP:transcriptionstartpoint;SD:Shine-Dalgarnosequence

圖8PICL-B-EGFP載體的EGFP表達強度和誘導(dǎo)效果

Figure8EGFPexpressionstrengthandinducibilityofPICL-B-EGFP

參考文獻

【1】WIESCHALKAS,BLOMBACHB,BOTTM,etal.Bio-basedproductionoforganicacidswithCorynebacteriumglutamicum[J].MicrobialBiotechnology,2022,6(2):87-102.

【2】LIUX,YANGY,ZHANGW,etal.ExpressionofrebinantproteinusingCorynebacteriumglutamicum:progress,challengesandapplications[J].CriticalReviewsinBiotechnology,2022,36(4):652-664.

【3】JOJIMAT,NOBURYUR,SASAKIM,etal.MetabolicengineeringforimprovedproductionofethanolbyCorynebacteriumglutamicum[J].AppliedMicrobiologyandBiotechnology,2022,99(3):1165-1172.

【4】MARTINEZ-ALONSOM,GARCIA-FRUITOSE,FERRER-MIRALLESN,etal.Sideeffectsofchaperonegeneco-expressioninrebinantproteinproduction[J].MicrobialCellFactories,2022,9:64.

【5】HORINOUCHIT,TAMAOKAK,FURUSAWAC,etal.Transcriptomeanalysisofparallel-evolvedEscherichiacolistrainsunderethanolstress[J].BMCGenomics,2022,11:579.

【6】THOMASJG,BANEYXF.DivergenteffectsofchaperoneoverexpressionandethanolsupplementationoninclusionbodyformationinrebinantEscherichiacoli[J].ProteinExpressionandPurification,1997,11(3):289-296.

【7】楊軍蘭,徐焰,蘇明權(quán),等.乙醇對結(jié)核分枝桿菌Mr38000蛋白在大腸桿菌中可溶性表達的促進作用[J].第四軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報,2022,26(4):360-362.

[8]ARNDTA,AUCHTERM,ISHIGET,etal.EthanolcatabolisminCorynebacteriumglutamicum[J].JournalofMolecularMicrobiologyandBiotechnology,2022,15(4):222-233.

[9]趙子豪.谷氨酸棒桿菌表達組件的開發(fā)與應(yīng)用[D].無錫:江南大學(xué).2022.

[10]ARNDTA,EIKMANNSBJ.ThealcoholdehydrogenasegeneadhAinCorynebacteriumglutamicumissubjecttocarboncataboliterepression[J].JournalofBacteriology,2022,189(20):7408-7416.

[11]SUBHADRAB,LEEJK.ElucidationoftheregulationofethanolcatabolicgenesandptsGusingaglxRandadenylatecyclasegene(cyaB)deletionmutantsofCorynebacteriumglutamicumATCC13032[J].JournalofMicrobiologyandBiotechnology,2022,23(12):1683-1690.

[12]EIKMANNSBJ,METZGERM,REINSCHEIDD,etal.AmplificationofthreethreoninebiosynthesisgenesinCorynebacteriumglutamicumanditsinfluenc