DPPH和ABTS、PTIO自由基清除實驗-操作圖解-李熙燦-Xican-Li

ADDINCNKISM.UserStyleDPPH?和ABTS+?自由基清除實驗（含PTIO?自由基清除實驗)：詳細說明與疑難解答李熙燦（廣州中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院,2019.7）（以下內(nèi)容系來源于實驗經(jīng)驗及三個參考文獻[1]Li,X.,ComparativeStudyof1,1-Diphenyl-2-picryl-hydrazylRadical(DPPH?)ScavengingCapacityoftheAntioxidantXanthonesFamily.Chemistryselect,2018.3,13081-13086.[2]Li,X.;Ouyang,X.;Cai,R.;Chen,D.3’,8”-DimerizationEnhancestheAntioxidantCapacityofFlavonoids:EvidencefromAcacetinandIsoginkgetin.2019,Molecules.24,2039.[3]Li,X.C.,2-Phenyl-4,4,5,5-tetramethylimidazoline-1-oxyl3-Oxide(PTIO?)RadicalScavenging:ANewandSimpleAntioxidantAssayInVitro.J.Agric.FoodChem.,2017.65,6288-6297【概述】DPPH?、ABTS+?、PTIO?自由基三者，都是常用的自由基。概述如下表：DPPH?自由基ABTS+?自由基PTIO?自由基結(jié)構(gòu)式簡單表達式DPPH·ABTS·+PTIO·分子式與分子量C18H12N5O6;M.W.394.3C18H24N6O6S;M.W.548.68C13H17N2O2;M.W.233.3帶電情況中性自由基陽離子自由基中性自由基種類氮自由基（成單電子在N原子上）氮自由基（成單電子在N原子上）氧自由基（成單電子在O原子上）外觀紫黑色粉末沒有純的ABTS·+紫褐色粉末溶解性與溶液顏色溶于有機溶劑（如甲醇、乙醇）溶液呈紫色，濃度越高，顏色越深溶于有機溶劑（如甲醇、乙醇）、水以及水性的緩沖液溶液呈墨綠色，濃度越高，顏色越深溶于水以及水性的緩沖液溶液呈藍紫色，濃度越高，顏色越深CAS號1898-66-4無18390-00-6工作液配制方法將已購的DPPH自由基粉末，溶解即得其工作液將已購的ABTS二銨鹽[(NH4)2ABTS]與過二硫酸鉀(K2S2O8)黑暗中反應(yīng)12小時后，再稀釋得其工作液。將已購的PTIO自由基粉末，溶解即得其工作液工作液外觀紫色墨綠色藍紫色工作液紫外光譜與最大吸收(50μg/mL)（0.07mM(NH4)2ABTS+0.03mMK2S2O8）(50μg/mL)檢測波長519nm734nm557nm（水溶液）檢測原理當A519nm值減少，表明DPPH·被清除。其清除機制主要是氫轉(zhuǎn)移HAT(hydrogenatomtransfer)當A734nm值減少，表明ABTS·+被清除。其清除機制主要是電子轉(zhuǎn)移ET(electrontransfer)當A557減少，表明ABTS·+被清除。其清除機制主要是電子移ET(electrontransfer)加質(zhì)子轉(zhuǎn)移PT(protontransfer)用途主要用于測試一個純的化合物或者提取物，是否具有抗氧化活性或者活性的強弱。主要用于測試一個純的化合物或者提取物，是否具有抗氧化活性或者活性的強弱。主要用于測試一個純的化合物或者提取物，是否具有抗氧化活性或者活性的強弱。通過調(diào)節(jié)緩沖液的pH值，可以檢測其抗氧化機制。優(yōu)勢清除速度較快，約30分鐘（室溫下）。清除速度較快，約6分鐘（室溫下）。（1）水溶性好，與生物相關(guān)性強；（2）是氧自由基，能更好地表往ROS清除水平；（3）抗氧化機制明確：pH值小于5.0時，為電子轉(zhuǎn)移ET機制。當調(diào)節(jié)pH值（如pH=5.0，6.0，7.4）時，其清除能力也隨之改變，表明與pH值有關(guān)，也就是說與氫離子（質(zhì)子）濃度有關(guān)，據(jù)此，可證明其涉及PT機制。局限性（1）只能在有機溶劑（如甲醇、乙醇）中進行，不能在水溶液中進行；也不能在緩沖液中進行。（2）其抗氧化活性，實際上是清除氮自由基的活性（而不是氧自由基）。（3）雖然DPPH的清除主要是HAT抽制，但是在不同溶劑中，其抗氧化機制是不同的，還可能有ET等。（1）不能在緩沖液中進行。當然，可以在有機溶劑（如甲醇、乙醇）和水溶液中進行。（2）其抗氧化活性，實際上是清除氮自由基的活性（而不是氧自由基）。（3）配制工作液需要的時間長（約12小時）（4）ABTS·+與(NH4)2ABTS、K2S2O8共存于溶液中，無法單獨分離。所以，會導(dǎo)致無法預(yù)期的干擾。清除反應(yīng)速度較慢，約2小時完成。不過，如果出現(xiàn)這種情況，可以適當加熱（如37℃、50℃），或延長反應(yīng)時間。所需儀器可見分光光度計（常量，檢測液約3mL）酶標儀（微量，檢測液約200μL）可見分光光度計（常量，檢測液約3mL）酶標儀（微量，檢測液約200μL）可見分光光度計（常量，檢測液約3mL）酶標儀（微量，檢測液約200μL）

【實驗講解】DPPH?自由基清除實驗ADDINEN.CITE<EndNote><Cite><Author>Li</Author><Year>2018</Year><RecNum>915</RecNum><DisplayText>[1]</DisplayText><record><rec-number>915</rec-number><foreign-keys><keyapp="EN"db-id="rfxsxdxam5epp5e50fbvz2ryvf2tdzrw55xa"timestamp="1561084712">915</key></foreign-keys><ref-typename="JournalArticle">17</ref-type><contributors><authors><author>Li,Xican</author></authors></contributors><titles><title>ComparativeStudyof1,1-Diphenyl-2-picryl-hydrazylRadical(DPPHcenterdot)ScavengingCapacityoftheAntioxidantXanthonesFamily</title><secondary-title>Chemistryselect</secondary-title></titles><periodical><full-title>Chemistryselect</full-title></periodical><pages>13081-13086</pages><volume>3</volume><number>46</number><dates><year>2018</year><pub-dates><date>Dec13</date></pub-dates></dates><isbn>2365-6549</isbn><accession-num>WOS:000453576900015</accession-num><urls><related-urls><url><GotoISI>://WOS:000453576900015</url></related-urls></urls><electronic-resource-num>10.1002/slct.201803362</electronic-resource-num></record></Cite></EndNote>[1]1.1DPPH測試液的配置取DPPH固體1mg溶于24mL95乙醇（或無水乙醇、甲醇）中，超聲5min，充分振搖，務(wù)使上下各部分均勻。最好避光保存，5小時內(nèi)用完。取1mL上述步驟配置好的DPPH溶液，加0.5mL95乙醇（或無水乙醇、甲醇）稀釋后，使其吸光度為0.6-1.0之間。若吸光度過大，則繼續(xù)加溶劑；若吸光度過小，則補加DPPH固體或者原始溶液。1.2樣品液的配置樣品用合適的溶劑溶解，為便于計算，可配成1mg/mL濃度。溶劑根據(jù)樣品的極性進行選擇，首選甲醇、95乙醇或無水乙醇（盡量與DPPH溶液所用溶劑相同），如不溶可用DMSO。1.3預(yù)試取DPPH溶液1.0mL，加0.5mL相應(yīng)有機溶劑后，往其中加少量樣品液。加樣時，先少后多漸加，邊加邊混合，并觀察溶液的褪色情況，當溶液顏色基本褪去時，記下樣品的加樣量。如果反應(yīng)緩慢可在37℃烘箱中放置半個小時。此加樣量即為樣品的最大用量，在此最大用量的基礎(chǔ)上，往前設(shè)置5個用量，使之成等差數(shù)列?！救纭吭陬A(yù)試過程中，發(fā)現(xiàn)加樣到500μL時，DPPH溶液顏色基本褪去，則500μL為該樣品液的最大用量。則對于該樣品而言，其用量梯度宜設(shè)為100μL、200μL、300μL、400μL、500μL。A0值：取DPPH溶液1.0mL到比色皿中，加對應(yīng)有機溶劑0.5mL，稀釋混合，測A值，此A值為A0（A0須在0.8-1.0之間）。A值：?。?00-x）μL有機溶劑到比色皿中，加樣品液xμL（x是根據(jù)1.3預(yù)試結(jié)果確定樣品液的用量），再加DPPH溶液1.0mL，混合使反應(yīng)液總體積為1.5mL。測A值?！救纭磕硺悠返挠昧刻荻葹?00μL、200μL、300μL、400μL、500μL，則加樣如下：樣品液95乙醇（或無水乙醇）DPPH測試液總體積0μL100μL500μL400μL1.0mL1.0mL1.5mL1.5mL200μL300μL1.0mL1.5mL300μL200μL1.0mL1.5mL400μL100μL1.0mL1.5mL500μL0μL1.0mL1.5mL1.4最終測量每測一個用量需要測三個平行數(shù)據(jù)。1.5DPPH?清除率（抑制率）的計算(A0為不加樣品時的值；A為加入樣品后的值。)使用注意事項測量前，要先用空白溶劑調(diào)零。將溶液注入比色皿后應(yīng)當充分搖勻，使顏色均勻分布。每次使用前后要注意比色皿的清潔。如果在實驗過程中出現(xiàn)A值大于A0的情況，則可能是由于樣品本身產(chǎn)生的本底吸收所致，此時，應(yīng)該減去本底吸收的A值(A本)。這個A本值可以通過，加樣品但不加DPPH的方法測得。此時的計算公式為：疑難解答問：DPPH實驗測量抗氧化性的原理是什么？答：DPPH法于1958年被提出，廣泛用于定量測定生物試樣、分類藥物和食品的抗氧化能力。此法是根據(jù)DPPH自由基有單電子，在519nm處有一強吸收，其醇溶液呈紫色的特性。當有抗氧化劑存在時，DPPH自由基被清除，溶液顏色減淡，其褪色程度與其被清除程度（即吸光度的改變）成定量關(guān)系，因而可用分光光度計或酶標儀進行快速的定量分析。問：DPPH自由基被清除的機制是什么？答：DPPH自由基的清除過程主要涉及到氫轉(zhuǎn)移（HAT），簡要過程如下（以1,3,5,8-四羥基氧雜蒽酮為例）：問：實驗中的溶劑應(yīng)該怎么確定？答：優(yōu)先選用甲醇、95乙醇或無水乙醇溶解DPPH固體和樣品，若樣品難溶于水和醇，再考慮DMSO等溶劑。值得注意的是，實驗中應(yīng)該盡量保證樣品溶液和DPPH溶液使用相同的溶劑。另兩個實驗（ABTS+?清除和PTIO?清除）同理。問：樣品的濃度一定要設(shè)置成1mg/mL嗎？答：不同樣品清除DPPH自由基的活性可能相差很大，為了保證結(jié)果的準確，應(yīng)該盡量使樣品的五個濃度點對DPPH?清除率均勻分布在0-100%之間，因此1mg/mL只是一個大概數(shù)值，實驗中要根據(jù)預(yù)試結(jié)果進行調(diào)整。由于1mg/mL這個數(shù)字方便稀釋和計算，因此在這里統(tǒng)一寫作1mg/mL。另兩個實驗（ABTS+?清除和PTIO?清除）同理。問：測量完成后怎么計算IC50？答：IC50值是指清除50%的自由基，所需要的樣品的最終濃度。有兩種計算方法。第一，以實驗所得的抗氧化劑濃度為橫坐標，清除率為縱坐標，然后計算線性回歸方程。將清除率50%代入方程中求得對應(yīng)的橫坐標值即為IC50值，注意最終結(jié)果將三次或三次以上的平行試驗取平均值。第二，通過濃度曲線的圖直接讀出。在50%處畫一橫線，此橫線與曲線的模擬線的交點的對應(yīng)的橫坐標，即IC50.另兩個實驗（ABTS+?清除和PTIO?清除）同理。問：為什么要用Trolox作為陽性對照？答：維生素E（生育酚）是常見的抗氧化劑。不過，維生素E難溶于水，而且易變質(zhì)。為此，化學(xué)家將其結(jié)構(gòu)進行修飾，即得Trolox（化學(xué)名稱：6-羥基-2,5,7,8-四甲基色烷-2-羧酸）。Trolox不僅溶于水，而且易溶于有機溶劑，所以，廣泛地用作抗氧化劑的陽性對照物。亦稱水溶性維生素E。為了方便對比評價所測物質(zhì)的抗氧化能力，通常采用Trolox作為DPPH自由基清除實驗的陽性對照品。另兩個實驗（ABTS+?清除和PTIO?清除）同理。問：為什么會出現(xiàn)清除率為負值的情況？答：樣品的活性太弱，所以，加入的樣品的量較多；如果這個樣本身在519nm處有吸收的話，就會產(chǎn)生一個可觀的A值，導(dǎo)致A>A0,清除率為負。問：DPPH?清除率會大于100%嗎？答：不可能。實例茶黃素清除DPPH?自由基數(shù)據(jù)：樣品濃度:0.1mg/ml反應(yīng)液總體積:1.5mL體積/uL最終濃度μg/mLA0平均值A(chǔ)值清除率123123MeanSD201.3330.8060.6120.6190.63224.06923.20121.58822.9531.028402.6670.8060.4900.4860.48639.20639.70239.70239.5370.234604.0000.8060.3720.3630.36653.84654.96354.59154.4670.464805.3330.8060.2900.2990.30264.02062.90362.53163.1510.6331006.6670.8060.2500.2390.24968.98370.34769.10769.4790.616IC50(μg/mL)3.9983.9754.0564.0100.034量效曲線圖(MicrocalOrigin繪制)：

ABTS·+自由基清除實驗ADDINEN.CITEADDINEN.CITE.DATA[2]溶液配制ABTS二銨鹽儲備液(7.4mmol/L)：取ABTS二銨鹽3mg，加蒸餾水0.735mL。（MW＝548.7）過二硫酸鉀（K2S2O8）儲備液(2.6mmol/L)：取K2S2O81mg，加蒸餾水1.43mL。（MW＝270.32）取0.2mLABTS二銨鹽儲備液和0.2mLK2S2O8儲備液混合，黑暗環(huán)境下室溫放置12小時，用pH7.4磷酸鹽緩沖液將混合液稀釋10-20倍直至吸光度為0.70±0.02，此溶液即為ABTS?+自由基工作液。（注：也可以用95乙醇或無水乙醇，但必須是原裝分析純試劑，回收或重蒸者均不可用。）樣品液的配置樣品用合適的溶劑溶解，為便于計算，可配成1mg/mL濃度。溶劑根據(jù)樣品的極性進行選擇，首選95乙醇或無水乙醇，如不溶可用DMSO。預(yù)試取ABTS?+自由基工作液0.8mL，往其中加少量樣品液，加樣時，先少后多漸加，邊加邊混合，并觀察溶液的褪色情況，當溶液顏色基本褪去時，記下樣品的加樣量。如果反應(yīng)緩慢，可在37℃烘箱中放置半個小時。此加樣量即為樣品的最大用量，在此最大用量的基礎(chǔ)上，往前設(shè)置5個用量，使之成等差數(shù)列?！救纭吭陬A(yù)試過程中，發(fā)現(xiàn)加樣到100μL時，ABTS?+自由基工作液顏色基本褪去，則100μL為該樣品液的最大用量。則對于該樣品而言，其用量梯度宜設(shè)為20μL、40μL、60μL、80μL、100μL。A0值：取ABTS?+自由基工作液800μL加入到比色皿中，加95乙醇（或無水乙醇）200μL，稀釋混合，測A值，此A值為A0（A0宜在0.70±0.02）。A值：?。?00-x）μL95乙醇（或無水乙醇）加入到96孔板中，加樣品液xμL（x是根據(jù)2.3預(yù)試結(jié)果確定樣品液的用量），再加ABTS?+自由基溶液800μL，混合使反應(yīng)液總體積為1mL，測A值?！救纭磕硺悠返挠昧刻荻葹?0μL、44μL、60μL、80μL、100μL，則加樣如下：樣品液95乙醇（或無水乙醇）ABTS?+自由基溶液總體積0μL20μL200μL180μL800μL800μL1000μL1000μL40μL160μL800μL1000μL60μL140μL800μL1000μL80μL120μL800μL1000μL100μL100μL800μL1000μL最終測量參照2.3節(jié)，每個濃度平行測三次。ABTS?+清除率（抑制率）的計算(A0為不加樣品時的值；A為加入樣品后的值。)疑難解答問：ABTS?+清除實驗測量抗氧化性的原理是什么？答：ABTS二銨鹽,中文名：2,2-聯(lián)氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)二銨鹽，它與過二硫酸鉀(K2S2O4)反應(yīng)，可以生成綠色的ABTS?+自由基。該自由基在734nm有最大吸收，所以，通過檢測734nm的吸光度，可以測定其濃度。一個物質(zhì)加入到ABTS?+自由基工作液后，如果734nm的吸光度降低，則說明該物質(zhì)具有自由基清除活性，屬于抗氧化劑。該法稱為ABTS自由基清除法，可以用評價植物（或中草藥抽提物）、純化合物的抗氧化能力。問：ABTS?+自由基被清除的機制是什么？答：由于ABTS?+自由基是一種帶正電荷的自由基，因此它可以從抗氧化劑分子中獲得一個電子形成穩(wěn)定的中性分子，故ABTS?+自由基被清除主要涉及到電子轉(zhuǎn)移(ET)機制。問：ABTS?+自由基工作液如何配制？答：需要用ABTS二銨鹽與過二硫酸鉀反應(yīng)12小時才能配制。實例仙鶴草酚B清除ABTS?+自由基數(shù)據(jù)：仙鶴草酚B0.5mg/mL加樣量(μL)最終濃度(μg/mL)吸光度A清除率%平均清除率%SD0.00.00000.5460.42550.00000.460.5480.06080.551-0.48630.50.25000.46515.197614.04261.100.47713.00910.47213.92101.00.50000.4223.404324.92401.650.40226.68690.41324.68091.50.75000.23956.413458.90582.180.2259.87840.21760.42552.01.00000.16969.179367.72042.370.1768.99700.19264.98482.51.25000.10381.215880.12160.950.11279.57450.11279.5745量效曲線圖：

PTIO?自由基清除實驗ADDINEN.CITE<EndNote><Cite><Author>Li</Author><Year>2017</Year><RecNum>392</RecNum><DisplayText>[3]</DisplayText><record><rec-number>392</rec-number><foreign-keys><keyapp="EN"db-id="rfxsxdxam5epp5e50fbvz2ryvf2tdzrw55xa"timestamp="0">392</key></foreign-keys><ref-typename="JournalArticle">17</ref-type><contributors><authors><author>Li,X.C.</author></authors></contributors><auth-address>SchoolofChineseHerbalMedicineandInnovativeResearchandDevelopmentLaboratoryofTCM,GuangzhouUniversityofChineseMedicine,232WaihuanEastRoad,GuangzhouHigherEducationMegaCenter,PanyuDistrict,Guangzhou,Guangdong510006,People'sRepublicofChina.</auth-address><titles><title>2-Phenyl-4,4,5,5-tetramethylimidazoline-1-oxyl3-Oxide(PTIO(*))RadicalScavenging:ANewandSimpleAntioxidantAssayInVitro</title><secondary-title>J.Agric.FoodChem.</secondary-title></titles><pages>6288-6297</pages><volume>65</volume><number>30</number><keywords><keyword>AscorbicAcid/chemistry</keyword><keyword>ChemistryTechniques,Analytical/*methods</keyword><keyword>CyclicN-Oxides/*chemistry</keyword><keyword>FreeRadicalScavengers/*chemistry</keyword><keyword>Imidazoles/*chemistry</keyword><keyword>MassSpectrometry</keyword><keyword>Spectrophotometry</keyword><keyword>Structure-ActivityRelationship</keyword><keyword>2-phenyl-4,4,5,5-tetramethylimidazoline-1-oxyl3-oxide</keyword><keyword>H+transfer</keyword><keyword>PTIO*scavenging</keyword><keyword>analyticalmethod</keyword><keyword>antioxidantassay</keyword><keyword>oxygen-centeredradical</keyword></keywords><dates><year>2017</year><pub-dates><date>Aug2</date></pub-dates></dates><isbn>1520-5118(Electronic) 0021-8561(Linking)</isbn><accession-num>28689421</accession-num><urls><related-urls><url>/pubmed/28689421</url></related-urls></urls><electronic-resource-num>10.1021/acs.jafc.7b02247</electronic-resource-num></record></Cite></EndNote>[3]PTIO?測試液的配置3.1.1取PTIO固體3mg溶于20mL蒸餾水用用水（緩沖液）溶解PTIO時，檢測波長為557nm。也可以用甲醇、DMSO溶解，此時檢測波長均為585nm。3.1.2用空白溶劑調(diào)零后，取800μL“PTIO測試液”和200μL緩沖液或甲醇（與PTIO溶液中的溶劑保持一致）于比色皿中，在557nm處測A值，即得A0值。A0在0.2-0.6之間。樣品液的配置樣品用緩沖液或甲醇、乙醇溶解，配成1mg/ml濃度的溶液，可適當超聲使之完全溶解。如果溶解性差，濃度小于1mg/ml也可以。預(yù)試3.3.1取“PTIO測試液”800μL，往其中加少量樣品液，加樣時，先少后多漸加，邊加邊混合，并觀察溶液的褪色情況，不能立即褪色時則37℃水浴2小時后再觀察，當溶液顏色基本褪去時，記下樣品的加樣量。3.3.2此加樣量即為樣品的最大用量，在此最大用量的基礎(chǔ)上，往前設(shè)置5個用量，使之成等差數(shù)列。（如，在預(yù)試過程中，發(fā)現(xiàn)加樣到200μL時，PTIO溶液顏色基本褪去，則200μL為該樣品液的最大用量。則對于該樣品而言，其用量梯度宜設(shè)為0μL、40μL、80μL、120μL、160μL、200μL）。A值測量用移液槍取“PTIO測試液”800μL加入到比色皿中，加樣品液xμL（x是根據(jù)3.3預(yù)試結(jié)果確定樣品液的用量），再加（200-x）μL甲醇混合，37℃水?。ɑ蚝嫦洌?0分鐘或更久后，測A557nm值?！救纭磕硺悠返挠昧刻荻葹?μL(測出的A即A0值)、40μL、80μL、120μL、160μL、200μL，其加樣表如下：樣品液甲醇（或