利用腸黏膜基因組差異表達(dá)研制抗應(yīng)激添加劑演示文稿

利用腸黏膜基因組差異表達(dá)研制抗應(yīng)激添加劑演示文稿當(dāng)前第1頁(yè)\共有48頁(yè)\編于星期三\0點(diǎn)利用腸黏膜基因組差異表達(dá)研制抗應(yīng)激添加劑當(dāng)前第2頁(yè)\共有48頁(yè)\編于星期三\0點(diǎn)匯報(bào)提綱研究背景、目的

研究技術(shù)路線與方法結(jié)果與分析

結(jié)論

有待進(jìn)一步研究的問(wèn)題當(dāng)前第3頁(yè)\共有48頁(yè)\編于星期三\0點(diǎn)一、研究背景及目的應(yīng)激夏季高溫對(duì)養(yǎng)豬生產(chǎn)的影響高溫與胃腸道損傷修復(fù)基因芯片在豬熱應(yīng)激中的應(yīng)用當(dāng)前第4頁(yè)\共有48頁(yè)\編于星期三\0點(diǎn)應(yīng)激的種類飼管因素運(yùn)輸因素

環(huán)境因素

防治因素

中毒因素

心理因素

其他因素

隨著全球性氣候變暖，高溫成為對(duì)家畜作用最廣泛和不可避免的應(yīng)激因素。人工氣候室高溫模型符合試驗(yàn)因子單一化研究應(yīng)激機(jī)制。當(dāng)前第5頁(yè)\共有48頁(yè)\編于星期三\0點(diǎn)熱應(yīng)激環(huán)境溫度超過(guò)豬的等熱區(qū)上限，豬體溫超過(guò)39.5℃，產(chǎn)熱大于散熱。免疫機(jī)能生產(chǎn)性能經(jīng)濟(jì)損失生理指標(biāo)行為改變胃腸道損傷當(dāng)前第6頁(yè)\共有48頁(yè)\編于星期三\0點(diǎn)應(yīng)激與應(yīng)激性潰瘍應(yīng)激性潰瘍：應(yīng)激中機(jī)體為了保護(hù)心、腦等重要器官，全身血液重新分配，胃腸道血流量明顯減少。導(dǎo)致小腸黏膜急性損傷，因此，腸道是應(yīng)激反應(yīng)的中心器官。當(dāng)前第7頁(yè)\共有48頁(yè)\編于星期三\0點(diǎn)高溫與腸黏膜屏障的損傷修復(fù)小腸黏膜屏障結(jié)構(gòu)的完整性免疫功能——第一道防御屏障生產(chǎn)性能——營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)吸收利用當(dāng)前第8頁(yè)\共有48頁(yè)\編于星期三\0點(diǎn)基因芯片在豬熱應(yīng)激中的運(yùn)用基因芯片（基因微陣列）cDNAmicroarrayAffymetrixGeneChip?PorcineGenomeArray，包含23,937個(gè)探針組，代表20,201個(gè)基因。應(yīng)用豬全基因組已知核酸序列作為探針與互補(bǔ)的靶核苷酸序列雜交，對(duì)23937個(gè)探針以及雜交信號(hào)進(jìn)行靈敏、準(zhǔn)確的檢測(cè)分析，實(shí)時(shí)同步高通量評(píng)價(jià)豬的熱應(yīng)激反應(yīng)。當(dāng)前第9頁(yè)\共有48頁(yè)\編于星期三\0點(diǎn)實(shí)時(shí)同步高通量評(píng)價(jià)豬的熱應(yīng)激基因芯片熱應(yīng)激從豬熱應(yīng)激及中藥兩個(gè)角度對(duì)多參數(shù)實(shí)時(shí)同步分析，探討熱應(yīng)激機(jī)制并發(fā)掘藥物靶點(diǎn)，為多層次評(píng)價(jià)中藥作用提供工具。改善環(huán)境營(yíng)養(yǎng)調(diào)控抗熱應(yīng)激藥物（中藥添加劑）中藥當(dāng)前第10頁(yè)\共有48頁(yè)\編于星期三\0點(diǎn)研究目的、意義通過(guò)豬在人工氣候室連續(xù)10天26-40℃的循環(huán)變溫刺激，從小腸黏膜形態(tài)學(xué)、與損傷修復(fù)相關(guān)的EGF/EGFR等生長(zhǎng)因子與mRNA水平以及信號(hào)通道等方面探討高溫對(duì)豬小腸黏膜結(jié)構(gòu)損傷的影響及中藥調(diào)控機(jī)制，為開(kāi)發(fā)抗熱應(yīng)激中藥添加劑以及小腸損傷修復(fù)劑奠定基礎(chǔ)。當(dāng)前第11頁(yè)\共有48頁(yè)\編于星期三\0點(diǎn)二、技術(shù)路線和方法實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：48頭2月齡、體重7.15±0.61kg的中國(guó)實(shí)驗(yàn)用小型豬（CEMP,農(nóng)大I系）。

人工氣候室：中國(guó)農(nóng)科院畜牧獸醫(yī)研究所動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)國(guó)家重點(diǎn)開(kāi)放實(shí)驗(yàn)室。石香顆粒：功效為防治高溫引起的機(jī)體免疫力下降及生產(chǎn)性能下降。其中鹽酸小檗堿含量1.0mg/g。用法：飲水；用量：0.15g/kg·bw。連用10天。

主要藥味包括蒼術(shù)(RhizomaAtractylodis)、藿香(HerbaAgastachis)、黃柏(CortexPhellodendri)、石膏(GypsumFibrosum)等。當(dāng)前第12頁(yè)\共有48頁(yè)\編于星期三\0點(diǎn)退熱及中樞鎮(zhèn)痛作用增強(qiáng)巨噬細(xì)胞吞噬功能增強(qiáng)細(xì)胞和體液免疫功能抗菌、鎮(zhèn)痛、解熱作用促進(jìn)胃液分泌，解除胃腸痙攣燥濕健脾。用于脘腹脹滿，泄瀉，水腫.調(diào)節(jié)胃腸運(yùn)動(dòng)，調(diào)節(jié)黏膜免疫抗病原微生物、抗?jié)冏饔谩⒖咕?、清熱燥濕免疫調(diào)節(jié)作用蒼術(shù)藿香黃柏石膏石香顆粒當(dāng)前第13頁(yè)\共有48頁(yè)\編于星期三\0點(diǎn)技術(shù)路線21000，41000個(gè)基因豬熱應(yīng)激模型大鼠熱應(yīng)激模型模型評(píng)價(jià)小腸形態(tài)結(jié)構(gòu)觀察基因芯片分析關(guān)鍵的調(diào)節(jié)因子相關(guān)性分析IEC-6細(xì)胞熱應(yīng)激模型細(xì)胞形態(tài)、活力、凋亡生長(zhǎng)因子表達(dá)變化ERK1/2信號(hào)通路的變化相關(guān)性分析10個(gè)生長(zhǎng)因子和ERK1/2信號(hào)通路當(dāng)前第14頁(yè)\共有48頁(yè)\編于星期三\0點(diǎn)技術(shù)路線小腸形態(tài)學(xué)觀察高溫組體內(nèi)體外生產(chǎn)性能生理指標(biāo)腸上皮細(xì)胞組織學(xué)觀察IEC-6形態(tài)學(xué)觀察ERK1/ERK2細(xì)胞活力/細(xì)胞周期中藥組對(duì)照組損傷指標(biāo)觀察臨床觀察基因芯片評(píng)價(jià)生長(zhǎng)因子mRNA信號(hào)通道Pathway分類EST分析功能分析（GO分類）高通量快速篩選平臺(tái)當(dāng)前第15頁(yè)\共有48頁(yè)\編于星期三\0點(diǎn)三結(jié)果與分析NameAvg.TemperatureMin.TemperatureMaxTemperatureStandardDeviationEmissivityControl35.4°C27.4°C38.3°C0.740.95HeatStress37.4°C28.9°C39.5°C0.580.95（一）高溫模型及對(duì)豬小腸黏膜形態(tài)結(jié)構(gòu)的損傷及中藥的修復(fù)作用當(dāng)前第16頁(yè)\共有48頁(yè)\編于星期三\0點(diǎn)熱應(yīng)激前后豬肛溫變化熱應(yīng)激前后血清皮質(zhì)醇變化當(dāng)前第17頁(yè)\共有48頁(yè)\編于星期三\0點(diǎn)直腸溫度及平均日增重Table.Rectaltemperatureandaveragedailygain注：同行小寫字母相同者代表組間差異不顯著；不同者代表組間差異顯著(P<0.05)當(dāng)前第18頁(yè)\共有48頁(yè)\編于星期三\0點(diǎn)熱應(yīng)激豬小腸黏膜的形態(tài)學(xué)變化左列為對(duì)照組中列為高溫組右列為中藥組上行為十二指腸中行為空腸下行為回腸當(dāng)前第19頁(yè)\共有48頁(yè)\編于星期三\0點(diǎn)高溫對(duì)豬空腸上皮細(xì)胞結(jié)構(gòu)的影響A為對(duì)照組，B為高溫組；10000×電鏡顯示，小腸微絨毛變短；細(xì)胞核沒(méi)有明顯變化；線粒體、轉(zhuǎn)運(yùn)小泡及次級(jí)溶酶體數(shù)量增加。50000×電鏡顯示空腸上皮細(xì)胞內(nèi)線粒體數(shù)量增加，線粒體內(nèi)部脊突變短，腫脹，內(nèi)部已有空泡形成；次級(jí)溶酶體數(shù)量增加，從形態(tài)上顯示，膜包被的電子密度不同的多胞體結(jié)構(gòu)清晰可見(jiàn)；在沒(méi)有脫落的空腸上皮細(xì)胞間緊密連接以及細(xì)胞核沒(méi)有明顯變化。

50000×10000×當(dāng)前第20頁(yè)\共有48頁(yè)\編于星期三\0點(diǎn)熱應(yīng)激豬空腸組織基因表達(dá)譜變化對(duì)照組高溫組RNA提取反轉(zhuǎn)錄cDNAcRNA合成芯片雜交生物學(xué)分析芯片驗(yàn)證EST分析GOMAPPING分析PATHWAY分析中藥組驗(yàn)證（二）高溫對(duì)豬空腸黏膜基因差異表達(dá)的影響當(dāng)前第21頁(yè)\共有48頁(yè)\編于星期三\0點(diǎn)差異基因比較結(jié)果AffymetrixGeneChip?PorcineGenomeArray含有23,937條探針代表已知豬的20,201個(gè)基因。高溫組與對(duì)照組比較（差異倍數(shù)＞±2.0）基因基因數(shù)量比例%表達(dá)基因1632171.6%不表達(dá)基因630327.6%表達(dá)上調(diào)930.41%表達(dá)下調(diào)1100.49%臨界基因1860.8%當(dāng)前第22頁(yè)\共有48頁(yè)\編于星期三\0點(diǎn)差異基因的聚類分析當(dāng)前第23頁(yè)\共有48頁(yè)\編于星期三\0點(diǎn)差異基因列表探針號(hào)變化倍數(shù)基因庫(kù)編號(hào)基因名稱當(dāng)前第24頁(yè)\共有48頁(yè)\編于星期三\0點(diǎn)熒光定量PCR驗(yàn)證變化趨勢(shì)一致，芯片數(shù)據(jù)可靠當(dāng)前第25頁(yè)\共有48頁(yè)\編于星期三\0點(diǎn)差異基因GO分類圖細(xì)胞過(guò)程磷酸化過(guò)程細(xì)胞成分細(xì)胞蛋白結(jié)合發(fā)育刺激反應(yīng)調(diào)節(jié)生物進(jìn)程信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)激活蛋白復(fù)合物繁殖其它反應(yīng)激活細(xì)胞器細(xì)胞器成分胞外區(qū)GO名總數(shù)百分率GO分類：細(xì)胞成分，生物進(jìn)程，分子功能三大類。當(dāng)前第26頁(yè)\共有48頁(yè)\編于星期三\0點(diǎn)差異基因分子功能分析當(dāng)前第27頁(yè)\共有48頁(yè)\編于星期三\0點(diǎn)差異基因生物進(jìn)程分析當(dāng)前第28頁(yè)\共有48頁(yè)\編于星期三\0點(diǎn)細(xì)胞組分分析當(dāng)前第29頁(yè)\共有48頁(yè)\編于星期三\0點(diǎn)差異基因的Pathway分析當(dāng)前第30頁(yè)\共有48頁(yè)\編于星期三\0點(diǎn)主要的生長(zhǎng)因子Epidermalgrowthfactor(EGF)表皮生長(zhǎng)因子

Bonemorphogeneticproteins(BMPs)骨形成蛋白Erythropoietin(EPO)紅細(xì)胞生成素Fibroblastgrowthfactor(FGF)成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子Granulocyte-colonystimulatingfactor(G-CSF)粒系集落刺激因子Growthdifferentiationfactor-9(GDF9)生長(zhǎng)分化因子-9Hepatocytegrowthfactor(HGF)肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子Insulin-likegrowthfactor(IGF)胰島素樣生長(zhǎng)因子Growthdifferentiationfactor-15(GDF-15)生長(zhǎng)分化因子-15Nervegrowthfactor(NGF)神經(jīng)生長(zhǎng)因子Platelet-derivedgrowthfactor(PDGF)血小板衍生生長(zhǎng)因子Vascularendothelialgrowthfactor(VEGF)血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子當(dāng)前第31頁(yè)\共有48頁(yè)\編于星期三\0點(diǎn)差異基因net圖當(dāng)前第32頁(yè)\共有48頁(yè)\編于星期三\0點(diǎn)（三）體外IEC-6熱應(yīng)激模型及高通量快速篩選抗應(yīng)激添加劑模型的建立及評(píng)價(jià)熱應(yīng)激和ERK1/2信號(hào)通路對(duì)大鼠IEC-6細(xì)胞生長(zhǎng)因子表達(dá)的影響熱應(yīng)激對(duì)大鼠空腸和IEC-6細(xì)胞ERK1/2蛋白的磷酸化水平的影響利用體外IEC-6熱應(yīng)激評(píng)價(jià)平臺(tái)和差異顯示生長(zhǎng)基因高通量篩選抗應(yīng)激中藥活性部分——蒼術(shù)、藿香揮發(fā)油

當(dāng)前第33頁(yè)\共有48頁(yè)\編于星期三\0點(diǎn)熱應(yīng)激對(duì)IEC-6細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)、增殖活力和凋亡的影響當(dāng)前第34頁(yè)\共有48頁(yè)\編于星期三\0點(diǎn)熱應(yīng)激和ERK1/2信號(hào)對(duì)大鼠IEC-6細(xì)胞生長(zhǎng)因子表達(dá)的影響當(dāng)前第35頁(yè)\共有48頁(yè)\編于星期三\0點(diǎn)大鼠空腸和IEC-6細(xì)胞ERK1/2的磷酸化水平當(dāng)前第36頁(yè)\共有48頁(yè)\編于星期三\0點(diǎn)高溫對(duì)IEC-6細(xì)胞活力、細(xì)胞增殖指數(shù)及

中藥有效部分的影響組別GroupsG0/1期細(xì)胞G0/1cell(%)G期細(xì)胞Gcell(%)S期細(xì)胞Scell(%)增殖指數(shù)PI(%)細(xì)胞活力(OD570)對(duì)照組CG74.2±3.1b6.9±2.6a18.8±3.9a25.8±3.1a0.757±0.010a高溫組HTG84.4±3.5a4.7±1.8b10.9±1.7c15.6±3.5c0.737±0.005b蒼術(shù)油組RHAAG77.7±1.4b6.0±1.2a16.2±2.5ab22.2±1.4a0.750±0.008a藿香油組HAAG80.1±0.8a6.4±2.2a13.5±1.5c19.9±0.8b0.754±0.005a注：同列小寫字母相同者代表組間差異不顯著；不同者代表組間差異顯著(P<0.05)當(dāng)前第37頁(yè)\共有48頁(yè)\編于星期三\0點(diǎn)IEC-6在高溫中EGF/EGFRmRNA的變化及中藥調(diào)控當(dāng)前第38頁(yè)\共有48頁(yè)\編于星期三\0點(diǎn)中藥對(duì)IEC-6在高溫中P-ERK1/ERK2的影響當(dāng)前第39頁(yè)\共有48頁(yè)\編于星期三\0點(diǎn)小結(jié)1、熱應(yīng)激導(dǎo)致大鼠IEC-6細(xì)胞形態(tài)損傷，降低細(xì)胞增殖活力，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。2、熱應(yīng)激誘導(dǎo)大鼠空腸和IEC-6細(xì)胞的ERK1/2信號(hào)蛋白磷酸化，并改變IEC-6細(xì)胞生長(zhǎng)因子的表達(dá)水平。3、抑制ERK1/2蛋白磷酸化后，熱應(yīng)激引起更為嚴(yán)重的細(xì)胞損傷，誘導(dǎo)更為嚴(yán)重的細(xì)胞凋亡。4、熱應(yīng)激時(shí)ERK1/2信號(hào)參與生長(zhǎng)因子表達(dá)的調(diào)節(jié)。5、體外細(xì)胞應(yīng)激模型可以作為高通量篩選中藥有效部分的平臺(tái)當(dāng)前第40頁(yè)\共有48頁(yè)\編于星期三\0點(diǎn)四.結(jié)論熱應(yīng)激豬26～40℃循環(huán)高溫模型成立。石香顆粒通過(guò)調(diào)節(jié)豬體溫，減少小腸上皮細(xì)胞、腸絨毛損傷，石香顆粒通過(guò)維護(hù)小腸黏膜屏障的完整性和營(yíng)養(yǎng)吸收功能，發(fā)揮抗熱應(yīng)激作用。熱應(yīng)激導(dǎo)致豬空腸基因表達(dá)差異。芯片HSPs、EGF、EGFR等生長(zhǎng)因子mRNA驗(yàn)證結(jié)果表明可靠。這些差異基因涉及機(jī)體內(nèi)分泌、免疫功能、細(xì)胞損傷和修復(fù)、細(xì)胞凋亡、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)等。當(dāng)前第41頁(yè)\共有48頁(yè)\編于星期三\0點(diǎn)Pathway分析預(yù)測(cè)花生四烯酸代謝途徑、淀粉和蔗糖代謝途徑、亞麻仁油酸代謝途徑、細(xì)胞色素P450代謝途徑和MAPK信號(hào)通路在熱應(yīng)激過(guò)程中發(fā)揮重要作用。豬小腸黏膜損傷修復(fù)的基因信號(hào)通道與EGF介導(dǎo)的細(xì)胞的損傷，修復(fù)相關(guān)。石香顆粒主要成分通過(guò)顯著促進(jìn)對(duì)EGFR的表達(dá)，啟動(dòng)基因轉(zhuǎn)錄，促進(jìn)細(xì)胞增殖，損傷的修復(fù)。當(dāng)前第42頁(yè)\共有48頁(yè)\編于星期三\0點(diǎn)五.有待進(jìn)一步研究的問(wèn)題高溫對(duì)豬空腸的基因差異表達(dá)基因?yàn)?03個(gè)；其中上調(diào)有的93個(gè)；下調(diào)的有110個(gè)。繼續(xù)進(jìn)行高溫對(duì)豬熱應(yīng)激影響機(jī)制的研究，開(kāi)發(fā)抗熱應(yīng)激和小腸黏膜損傷修復(fù)劑。當(dāng)前第43頁(yè)\共有48頁(yè)\編于星期三\0點(diǎn)當(dāng)前第44頁(yè)\共有48頁(yè)\編于星期三\0點(diǎn)當(dāng)前第45頁(yè)\共有48頁(yè)\編于星期三\0點(diǎn)與動(dòng)物熱應(yīng)激中腸黏膜屏障相關(guān)的SCI論文LiuFH,YinJD,DuM,YanPS,XuJQ,ZhuXY,YuJ.HeatStressinducedDamagetoPorcineSmallIntestinalEpitheliumassociatedwithDown-RegulationofEpithelialGrowthFactor(EGF)Signaling.JournalofAnimalScience.2009,6(87):1941-1949,IF2.466.YuJin,YinPeng,LiuFenghua..InvolvementofERK1/2signalingpathwayinheatstress-induceddamageandexpressionchangeofgrowthfactorsinratjejunumandIEC-6cells.International

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