動(dòng)物疾病的實(shí)驗(yàn)室診斷-細(xì)菌病的實(shí)驗(yàn)室診斷基本技術(shù)（動(dòng)物微生物與免疫）

細(xì)菌培養(yǎng)基的制備培養(yǎng)基制備的基本要求和程序要求：選取所需營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)調(diào)整pH培養(yǎng)基應(yīng)均質(zhì)透明不含抑菌物質(zhì)滅菌處理基本程序：

配料溶化測(cè)定及矯正pH過濾分裝滅菌無菌檢驗(yàn)備用肉膏湯培養(yǎng)基的制備普通瓊脂平板和斜面培養(yǎng)基的制備半固體培養(yǎng)基的制備

細(xì)菌培養(yǎng)基的制備

材料牛肉膏、蛋白胨氯化鈉、蒸餾水、瓊脂、10%NaOHpH試紙、三角燒瓶量筒，天平酒精燈、等。方法

⑴調(diào)配成分⑵溶解⑶調(diào)節(jié)pH⑷分裝⑸滅菌⑹質(zhì)量檢驗(yàn)⑺保存

培養(yǎng)基配制步驟

1.肉膏湯培養(yǎng)基的配制:

⑴稱樣：牛肉膏0.5g蛋白胨1g氯化鈉0.5g

(2)待冷至40～50℃時(shí)，矯正酸堿度為pH7.6

(3)分裝于試管內(nèi)（每管約5ml）置高壓蒸汽滅菌器內(nèi)滅菌(121.3-20min)。

加至100ml蒸餾水中，加熱溶化

2.普通瓊脂平板培養(yǎng)基配制：

于100ml肉膏湯培養(yǎng)基中加入2.5g瓊脂，溶解，矯正pH值，高壓蒸汽滅菌，待冷至50～60℃，倒制平板。3.普通斜面培養(yǎng)基

于100ml肉膏湯培養(yǎng)基中加入1g瓊脂，分裝于試管內(nèi)（每管約5ml）置高壓蒸汽滅菌器內(nèi)滅菌(121.3℃，20-30min)

.

配制見瓶簽說明3.半固體培養(yǎng)基糖發(fā)酵培養(yǎng)基

取蛋白胨1g，氯化鈉0.5g，瓊脂0.5g，加入蒸餾水溶解，調(diào)節(jié)pH（7.6），加入1.6%溴甲酚紫0.1mL,加入事先溶解的單糖溶液，加蒸餾水定容100mL。分裝，高壓蒸汽滅菌。葡萄糖蛋白胨水

取蛋白胨0.7g，葡萄糖0.5g，磷酸氫二鉀0.38g，蒸餾水溶解并定容100mL，調(diào)pH7.6，分裝，滅菌。蛋白胨水

取蛋白胨1g，氯化鈉0.5g，蒸餾水溶解并定容100mL，調(diào)pH7.6，分裝，滅菌。細(xì)菌的生化檢測(cè)二、

原理

各種微生物在代謝類型上表現(xiàn)了很大的差異。不同微生物因具有不同的酶系統(tǒng)，分解利用糖類、脂肪類和蛋白類物質(zhì)的能力不同，其發(fā)酵的類型和產(chǎn)物也不相同。細(xì)菌的生理生化反應(yīng)在菌株的分類鑒定中有很大作用。

用于區(qū)分產(chǎn)氣桿菌屬和大腸桿菌屬糖發(fā)酵實(shí)驗(yàn)不同菌對(duì)不同糖的利用情況不同：分解某糖產(chǎn)酸分解某糖產(chǎn)酸產(chǎn)氣不能利用某糖糖發(fā)酵試驗(yàn)結(jié)果判斷反應(yīng)現(xiàn)象結(jié)果描述酸性變色、有氣泡分解××糖產(chǎn)酸、產(chǎn)氣酸性變色、無氣泡分解××糖產(chǎn)酸、不產(chǎn)氣培養(yǎng)基不變色不分解××糖甲基紅(MR)實(shí)驗(yàn)葡萄糖→丙酮酸→乙酰甲基甲醇ＰＨ＞５.４甲基紅陰性（–）

如:產(chǎn)氣腸桿菌:-葡萄糖→丙酮酸PH≤４.５甲基紅陽性（+）

如:大腸桿菌:+V-P實(shí)驗(yàn)葡萄糖→丙酮酸→乙酰甲基甲醇→二乙酰＋胍基化合物→紅色化合物葡萄糖→丙酮酸H2S實(shí)驗(yàn)

含硫AAH2S+FeSO4FeS

(黑色)靛基質(zhì)實(shí)驗(yàn)

色氨酸→吲哚→玫瑰吲哚吲哚試劑(對(duì)二甲基氨基苯甲醛)枸櫞酸鹽利用實(shí)驗(yàn)利用枸櫞酸鹽，細(xì)菌生長(zhǎng)，培養(yǎng)基內(nèi)銨鹽分解產(chǎn)生氨從而變?yōu)閴A性，指示劑溴麝香草酚蘭由草綠色變?yōu)樯钏{(lán)色+不能利用枸櫞酸鹽，無細(xì)菌生長(zhǎng)，培養(yǎng)基仍為草綠色-大腸桿菌和產(chǎn)氣桿菌生化特性比較大腸桿菌產(chǎn)氣桿菌靛基質(zhì)MRVP枸櫞酸鹽

大腸桿菌++--產(chǎn)氣桿菌--++IMViC試驗(yàn)結(jié)果細(xì)菌的生理生化特性一、細(xì)菌的營(yíng)養(yǎng)1、細(xì)菌的化學(xué)組成細(xì)菌的化學(xué)組成水分（70-90%）：結(jié)合水和游離水有機(jī)物蛋白質(zhì)（主要成分，占固形物50%-80%）核酸（有RNA和DNA兩種，前者主要存在于胞漿中，胞膜上；后者存在于核質(zhì)、質(zhì)粒中）糖類（主要以多糖、脂多糖和粘多糖的形式存在）脂類（存在于細(xì)胞壁、胞漿膜及胞漿內(nèi)）其他有機(jī)物（各種生長(zhǎng)因子和色素）無機(jī)物：以磷和鉀含量最多2、細(xì)菌的營(yíng)養(yǎng)類型營(yíng)養(yǎng)類型自養(yǎng)菌光能自養(yǎng)菌化能自養(yǎng)菌異養(yǎng)菌光能異養(yǎng)菌化能異養(yǎng)菌腐生菌寄生菌按能量來源分按生活方式分按能量來源分

完全在無機(jī)環(huán)中生存，以CO2、碳酸鹽為碳源，以銨鹽和硝酸鹽為氮源來合成細(xì)胞質(zhì)的微生物稱為自養(yǎng)微生物。自養(yǎng)微生物（無機(jī)營(yíng)養(yǎng)型）

光能自養(yǎng)微生物（光能無機(jī)營(yíng)養(yǎng)型）

可在完全無機(jī)的環(huán)境中生長(zhǎng)，以CO2為碳源，光做能源，合成細(xì)胞有機(jī)物質(zhì)的微生物叫光能自養(yǎng)微生物。

化能自養(yǎng)微生物（化能無機(jī)營(yíng)養(yǎng)型）

在完全無機(jī)的環(huán)境中生長(zhǎng)發(fā)育，以無機(jī)化合物氧化時(shí)釋放的能量為能源，以CO2或碳鹽為碳源，合成細(xì)胞物質(zhì)的微生物叫化能自養(yǎng)微生物。這類細(xì)菌包括硫細(xì)菌、硝化細(xì)菌、鐵細(xì)菌等。異養(yǎng)微生物（有機(jī)營(yíng)養(yǎng)型）

在完全有機(jī)環(huán)境中生長(zhǎng)繁殖，以含碳有機(jī)物為碳源，含氮有機(jī)物或無機(jī)物為氮源，合成細(xì)胞物質(zhì)，稱為異養(yǎng)微生物。光能異養(yǎng)微生物（光能有機(jī)營(yíng)養(yǎng)型）

這類微生物具有光合色素。能利用光做能源，利用有機(jī)碳合成細(xì)胞物質(zhì)的微生物，稱光能異養(yǎng)微生物。化能異養(yǎng)微生物（化能有機(jī)營(yíng)養(yǎng)型）

這類微生物以有機(jī)化合物為碳源，利用有機(jī)化合物氧化過程中產(chǎn)生的能量為能源，以有機(jī)或無機(jī)含氮化合物為氮源，合成細(xì)胞物質(zhì)。這類微生物稱為化能異養(yǎng)微生物。

由于棲息場(chǎng)所和攝取養(yǎng)料不同，可將異養(yǎng)微生物分為腐生型和寄生型兩大類。腐生型：利用無生命的有機(jī)物獲得營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)。寄生型：從活的寄生體內(nèi)獲取營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)。中間類型（兼性腐生或兼性寄生）如大腸桿菌。四種微生物的營(yíng)養(yǎng)類型比較以上四種營(yíng)養(yǎng)類型劃分不是絕對(duì)的紅螺菌既可利用光能，也可利用化能。氫單胞菌是異養(yǎng)和自養(yǎng)的過渡型（稱兼性自養(yǎng)型）。微生物的營(yíng)養(yǎng)類型區(qū)別

營(yíng)養(yǎng)類型主要碳源能源代表菌光能自養(yǎng)型二氧化碳光能藍(lán)細(xì)菌光能異養(yǎng)型有機(jī)物光能紅螺細(xì)菌化能自養(yǎng)型二氧化碳無機(jī)物硫桿菌化能異養(yǎng)型有機(jī)物有機(jī)物大腸桿菌3、細(xì)菌的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)水溶劑和運(yùn)輸介質(zhì)參與細(xì)胞內(nèi)許多生化反應(yīng)維持蛋白質(zhì)、核酸等生物大分子穩(wěn)定的天然構(gòu)像有利于調(diào)節(jié)細(xì)胞溫度和保持環(huán)境溫度穩(wěn)定碳源來源于糖類、脂類，提供合成物質(zhì)原料、能量氮源來源于氨基酸、蛋白質(zhì)等，合成菌體成分生長(zhǎng)因子生長(zhǎng)必需但自身不能合成的物質(zhì)。如，維生素、氨基酸等。無機(jī)鹽類鉀、納、鈣、鎂、磷、硫等，維持結(jié)構(gòu)穩(wěn)定，調(diào)節(jié)滲透壓。大腸桿菌培養(yǎng)基

牛肉膏——碳源、能源、磷酸鹽和維生素

蛋白胨——氮源和維生素

NaCL——無機(jī)鹽

水鴨疫里氏桿菌培養(yǎng)時(shí)需有：X因子（高鐵血紅素）、V因子（輔酶Ⅰ或Ⅱ），即需用加鮮血制備的巧克力培養(yǎng)基培養(yǎng)。單純擴(kuò)散特點(diǎn)：物質(zhì)進(jìn)入細(xì)胞的動(dòng)力是細(xì)胞內(nèi)外的濃度差。這種運(yùn)輸方式不消耗能量。沒有特異性，被運(yùn)輸物質(zhì)不與膜上物質(zhì)發(fā)生任何反應(yīng)，物質(zhì)不發(fā)生化學(xué)變化。4、細(xì)菌攝取營(yíng)養(yǎng)的方式促進(jìn)擴(kuò)散特點(diǎn):膜載體（載體蛋白）有很強(qiáng)的特異性在運(yùn)輸過程中，本身不發(fā)生化。能加快物質(zhì)運(yùn)輸?shù)乃俣取?/p>

膜載體在膜外與營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)親合力強(qiáng)，與這種物質(zhì)結(jié)合，進(jìn)入細(xì)胞后親合力降低釋放營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)。像渡船一樣，膜外裝貨，膜內(nèi)卸貨，這種擴(kuò)散方式比單純擴(kuò)散速度快。被運(yùn)送的物質(zhì)可逆濃度梯度進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)要消耗能量，必需有能量參加。有膜載體參加被運(yùn)送物質(zhì)不發(fā)生任何變化。主動(dòng)運(yùn)輸特點(diǎn):基團(tuán)移位：是在研究糖的運(yùn)輸時(shí)發(fā)現(xiàn)的一種主動(dòng)運(yùn)輸方式。運(yùn)輸過程中需要能量，被運(yùn)輸?shù)奈镔|(zhì)發(fā)生化學(xué)變化的運(yùn)輸叫基團(tuán)移位。許多糖就是靠基團(tuán)移位進(jìn)行運(yùn)輸?shù)?。這種運(yùn)輸方式是微生物通過磷酸轉(zhuǎn)移酶系統(tǒng)來運(yùn)輸營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的?；鶊F(tuán)移位特點(diǎn)四種物質(zhì)運(yùn)輸方式小結(jié)：?jiǎn)渭償U(kuò)散——最簡(jiǎn)單的交換方式

氣體、水溶性小分子物質(zhì)、某些離子促進(jìn)擴(kuò)散——需濃度差和載體

糖或氨基酸主動(dòng)運(yùn)輸——主要方式，需載體和能量消耗

氨基酸和各種營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)基團(tuán)轉(zhuǎn)位——需化學(xué)修飾，需載體和能量消耗主要存在于厭氧性和兼性厭氧型細(xì)菌中，主要用于糖的運(yùn)輸，脂肪酸、核苷、堿基等各種攝取營(yíng)養(yǎng)方式的比較運(yùn)輸方式濃度載體耗能運(yùn)送分子發(fā)生變化單純擴(kuò)散高→低不需要不耗能不變化促進(jìn)擴(kuò)散高→低需要不耗能不變化主動(dòng)運(yùn)輸?shù)汀咝枰哪懿蛔兓鶊F(tuán)轉(zhuǎn)位低→高需要耗能變化二、細(xì)菌的生長(zhǎng)繁殖1、生長(zhǎng)繁殖條件充足的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)適宜的酸堿度(pH)多數(shù)病原菌最適pH為7.2~7.6合適的溫度

多數(shù)病原菌最適37℃

必要的氣體據(jù)對(duì)氧氣的需求可將細(xì)菌分為：專性需氧菌：如結(jié)核桿菌專性厭氧菌：如破傷風(fēng)梭菌兼性厭氧菌：大多數(shù)病原菌微需氧菌：如空腸彎曲

CO2對(duì)細(xì)菌的生長(zhǎng)也很重要。大部分細(xì)菌在新陳代謝過程中產(chǎn)生的CO2可滿足需要。恰當(dāng)?shù)臐穸群蜐B透壓2、生長(zhǎng)繁殖方式和速度細(xì)菌繁殖方式

無性二分裂二分裂繁殖；繁殖速度

多數(shù)細(xì)菌繁殖速度一般為20-30min一代；但少數(shù)細(xì)菌代時(shí)較長(zhǎng)，如結(jié)核分枝桿菌為18～24h才分裂一次。

繁殖速度一般20～30分鐘一代

二分裂繁殖3、細(xì)菌生長(zhǎng)曲線

將一定數(shù)量的細(xì)菌接種在適宜的液體培養(yǎng)基中，定時(shí)取樣計(jì)算細(xì)菌數(shù)，可發(fā)現(xiàn)細(xì)菌生長(zhǎng)過程的規(guī)律性。以時(shí)間為橫坐標(biāo)，菌數(shù)的對(duì)數(shù)為縱坐標(biāo)，可形成一條生長(zhǎng)曲線，曲線顯示了細(xì)菌生長(zhǎng)繁殖的4個(gè)時(shí)期。

生長(zhǎng)曲線是依據(jù)在體外人工培養(yǎng)條件下細(xì)菌的繁殖速度繪制的，在動(dòng)物體內(nèi)的細(xì)菌繁殖速度規(guī)律不符合生長(zhǎng)曲線。生長(zhǎng)曲線12培養(yǎng)時(shí)間細(xì)菌總數(shù)細(xì)菌數(shù)目的對(duì)數(shù)34活菌數(shù)

遲緩期12對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期23穩(wěn)定期34衰退期4551.遲緩期特點(diǎn)生長(zhǎng)速率常數(shù)等于零菌體粗大ＲＮＡ含量增加代謝活力強(qiáng)對(duì)不良條件抵抗能力降低

縮短遲緩期的意義和方法可以縮短生產(chǎn)周期，提高設(shè)備利用率。接種對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的菌種，采用最適菌齡加大接種量用與培養(yǎng)菌種相同組成分的培養(yǎng)基2、指數(shù)期(對(duì)數(shù)期）

特點(diǎn)①活菌數(shù)呈對(duì)數(shù)增加②酶系活躍，代謝旺盛③生長(zhǎng)速率最大，生產(chǎn)時(shí)間最短④細(xì)胞的化學(xué)組成及形態(tài)，生理特性比較一致特點(diǎn)活菌數(shù)保持相對(duì)穩(wěn)定，總菌數(shù)達(dá)最高水平。細(xì)菌代謝物積累達(dá)到最高峰。芽胞桿菌這時(shí)開始形成芽胞。這是生產(chǎn)收獲時(shí)期。3、穩(wěn)定期4、衰亡期特點(diǎn)細(xì)菌死亡數(shù)大于增殖數(shù),活菌數(shù)明顯減少,群體衰落細(xì)胞出現(xiàn)多形態(tài),大小不等的畸形,變成衰退型細(xì)胞死亡,出現(xiàn)自溶現(xiàn)象。三、細(xì)菌的新陳代謝1、細(xì)菌的酶（營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)代謝）據(jù)作用位置分

胞內(nèi)酶：細(xì)胞內(nèi)發(fā)揮作用，與代謝有關(guān)（參與呼吸、蛋白質(zhì)和多糖代謝過程的酶）

胞外酶：分泌到細(xì)胞外發(fā)揮作用，與毒力有關(guān)

（水解酶）據(jù)酶生產(chǎn)的條件分

固有酶：必須有的（如脫氫酶）

誘導(dǎo)酶：為適應(yīng)環(huán)境而產(chǎn)生的，如大腸桿菌的半乳糖酶。（如大腸桿菌的半乳糖苷酶，只有培養(yǎng)基中加入乳糖時(shí)才產(chǎn)生該酶，分解乳糖。）2、細(xì)菌呼吸的類型（能量代謝）細(xì)菌的呼吸：細(xì)菌借助菌體呼吸酶從物質(zhì)氧化過程中獲得能量的過程。

據(jù)對(duì)氧的需求不同可分為3大類專性需氧菌

呼吸酶系統(tǒng)完善，呼吸時(shí)必須有充足的氧，在無氧的條件下不能生長(zhǎng)。在高層振蕩培養(yǎng)時(shí)，生長(zhǎng)在表面。如，結(jié)核分枝桿菌。專性厭氧菌呼吸酶系統(tǒng)不完善，必須在無氧或氧濃度極低的條件下才能生長(zhǎng)。在高層振蕩培養(yǎng)時(shí)，生長(zhǎng)在試管底部。如，破傷風(fēng)梭菌。兼性厭氧菌

酶系統(tǒng)復(fù)雜，在有氧或無氧條件下均可生長(zhǎng)，但有氧更佳。大多數(shù)細(xì)菌屬此類。沉淀生長(zhǎng)混濁生長(zhǎng)菌膜生長(zhǎng)專性厭氧型兼性厭氧型專性需氧型3、新陳代謝產(chǎn)物分解代謝產(chǎn)物糖的分解產(chǎn)物

產(chǎn)物：氣體（CO2、H2）、酸類、醇類和酮類。鑒定試驗(yàn)：糖發(fā)酵試驗(yàn)、維-培（V-P）試驗(yàn)、甲基紅（MR）試驗(yàn)等。蛋白質(zhì)和氨基酸的分解產(chǎn)物產(chǎn)物：硫化氫、吲哚（靛基質(zhì)）、明膠、氨、亞硝酸鹽等。鑒定試驗(yàn)：靛基質(zhì)試驗(yàn)、硫化氫試驗(yàn)、尿素分解試驗(yàn)、明膠液化試驗(yàn)、硝酸鹽還原試驗(yàn)等。

意義：利用生物化學(xué)方法（生化反應(yīng)）來鑒別不同細(xì)菌合成代謝產(chǎn)物通過新陳代謝不斷合成菌體成分，如糖類、脂類、核酸、蛋白質(zhì)和酶類等。此外，還能合成一些與人類生產(chǎn)實(shí)踐相關(guān)的產(chǎn)物。動(dòng)植物健康維生素：腸道菌合成VC，VB抗生素：放線菌和真菌可產(chǎn)生抗生素細(xì)菌素：抗菌范圍較抗生素狹窄。大腸菌素、綠膿菌素等。殺菌或抑菌作用，用于治療感染性疾病抗生素具抑菌或殺菌作用，但抑菌譜窄，主要用于細(xì)菌分型和流行病的調(diào)查。細(xì)菌素如維生素B6、B12、K2等，可用于治療維生素缺乏所致的疾病維生素毒力毒素：內(nèi)、外毒素，與細(xì)菌毒力有關(guān)熱原質(zhì)：生長(zhǎng)在液體環(huán)境細(xì)菌產(chǎn)生一種多糖，注入動(dòng)物體內(nèi)引起反應(yīng)，主要為細(xì)胞壁中的脂多糖，可成為內(nèi)毒素，耐高溫。酶類：代謝所需酶和毒力相關(guān)酶，如透明質(zhì)酸酶細(xì)菌鑒定色素：金黃色色素、類胡蘿卜素，對(duì)細(xì)菌鑒定有意義對(duì)組織細(xì)胞有毒害作用如透明質(zhì)明酸酶、血漿凝固酶等。侵襲性酶內(nèi)毒素

G－菌的脂多糖外毒素

G＋菌和少數(shù)G－菌產(chǎn)生的蛋白質(zhì)毒素某些G-菌及少數(shù)G+菌產(chǎn)生的一類多糖物質(zhì)，注入人體或動(dòng)物體內(nèi)可引起發(fā)熱反應(yīng)。革蘭氏陰性菌產(chǎn)生的熱原質(zhì)為脂多糖。耐熱，用高壓滅菌法不能破壞，可經(jīng)250℃，30分鐘或180℃，4小時(shí)高溫處理，液體中的熱原質(zhì)可用離子交換劑或過濾方法除去。熱原質(zhì)如葡萄球菌產(chǎn)生的金黃色色素、綠膿桿菌產(chǎn)生的綠膿素，可用于鑒別細(xì)菌。色素白色檸檬色細(xì)菌病的實(shí)驗(yàn)室診斷細(xì)菌實(shí)驗(yàn)室診斷在臨床診斷的基礎(chǔ)上，通過實(shí)驗(yàn)室診斷，確定病原是否是細(xì)菌以及病原菌的類型。病料收集采集保存運(yùn)送細(xì)菌分離分離培養(yǎng)涂片染色鏡檢細(xì)菌鑒定純化和鑒別培養(yǎng)生化試驗(yàn)動(dòng)物接種血清學(xué)試驗(yàn)分子生物學(xué)試驗(yàn)一、病料的采集、保存和運(yùn)送病料采集遵循的原則

防止污染、無菌采樣、適時(shí)采樣、適當(dāng)部位（病料含病原多和病料適量）病料采集方法（不同病料不同方法）

實(shí)質(zhì)臟器、液體材料、其他病料、病料的保存和送檢二、細(xì)菌的形態(tài)學(xué)檢查方法光學(xué)顯微鏡檢查電子顯微鏡檢查意義觀察病料中有無細(xì)菌以及細(xì)菌的形態(tài)、數(shù)量、分布、結(jié)構(gòu)、種類等，進(jìn)行初步判斷。染色鏡檢方法（2個(gè)時(shí)機(jī)）病料的涂片鏡檢（美藍(lán)染色或瑞士染色）決定分離培養(yǎng)的重要依據(jù)確診（禽霍亂、炭疽）分離培養(yǎng)菌的涂片染色（革蘭氏染色）細(xì)菌鑒定方法之一生化鑒定和血清學(xué)鑒定的前提禽霍亂多殺性巴氏桿菌，組織或血液涂片瑞氏染色，菌體呈兩極著色。是兩端鈍圓，中央微凸的短桿菌，長(zhǎng)1～1.5um，寬0.3～0.6um，不形成芽胞，也無運(yùn)動(dòng)性。病料組織或體液涂片用瑞氏、姬姆薩氏法或美藍(lán)染色鏡檢，見菌體多呈卵圓形，兩端著色深，中央部分著色較淺，很象并列的兩個(gè)球菌，所以又叫兩極桿菌炭疽炭疽桿菌菌體粗大，兩端平截或凹陷，是致病菌中最大的細(xì)菌。排列似竹節(jié)狀，無鞭毛，無動(dòng)力，革蘭氏染色陽性，本菌在氧氣充足，溫度適宜（25～30℃）的條件下易形成芽孢。三、細(xì)菌的分離培養(yǎng)方法：用分區(qū)劃分法在合適培養(yǎng)基上培養(yǎng)意義看培養(yǎng)基中有無細(xì)菌生長(zhǎng)推斷是否為細(xì)菌病依據(jù)菌落的特征判斷細(xì)菌種類用菌落中的細(xì)菌進(jìn)一步作形態(tài)學(xué)鑒定可進(jìn)一步作生化鑒定、血清學(xué)鑒定及動(dòng)物試驗(yàn)可進(jìn)一步作藥敏試驗(yàn)1、分離培養(yǎng)通常選用適合目標(biāo)菌生長(zhǎng)的平板培養(yǎng)基對(duì)細(xì)菌進(jìn)行分離培養(yǎng)。不同細(xì)菌的菌落大小、形態(tài)、色澤、表面特征、邊緣狀態(tài)、隆起度、透明度等特征不同。有的細(xì)菌在鮮血瓊脂平板上形成溶血環(huán)。

也可采用選擇培養(yǎng)基或鑒別培養(yǎng)基，以起到抑制雜菌或快速鑒別的效果。比如腸道桿菌科可選擇麥康凱瓊脂、伊紅美藍(lán)瓊脂。分區(qū)劃線法不同細(xì)菌的菌落大小、形態(tài)、色澤、表面特征、邊緣狀態(tài)、隆起度、透明度等特征不同不同細(xì)菌的菌落溶血環(huán)有的細(xì)菌在鮮血培養(yǎng)基上有β-溶血現(xiàn)象伊紅美藍(lán)培養(yǎng)基、麥康凱培養(yǎng)基上大腸桿菌菌落2、細(xì)菌的生化試驗(yàn)進(jìn)行生化試驗(yàn)的細(xì)菌必須是純培養(yǎng)物。檢驗(yàn)時(shí)，根據(jù)可疑細(xì)菌的生化特性選擇特定的一組生化試驗(yàn)，將結(jié)果與標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行對(duì)比，以確定病原菌的種類。例：不同種沙門氏菌的生化鑒定雞白痢沙門氏菌雞傷寒沙門氏菌鼠傷寒沙門氏菌不同種沙門氏菌的生化鑒定意義將待檢細(xì)菌液接種到動(dòng)物體內(nèi)，觀察動(dòng)物發(fā)病情況，進(jìn)一步確認(rèn)可疑細(xì)菌的致病作用和類型。接種對(duì)象本種動(dòng)物試驗(yàn)動(dòng)物接種途徑3、動(dòng)物接種灌口肌肉注射腹腔注射皮下注射腦內(nèi)接種靜脈注射常用的動(dòng)物接種途徑4、血清學(xué)試驗(yàn)臨床診斷中，可用于細(xì)菌的血清分型、快速診斷或大群檢疫。用已知抗體檢測(cè)動(dòng)物體內(nèi)的病原菌用已知的病原菌抗原檢測(cè)動(dòng)物血清中的抗體例：雞白痢的檢疫1、加一滴抗原2、加一滴雞的全血3、將抗原和血液混勻4、靜置2min,觀察結(jié)果雞白痢檢疫—全血平板凝集試驗(yàn)雞白痢檢疫結(jié)果5、分子生物學(xué)方法分子生物學(xué)技術(shù)對(duì)病原菌的快速診斷和不能人工培養(yǎng)的細(xì)菌的探索發(fā)揮巨大的作用。

PCR技術(shù)、核酸分子雜交技術(shù)等。大腸桿菌病實(shí)驗(yàn)室診斷方案病料中細(xì)菌的形態(tài)學(xué)檢查病料中細(xì)菌的分離培養(yǎng)18小時(shí)后動(dòng)物致病性試驗(yàn)涂片革蘭氏染色生化試驗(yàn)H2S試驗(yàn)糖發(fā)酵試驗(yàn)MR試驗(yàn)10日齡小雞，皮下注射0.2ml/只收集病料純培養(yǎng)大腸桿菌病實(shí)驗(yàn)室診斷結(jié)果剖檢（采集病料）纖維素滲出物的涂片染色分離培養(yǎng)（麥康凱或伊紅美藍(lán)瓊脂平板）培養(yǎng)物涂片革蘭氏染色生化試驗(yàn)動(dòng)物接種試驗(yàn)大腸桿菌病纖維滲出物中的細(xì)菌伊紅美藍(lán)培養(yǎng)基、麥康凱培養(yǎng)基上大腸桿菌菌落伊紅美藍(lán)培養(yǎng)基麥康凱培養(yǎng)基大腸桿菌培養(yǎng)物涂片革蘭氏染色大腸桿菌生化特性細(xì)菌的分離純化

1.細(xì)菌培養(yǎng)皿的接種方法（分區(qū)劃線法）

123452.肉膏湯培養(yǎng)基3.普通斜面培養(yǎng)基4.半固體培養(yǎng)基細(xì)菌的人工培養(yǎng)1、培養(yǎng)基概念：把細(xì)菌生長(zhǎng)繁殖所需的各種營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)合理地配合在一起，制成的營(yíng)養(yǎng)基質(zhì)。按物理性狀不同分種類用途液體培養(yǎng)基增菌，生化反應(yīng)半固體培養(yǎng)基鑒別動(dòng)力、保存菌種固體培養(yǎng)基斜面短期保存菌種、運(yùn)送菌種固體培養(yǎng)基平板

純化細(xì)菌，分離單個(gè)菌落常用培養(yǎng)基液體培養(yǎng)基半固體培養(yǎng)基固體培養(yǎng)基基礎(chǔ)培養(yǎng)基厭氧培養(yǎng)基選擇培養(yǎng)基鑒別培養(yǎng)基營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基按用途不同分基礎(chǔ)培養(yǎng)基含細(xì)菌生長(zhǎng)所需的基本營(yíng)養(yǎng)成分：

常用牛肉浸膏，加適量的蛋白胨、NaCl、磷酸鹽，調(diào)PH7.2-7.6即成常用類型：肉湯普通營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基蛋白胨水營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基基礎(chǔ)培養(yǎng)基+生長(zhǎng)因子常用類型：鮮血瓊脂培養(yǎng)基血清瓊脂培養(yǎng)基巧克力瓊脂培養(yǎng)基用途：營(yíng)養(yǎng)要求較高的細(xì)菌培養(yǎng)鑒別培養(yǎng)基培養(yǎng)基加入指示劑常用類型：伊紅美蘭培養(yǎng)基麥糠凱培養(yǎng)基三糖鐵培養(yǎng)基用途：細(xì)菌鑒別三糖鐵培養(yǎng)基麥康凱培養(yǎng)基厭氧培養(yǎng)基培養(yǎng)基加還原劑（如巰基乙酸鈉），或用石蠟或凡士林封住培養(yǎng)基表面，以隔絕空氣。常用類型：皰肉培養(yǎng)基。用途：厭氧菌的培養(yǎng)。選擇培養(yǎng)基培養(yǎng)基中加某種化學(xué)物質(zhì)，抑制不需要的細(xì)菌(非腸道菌)生長(zhǎng)，利于需要分離細(xì)菌的生長(zhǎng)(沙門氏桿菌分離)

常用類型：SS培養(yǎng)基3、制備培養(yǎng)基的基本要求和程序要求：選取所需營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)調(diào)整pH培養(yǎng)基應(yīng)均質(zhì)透明不含抑菌物質(zhì)滅菌處理基本程序：

配料溶化測(cè)定及矯正pH過濾分裝滅菌無菌檢驗(yàn)備用4、細(xì)菌在培養(yǎng)基中的生長(zhǎng)現(xiàn)象液體培養(yǎng)基中生長(zhǎng)現(xiàn)象

混濁：大多數(shù)細(xì)菌

沉淀：鏈狀生長(zhǎng)的細(xì)菌

菌膜：專性需氧菌，如結(jié)核桿菌、枯草桿菌菌膜沉淀渾濁對(duì)照液體培養(yǎng)基沉淀生長(zhǎng)混濁生長(zhǎng)菌膜生長(zhǎng)固體培養(yǎng)基中生長(zhǎng)情況分離培養(yǎng)：

將標(biāo)本或培養(yǎng)物劃線接種在固體培養(yǎng)基的表面，因劃線的分散作用，使許多原混雜的細(xì)菌在固體培養(yǎng)基表面上散開。菌落：在固體培養(yǎng)基上，單個(gè)細(xì)菌分裂繁殖成一堆肉眼可見的細(xì)菌集團(tuán)。用途：細(xì)菌分離、純化、鑒定、藥敏試驗(yàn)等類型：平板、試管斜面、高層菌落（R型）菌落（S型）菌苔半固體培養(yǎng)基中生長(zhǎng)情況

有鞭毛細(xì)菌：

擴(kuò)散生長(zhǎng)，周圍渾濁無鞭毛細(xì)菌：

沿穿刺線生長(zhǎng)，周圍透明細(xì)菌人工培養(yǎng)的意義在醫(yī)學(xué)中的應(yīng)用：①診斷和治療；②細(xì)菌鑒定和研究；③生物制品。在工農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中的應(yīng)用：發(fā)酵等在基因工程中的應(yīng)用：外源DNA的重組細(xì)菌的染色常用的細(xì)菌染色法單染色法：只用一種染料使菌體著色，如美藍(lán)染色復(fù)染色法：用兩種或兩種以上的染料染色，可使不同菌體呈現(xiàn)不同顏色，故又稱為鑒別染色法，如革蘭氏染色法、抗酸染色法等。

特殊染色法：細(xì)菌的莢膜、鞭毛、芽孢用普通染色法均不易著色。普通染色時(shí)，芽孢呈“空泡”狀，

莢膜呈“透明圈”，

鞭毛則必須用特殊染色法才能觀察到。美藍(lán)染色原理

美藍(lán)是常用的活體染色染料,當(dāng)它處于氧化狀態(tài)是呈現(xiàn)出藍(lán)色,而還原態(tài)時(shí)為無色。用它進(jìn)行活體染色時(shí),由于活細(xì)胞代謝過程中的脫氫作用,美藍(lán)接受氫離子后就由氧化轉(zhuǎn)變?yōu)檫€原態(tài),故表現(xiàn)出無色;而衰老的細(xì)胞由于代謝緩慢或停止,不能使美藍(lán)還原,所以呈藍(lán)色或者淡藍(lán)色。美藍(lán)染色涂片干燥固定滴加美藍(lán)染色液吸干鏡檢革蘭氏染色原理通過結(jié)晶紫初染和碘液媒染后，在細(xì)胞壁內(nèi)形成了不溶于水的結(jié)晶紫與碘的復(fù)合物，革蘭氏陽性菌由于其細(xì)胞壁較厚、肽聚糖網(wǎng)層次較多且交聯(lián)致密，并且其包含的類脂少或不包含。故遇乙醇或丙酮脫色處理時(shí)，因失水反而使網(wǎng)孔縮小，不出現(xiàn)縫隙，因此能把結(jié)晶紫與碘復(fù)合物牢牢留在壁內(nèi)，使其仍呈紫色；而革蘭氏陰性菌因其細(xì)胞壁薄、外膜層類脂含量高、肽聚糖層薄且交聯(lián)度差，在遇脫色劑后，以類脂為主的外膜迅速溶解，薄而松散的肽聚糖網(wǎng)不能阻擋結(jié)晶紫與碘復(fù)合物的溶出，因此通過乙醇脫色后仍呈無色，再經(jīng)沙黃等紅色染料復(fù)染，就使革蘭氏陰性菌呈紅色。革蘭氏染色葡大腸桿菌草酸銨結(jié)晶紫革蘭氏碘液95%乙醇石炭酸復(fù)紅水洗鏡檢G-菌紅色

G+菌藍(lán)紫色染色注意事項(xiàng)1.涂片過程中，去生理鹽水和細(xì)菌不宜過多，涂菌要均勻，不宜過厚。2.固定時(shí)溫度不可過高，以載玻片背面不燙手背為宜，因?yàn)闇囟冗^高會(huì)破壞細(xì)胞的形態(tài)。3.水洗時(shí)，不應(yīng)直接沖洗細(xì)菌涂面，水流不應(yīng)過大、過急，以免細(xì)菌涂面被沖掉。特殊染色法普通染色鞭毛不著色芽孢染色莢膜染色菌毛染色細(xì)菌培養(yǎng)結(jié)果的觀察液體培養(yǎng)基中生長(zhǎng)現(xiàn)象

混濁：大多數(shù)細(xì)菌

沉淀：鏈狀生長(zhǎng)的細(xì)菌

菌膜：專性需氧菌，如結(jié)核桿菌、枯草桿菌菌膜沉淀渾濁對(duì)照液體培養(yǎng)基沉淀生長(zhǎng)混濁生長(zhǎng)菌膜生長(zhǎng)固體培養(yǎng)基中生長(zhǎng)情況分離培養(yǎng)

將標(biāo)本或培養(yǎng)物劃線接種在固體培養(yǎng)基的表面，因劃線的分散作用，使許多原混雜的細(xì)菌在固體培養(yǎng)基表面上散開。用途：

細(xì)菌分離、純化、鑒定、藥敏試驗(yàn)等類型：

平板、試管斜面、高層菌落（R型）菌落（S型）菌苔菌落：在固體培養(yǎng)基上，單個(gè)細(xì)菌分裂繁殖成一堆肉眼可見的細(xì)菌集團(tuán)。半固體培養(yǎng)基中生長(zhǎng)情況

有鞭毛細(xì)菌：

擴(kuò)散生長(zhǎng)，周圍渾濁無鞭毛細(xì)菌：

沿穿刺線生長(zhǎng)，周圍透明空白對(duì)照無鞭毛有鞭毛動(dòng)物微生物顯微鏡油鏡的使用及細(xì)菌形態(tài)結(jié)構(gòu)的觀察實(shí)驗(yàn)?zāi)康恼莆绽蔑@微鏡油鏡觀察細(xì)菌形態(tài)結(jié)構(gòu)的技能學(xué)會(huì)顯微鏡的日常保養(yǎng)了解顯微鏡的結(jié)構(gòu)和油鏡的使用原理顯微鏡的基本結(jié)構(gòu)（目間距調(diào)節(jié)）（鏡臂）（粗調(diào)節(jié)器）（細(xì)調(diào)節(jié)器）（載物臺(tái)調(diào)節(jié)器）（鏡體）（物鏡轉(zhuǎn)換器）（聚光器）（載物臺(tái)）（物鏡）（孔徑光欄；彩虹光圈）（鏡座）（視野光欄）（光照強(qiáng)度調(diào)節(jié)）（目鏡）油鏡的使用原理普通光學(xué)顯微鏡的物鏡通常有低倍物鏡（10×），高倍物鏡（40×），和油鏡（100×）三種。油鏡的識(shí)別：油鏡是三者中放大倍數(shù)最大的，因使用時(shí)必須浸于香柏油內(nèi)，故稱油鏡。油鏡與其他物鏡有以下區(qū)別：（1）油鏡一般是所有物鏡中最長(zhǎng)的；（2）油鏡頭上標(biāo)有其放大倍數(shù)“100×”；（3）不同廠家生產(chǎn)的顯微鏡，常在不同鏡頭上標(biāo)有不同顏色的線圈以示區(qū)別，