動物疾病的實(shí)驗(yàn)室診斷-分子生物學(xué)診斷技術(shù)（動物微生物與免疫）

分子生物學(xué)診斷病料的采集與處理1.實(shí)驗(yàn)室診斷的作用與意義實(shí)驗(yàn)室診斷重要標(biāo)志基本保障動物疫病關(guān)系動物監(jiān)測凈化措施2.分子生物學(xué)診斷病料采集與處理組織樣品取材方法急性死亡時，排除炭疽感染等烈性傳染病后方可解剖；剖檢時注意人員防護(hù)，樣品信息登記；采樣順序：棉拭子--血液--分泌物--排泄物--體液--實(shí)質(zhì)性器官--其他組織。注意事項：采樣時嚴(yán)格無菌操作流程，在患畜死亡后，應(yīng)盡快采集，不要超過6h，活體取樣時，應(yīng)先放血再采集；組織樣品取材時要注意：應(yīng)新鮮，不能冷凍，取材部位應(yīng)是主要病變區(qū)；應(yīng)為病灶與正常組織交界區(qū)；所取組織塊不要太大，厚度不要超過1.5cm，最好要有切面；取材過程中要盡量避免人為擠壓造成的損傷；作病原學(xué)和病理學(xué)診斷時，盡可能采集與疫病相關(guān)的組織、分泌物、排泄物、體液、血樣，血液采集盡可能采集發(fā)燒中后期和康復(fù)后的血樣，提高疫病的診斷率。樣品的運(yùn)送（1）低溫快速運(yùn)送

≤24h，4℃運(yùn)送；＞24h，不影響檢驗(yàn)結(jié)果下，冷凍運(yùn)送；甲醛固定時，需在常溫條件下充分固定，不能冷凍，以防止組織形態(tài)改變。

（2）密封運(yùn)送

封口膜防止離心管內(nèi)液體和螺口容器包裝，防止內(nèi)容物泄露，組織樣品可置于自封塑料袋中。如需寄送，裝箱時要墊上足夠的緩沖材料。

樣品的處理樣品預(yù)處理

樣品的處理DNA提取RNA提取(Trizol)謝謝！分子生物學(xué)診斷關(guān)鍵儀器的作用利用PCR(Polymerasechainreaction，聚合酶鏈反應(yīng))技術(shù)對特定DNA擴(kuò)增的一種儀器設(shè)備，被廣泛運(yùn)用于醫(yī)學(xué)、生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室中。PCR擴(kuò)增儀一次PCR擴(kuò)增只能運(yùn)行一個特定退火溫度的PCR儀。主要用于做簡單的、對目的基因退火溫度的擴(kuò)增。普通PCR儀一次PCR擴(kuò)增可以設(shè)置一系列不同的退火溫度條件的PCR儀。主要用于研究未知DNA退火溫度的擴(kuò)增。梯度PCR儀

在普通PCR儀基礎(chǔ)上增加熒光信號激發(fā)、采集系統(tǒng)和計算機(jī)分析處理系統(tǒng)，形成了具有熒光棟梁PCR功能的儀器，擴(kuò)增結(jié)果通過熒光信號采集系統(tǒng)實(shí)時采集信號并連接輸送到計算機(jī)分析處理系統(tǒng)，得出量化的實(shí)時結(jié)果輸出。實(shí)時熒光定量PCR儀功能：主要用于病原體檢測、基因檢測、產(chǎn)前診斷等。優(yōu)點(diǎn)：靈敏度高、取樣少、快速簡便等。生物安全柜能防止實(shí)驗(yàn)操作處理過程中某些含有危險性或未知性生物微粒發(fā)生氣溶膠散逸的箱型空氣凈化負(fù)壓安全裝置。對未知樣品進(jìn)行處理、檢測進(jìn)行具有一定危險性的試驗(yàn)低溫高速離心機(jī)主要作用DNA、RNA提取離心RNA反轉(zhuǎn)錄等實(shí)驗(yàn)中溫度范圍：-20℃--40℃最高轉(zhuǎn)速：20500r/min核酸電泳儀凝膠成像儀主要用于PCR結(jié)果分析分離不同分子量的核酸片段凝膠圖像分析

謝謝??！分子生物學(xué)檢測概述

指應(yīng)用分子生物學(xué)方法檢測患者體內(nèi)遺傳物質(zhì)的結(jié)構(gòu)或表達(dá)水平的變化而做出診斷的技術(shù)。分子診斷是預(yù)測診斷的主要方法，既可以進(jìn)行個體遺傳病的診斷，也可以進(jìn)行產(chǎn)前診斷。分子診斷主要是指編碼與疾病相關(guān)的各種結(jié)構(gòu)蛋白、酶、抗原抗體、免疫活性分子基因的檢測。PCR核酸技術(shù)是一種體外DNA擴(kuò)增技術(shù)，是在模板DNA、引物和4種脫氧核苷酸存在的條件下，依賴于DNA聚合酶的酶促合反應(yīng)，將待擴(kuò)增的DNA片段與其兩側(cè)互補(bǔ)的寡核苷酸鏈引物經(jīng)“高溫變性——低溫退火——引物延伸”三步反應(yīng)的多次循環(huán)，使DNA片段在數(shù)量上呈指數(shù)增加，從而在短時間內(nèi)獲得我們所需的大量的特定基因片段。種類PCR技術(shù)自1985年發(fā)明以來,各種各樣以PCR為基礎(chǔ)的DNA序列的擴(kuò)增和檢測方法得到了迅猛發(fā)展。各種衍生技術(shù)如反轉(zhuǎn)錄PCR(RTR)、多重PCR、巢式PCR、PCR單鏈構(gòu)象多態(tài)性(PCRSSCP)、限制性片段長度多態(tài)性（RFLP）、隨機(jī)擴(kuò)增的多態(tài)性DNA技術(shù)(RAPD)和重復(fù)序列PCR技術(shù)(Rep-PCR)、熒光定量PCR等。其中定量PCR既可以用于臨床感染性疾病的診斷,又可用于監(jiān)測其療效，PCR及其衍生的技術(shù)近年來在病原微生物分型研究上得到了廣泛應(yīng)用。免疫PCR基本原理是用一段已知DNA分子標(biāo)記抗體作為探針,用此探針與待測抗原反應(yīng),用PCR擴(kuò)增粘附在抗原抗體復(fù)合物上的這段DNA分子,電泳定性,根據(jù)特異性PCR產(chǎn)物的有無,來判斷待測抗原是否存在。核酸分子雜交技術(shù)

具有一定互補(bǔ)序列的核苷酸單鏈在液相或固相中按堿基互補(bǔ)配對原則締合成異質(zhì)雙鏈的過程叫核酸分子雜交。具有一定同源性的原條核酸單鏈在一定的條件下（適宜的溫室度及離子強(qiáng)度等）可按堿基互補(bǔ)原成雙鏈。雜交的雙方是待測核酸序列及探針（probe）,待測核酸序列可以是克隆的基因征段，也可以是未克隆化的基因組DNA和細(xì)胞總RNA。特點(diǎn)（1）靈敏度高、特異性強(qiáng)；（2）用于DNA-DNA和RNA-RNA的定性、定量檢測。（1）檢測特異DNADNA序列（2）特異基因克隆的篩選；（3）核酸序列的初略分析；（4）PCR技術(shù)的分子基礎(chǔ)。應(yīng)用種類（1）Northern

印跡雜交；（2）Southern印跡雜交。