攜綠色熒光蛋白和調(diào)控元件的人胰島素原基因在HepG2細(xì)胞的表達(dá)

攜綠色熒光蛋白和調(diào)控元件的人胰島素原基因在HepG2細(xì)胞的表達(dá)【摘要】目的研究含綠色熒光蛋白(GFP)和人胰島素原基因的逆轉(zhuǎn)錄病毒表達(dá)載體在HepG2細(xì)胞中的表達(dá)。方法將IRESEGFP片段克隆到含調(diào)控元件的人胰島素原基因逆轉(zhuǎn)錄病毒表達(dá)載體(pLXSNGIIns)中,構(gòu)建得到表達(dá)質(zhì)粒pLXSNGIInsEGFP,經(jīng)脂質(zhì)體介導(dǎo)轉(zhuǎn)染HepG2細(xì)胞后,各孔分別加入含有不同濃度葡萄糖的培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)24h,在熒光顯微鏡下觀(guān)察GFP基因的表達(dá),檢測(cè)細(xì)胞上清液中的胰島素值及考察細(xì)胞中胰島素mRNA的表達(dá)量。結(jié)果成功構(gòu)建逆轉(zhuǎn)錄病毒表達(dá)質(zhì)粒pLXSNGIInsEGFP。轉(zhuǎn)染HepG2細(xì)胞后48h,葡萄糖濃度為,,mmol/L,表達(dá)GFP基因的細(xì)胞數(shù)目占總細(xì)胞數(shù)目的比值分別為(±)%,(±)%,(±)%;胰島素分泌量分別為(±),(±),(±)mU/L,不同葡萄糖濃度誘導(dǎo)的胰島素mRNA表達(dá)量明顯不同。結(jié)論含GFP和調(diào)控元件的人胰島素原基因逆轉(zhuǎn)錄病毒表達(dá)載體能夠在HepG2細(xì)胞中成功表達(dá),并且GFP基因的表達(dá)量反映了人胰島素的分泌量。

【關(guān)鍵詞】綠色熒光蛋白質(zhì)類(lèi)胰島素逆轉(zhuǎn)錄病毒科轉(zhuǎn)染基因細(xì)胞培養(yǎng)遺傳載體

I型糖尿病(TIDM)是一種T細(xì)胞介導(dǎo)的,以選擇性易感人群胰島β細(xì)胞損害、胰島素分泌絕對(duì)減少為特征的自身免疫性疾病[1]。近年來(lái),I型糖尿病的基因治療成為醫(yī)學(xué)研究領(lǐng)域的熱點(diǎn)問(wèn)題之一,而基因治療的關(guān)鍵是在體細(xì)胞中建立受葡萄糖濃度調(diào)控的胰島素分泌功能,并且找到一種高效的基因轉(zhuǎn)移載體和途徑。研究表明可以通過(guò)報(bào)告基因的表達(dá)情況來(lái)間接反映目的基因的表達(dá)量[34]。目前綠色熒光蛋白基因已被廣泛用作原核細(xì)胞和真核細(xì)胞的報(bào)告基因,是活細(xì)胞的理想標(biāo)記活物。筆者利用亞克隆技術(shù)將綠色熒光蛋白基因(GFP)插入到重組載體中,建立通過(guò)報(bào)告基因檢驗(yàn)?zāi)康幕虮磉_(dá)的系統(tǒng),檢測(cè)該種細(xì)胞在不同葡萄糖濃度下其胰島素的分泌情況,確定報(bào)告基因GFP的表達(dá)和人胰島素分泌量之間的關(guān)系。

1材料和方法

材料

質(zhì)粒、菌株和細(xì)胞株質(zhì)粒pLXSNGIIns、PA317包裝細(xì)胞、NIH3T3由中國(guó)醫(yī)科大學(xué)吳志香教授饋贈(zèng);質(zhì)粒pIRESEGFP(美國(guó)Clontech公司);DH5α(日本TaKaRa公司);HepG2細(xì)胞(第四軍醫(yī)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心);胰島素檢測(cè)采用雙抗體酶聯(lián)免疫試劑盒(瑞典Mercodia公司)。

主要藥品和試劑限制性?xún)?nèi)切酶、T4連接酶、TaqDNApolymerase、DNAMarkerDL2000、λHi

ndⅢ(日本TaKaRa公司);G418(美國(guó)Sigma公司);LipofectamineTM2000轉(zhuǎn)染試劑(美國(guó)Invitrogen生物制品有限公司);質(zhì)粒提取試劑盒(美國(guó)Qiagen生物有限公司);TrizolReagent、逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(RTPCR)試劑盒(美國(guó)Invitrogen公司);DMEM(批號(hào)Cat*,美國(guó)Hyclone公司);小牛血清(批號(hào)ATC:9934,美國(guó)HyclonePierce公司);其他試劑均為分析純。

引物設(shè)計(jì)與合成根據(jù)胰島素序列設(shè)計(jì)引物P1和P2,擴(kuò)增長(zhǎng)度為198bp;根據(jù)人βactin設(shè)計(jì)引物P3和P4,擴(kuò)增長(zhǎng)度為206bp,序列如下:

P1:5′CAACACCTGTGCGGCTCAG3′

P2:5′TTCCACAATGCCACGCTTCT3′

P3:5′ATTGGCAATGAGCGGTTCCGC3′

P4:5′CTCCTGCTTGCTGATGCACATC3′

方法

重組質(zhì)粒pLXSNGIInsEGFP的構(gòu)建及篩選質(zhì)粒pIRESEGFP經(jīng)EcoRⅠ/XhoⅠ雙酶切、末端平滑化后,克隆入Tvector,得到pTIRESEGFP進(jìn)行序列測(cè)定。質(zhì)粒pTIRESEGFP和pLXSNGIIns分別經(jīng)BamHⅠ/HindⅢ雙酶切,回收目的片段,用T4連接酶在16℃連接過(guò)夜,連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化DH5α,在含Amp的LB平板上選擇培養(yǎng)后,挑取菌落,提取重組質(zhì)粒。將重組質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)染于HepG2細(xì)胞中,用無(wú)血清的DMEM50μL分別稀釋質(zhì)粒μg和脂質(zhì)體μg,將兩者混合后,于37℃放置15min使其形成LipofectaminTM2000復(fù)合物,使其與原有培養(yǎng)液混勻。將培養(yǎng)板置于37℃、體積分?jǐn)?shù)為的CO2條件下培養(yǎng)6h,分別加入,,mmol/L葡萄糖溶液,培養(yǎng)過(guò)夜,在倒置熒光顯微鏡下分別觀(guān)察GFP基因的表達(dá)情況,并篩選陽(yáng)性表達(dá)質(zhì)粒。

基因的表達(dá)和胰島素值的測(cè)定按文獻(xiàn)方法將陽(yáng)性質(zhì)粒pLXSNGIInsEGFP經(jīng)脂質(zhì)體包裹導(dǎo)入PA317包裝細(xì)胞,G418篩選后取其上清液轉(zhuǎn)染NIH3T3細(xì)胞計(jì)算上清液中質(zhì)粒濃度。用4×105濃度的培養(yǎng)上清液再經(jīng)脂質(zhì)體包裹后轉(zhuǎn)染HepG2細(xì)胞。轉(zhuǎn)染后24h,分別換用含,,mmol/L葡萄糖的DMEM,繼續(xù)培養(yǎng)24h。熒光顯微鏡下觀(guān)察發(fā)綠色熒光的細(xì)胞數(shù)量,計(jì)算其在全部細(xì)胞的百分比。取各孔培養(yǎng)上清液,化學(xué)發(fā)光法檢測(cè)胰島素水平。

胰島素mRNA水平表達(dá)按照RNA提取試劑盒說(shuō)明書(shū)提取細(xì)胞總RNA,采用TaqDNA聚合酶體系,以P1、P2引物擴(kuò)增胰島素基因,以P3、P4引物擴(kuò)增人βactin基因。用％瓊脂糖凝膠電泳鑒定。逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)條件:30℃10min→42℃20min→99℃5min→5℃5min。PCR反應(yīng)條件:94℃1min→(94℃30s→56℃30s→72℃30s)×29→72℃7min。

2結(jié)果

攜GFP和調(diào)控元件的人胰島素表達(dá)質(zhì)粒受葡萄糖調(diào)控的攜GFP和調(diào)控元件的人胰島素表達(dá)質(zhì)粒具體調(diào)控過(guò)程見(jiàn)圖1。

該胰島素調(diào)控系統(tǒng)分別受胰島素抑制、葡萄糖激活,二者協(xié)同作用下使胰島素的分泌量處于正常生理范圍內(nèi)。其中,IGFBP1P可被胰島素抑制性調(diào)控;GLRE3可被葡萄糖激活;IRES為ECMV病毒的內(nèi)部核糖體結(jié)合位點(diǎn)。

基因表達(dá)葡萄糖濃度分別為,,mmol/L時(shí),記數(shù)觀(guān)察到的呈綠色熒光的細(xì)胞數(shù)量,其占總細(xì)胞量的比例分別為(±)％,(±)％及(±)％,說(shuō)明構(gòu)建的GFP基因具有隨葡萄糖濃度的變化調(diào)節(jié)GFP蛋白表達(dá)的能力(圖2)。

胰島素值葡萄糖濃度分別為,,,mmol/L時(shí),瞬時(shí)胰島素分泌量分別為(±),(±),(±)及(±)mU/L，且隨葡萄糖濃度的增加，胰島素分泌的能力增強(qiáng)(圖3)。

對(duì)于不含葡萄糖的細(xì)胞,構(gòu)建質(zhì)粒pLXSNGIInsEGFP和原始質(zhì)粒(對(duì)照)的胰島素水平無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

胰島素mRNA的表達(dá)pLXSNGIInsEGFP基礎(chǔ)水平未檢測(cè)到mRNA,加入不同濃度葡萄

1:空白組(未加葡萄糖的空質(zhì)粒pLXSN組);2~5:質(zhì)粒LXSNGIInsEGFP組,葡萄糖濃度(mmol/L)分別為,,,與空白組比較,☆:,☆☆:

3討論

1型糖尿病的基因療法需要在患者的胰外組織建立呈生理模式調(diào)控的胰島素分泌,要實(shí)現(xiàn)這一理想療法,必須構(gòu)建能夠表達(dá)成熟的有生物活性的胰島素的表達(dá)載體,還要有相應(yīng)的調(diào)控元件使該重組胰島素基因的表達(dá)和調(diào)控受葡萄糖和胰島素的雙重控制,本課題組已經(jīng)完成該部分的構(gòu)建工作[68]。本實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)以ECMV病毒的內(nèi)部核糖體進(jìn)入位點(diǎn)(IRES)連接目的基因和報(bào)告基因,構(gòu)建雙順?lè)醋幽?/p>

轉(zhuǎn)錄病毒載體,在此載體中,上游單一的啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄

兩個(gè)基因至同一mRNA上,然后兩個(gè)基因以不同的方式翻譯合成蛋白質(zhì),上游的基因以真核細(xì)胞帽依賴(lài)方式翻譯合成蛋白質(zhì),下游基因以帽非依賴(lài)方式翻譯合成蛋白質(zhì),避免了在轉(zhuǎn)錄調(diào)控水平上對(duì)兩個(gè)基因表達(dá)的影響。

研究結(jié)果證實(shí),成功插入GFP基因到含有調(diào)控元件的人胰島素原基因逆轉(zhuǎn)錄病毒載體中,構(gòu)建的GFP基因和人胰島素基因兩者都具有隨培養(yǎng)液中葡萄糖的濃度變化調(diào)節(jié)自身表達(dá)的能力,并且兩者的變化趨勢(shì)一致。該葡萄糖濃度范圍與人或糖尿病動(dòng)物模型經(jīng)常測(cè)得結(jié)果一致,表明胰島素的分泌基本在生理范圍內(nèi)波動(dòng)。因此本研究成功建立了利用報(bào)告基因檢測(cè)目的基因表達(dá)的系統(tǒng),簡(jiǎn)化了檢測(cè)手段,為下一步動(dòng)物實(shí)驗(yàn)奠定理論和實(shí)踐基礎(chǔ)的同時(shí),也為基因治療糖尿病的安全性研究和臨床實(shí)驗(yàn)提供科學(xué)依據(jù)。

【參考文獻(xiàn)】

“[1“]CastanoL,EisenbarthGS.TypeIdiabetes:achronicautoimmunediseaseofhuman,mouseandrat“[J“].AnnuRevImmunol,1990,8:647679.

“[2“]GiannoukakisN,RobbinsPD.Geneandcelltherapiesfordiabetesmellitus:strategieaandclinicalpotential“[J“].GeneTher,2002,16(3):149173.

“[3“]張敬之,郭歆冰,謝書(shū)陽(yáng),等.用慢病毒載體介導(dǎo)產(chǎn)生綠色熒光蛋白(GFP)轉(zhuǎn)基因小鼠“[J“].自然科學(xué)進(jìn)展,2006,16(5):571577.

“[4“]賀永文,潘延鳳,王華,等.綠色熒光蛋白/PAPa融合表達(dá)載體的構(gòu)建及其在SMMC7721細(xì)胞中的表達(dá)“[J“].胃腸病學(xué)和肝病學(xué)雜志,2005,14(4):363365.

“[5“]袁鳳山,劉兆喆,吳志香,等.人胰島素原基因的包裝及增殖“[J“].中國(guó)醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào),2004,33(2):144146.

“[6“]DongH,MorralN,McEvoyR,etal.Hepaticinsulinexpressionimprovesglycemiccontrolintype1diabeticrats“[J“].DiabetesResClinPract,2001,52(3):153163.

“[7“]吳志香,邵敬偉,袁鳳山.胰島素樣生長(zhǎng)因子結(jié)合蛋白1啟動(dòng)子的克隆與序列分析“[J“].生物技術(shù)通訊,2005,16(6):624626.

“[8“]吳志香,邵敬偉,袁鳳山.含三倍體葡萄糖反應(yīng)元件的質(zhì)粒的構(gòu)建及序列分析“[J“].生物技術(shù)通訊,2005,16(6):627629.

“[9“]GhattasIR,San