基因組學(xué)課件基因組測序與序列組裝

基因組學(xué)課件基因組測序與序列組裝第一頁，共六十二頁，編輯于2023年，星期五4.1DNA測序的方法學(xué)鏈終止法（Thechainterminationmethod）（Sanger，1977）原理：通過合成與單鏈DNA互補(bǔ)的多核苷酸鏈來讀取待測DNA分子的順序，合成的互補(bǔ)單鏈可在不同位置隨機(jī)終止反應(yīng)化學(xué)降解法（Chemicaldegradationmethod）（MaxamandGilbert,1977）原理：雙鏈DNA分子經(jīng)化學(xué)試劑處理，可在特定的核苷酸位點(diǎn)產(chǎn)生切口。用同位素標(biāo)記測序堿基，以此確定順序組成第二頁，共六十二頁，編輯于2023年，星期五4.1.1鏈終止法測序

技術(shù)要點(diǎn)

:制備相同的單鏈模板DNA加入少量的雙脫氧核苷酸（dideoxynucleotide，ddNTP）第三頁，共六十二頁，編輯于2023年，星期五技術(shù)路線與要求制備單鏈模板↓將單鏈模板與一小段引物退火↓加入DNA多聚酶

4種脫氧核苷酸分別加入少量4種雙脫氧核苷酸↓將4種反應(yīng)產(chǎn)物分別在4條泳道電泳↓根據(jù)4個(gè)堿基在4條泳道的終止位置讀出基因序列

A克隆于質(zhì)粒中DNA→用堿或熱變性BM13克隆單鏈DNA（單鏈→雙鏈→單鏈）C噬?？寺NA(helper)→單鏈DPCR產(chǎn)生單鏈DNAA高聚合酶活性B5’→3′外切酶活性？C3′→5′外切酶活性？ddATP/ddCTP/ddGTP/ddTTP的3’碳原子連接的是氫原子,不是羥基第四頁，共六十二頁，編輯于2023年，星期五第五頁，共六十二頁，編輯于2023年，星期五圖4.1

鏈終止法測序

第六頁，共六十二頁，編輯于2023年，星期五第七頁，共六十二頁，編輯于2023年，星期五圖4.2用于測序的DNA多聚酶

第八頁，共六十二頁，編輯于2023年，星期五用于測序的DNA多聚酶Klenow多聚酶由大腸肝菌DNA多聚酶I而來5‘→3’酶切活性已被切除合成長度250bp，缺乏單一性測序酶（Sequenase）由噬菌體T7編碼的DNA多聚酶有很高的加工效率無外切核酸酶活性能利用修飾的核苷酸作為底物第九頁，共六十二頁，編輯于2023年，星期五制備單鏈DNA的方法

將DNA克隆到質(zhì)粒載體中雙鏈→堿或熱變性為單鏈2條互補(bǔ)單鏈，雙向測序缺點(diǎn)：未純化的DNA污染以M13載體克隆單鏈DNAM13復(fù)制產(chǎn)生單鏈，不用變性只能用于小片段DNA，大片段容易丟失或重排第十頁，共六十二頁，編輯于2023年，星期五利用噬菌體M13制備單鏈DNA第十一頁，共六十二頁，編輯于2023年，星期五制備單鏈DNA的方法

以噬粒（phagemid）克隆DNA2個(gè)復(fù)制原點(diǎn)：質(zhì)粒&M13噬粒和輔助噬菌體（helperphage）克隆片段大于10kbPCR產(chǎn)生單鏈DNA引物對一側(cè)連接小磁珠吸磁提純擴(kuò)增第十二頁，共六十二頁，編輯于2023年，星期五利用PCR制備模板DNA用于鏈終止法測序

第十三頁，共六十二頁，編輯于2023年，星期五不同類型的引物用于鏈終止法測序

第十四頁，共六十二頁，編輯于2023年，星期五熱循環(huán)測序優(yōu)點(diǎn)：

1）作為模板的樣本可以是雙鏈DNA

2）僅需微量的DNA模板

第十五頁，共六十二頁，編輯于2023年，星期五PCR后處理15μl反應(yīng)液，加入60μl75%異丙醇（45μl異丙醇+15μl滅菌水）上下顛倒，RT，20min離心，Max，4500rpm，20℃，45分鐘。溫度不要低于15℃，溫度過低則容易使引物沉淀下來，影響測序結(jié)果倒掉上清，去掉蓋，翻轉(zhuǎn)離心，700rpm，20℃，1min，然后放在PCR儀上，打開蓋，94.0℃，30sec加入10μl甲醛，混勻，94℃，6min。完成后，迅速置于冰上，冰水混合物為好第十六頁，共六十二頁，編輯于2023年，星期五技術(shù)的多樣性和靈活性第十七頁，共六十二頁，編輯于2023年，星期五4.1.2化學(xué)降解法

基本原理在選定的核苷酸堿基中引入化學(xué)基團(tuán)再經(jīng)化合物處理使DNA分子在被修飾的核苷酸位置降解第十八頁，共六十二頁，編輯于2023年，星期五圖4.7化學(xué)降解測序法

第十九頁，共六十二頁，編輯于2023年，星期五M-G法所用的化學(xué)修飾技術(shù)堿基特異修飾方法GpH8.0，用硫酸二甲酯對N7進(jìn)行甲基化，使C8-C9鍵對堿基裂解有特殊敏感性A+GpH2.0，哌啶甲酸可使嘌呤環(huán)的N原子化，從而導(dǎo)致脫嘌呤，并因此削弱腺嘌呤和鳥嘌呤的糖苷鍵C+T肼可打開嘧啶環(huán)，后者重新環(huán)化成五元環(huán)后易于除去C在1.5mol/LNaCl存在時(shí)，可用肼除去胞嘧啶第二十頁，共六十二頁，編輯于2023年，星期五4.1.3自動化測序第二十一頁，共六十二頁，編輯于2023年，星期五以熒光化合物標(biāo)記雙脫氧核苷酸進(jìn)行自動測序ddATPddCTPddTTPddGTP第二十二頁，共六十二頁，編輯于2023年，星期五毛細(xì)管電泳測序裝置

a）一束并列的充滿凝膠的用于DNA測序的毛細(xì)管b）共聚焦熒光掃描顯微鏡第二十三頁，共六十二頁，編輯于2023年，星期五ABIPRISM3100GeneticAnalyzer第二十四頁，共六十二頁，編輯于2023年，星期五ABIPRISM3100GeneticAnalyzer第二十五頁，共六十二頁，編輯于2023年，星期五ABIPRISM3100GeneticAnalyzer第二十六頁，共六十二頁，編輯于2023年，星期五ABIPRISM3100GeneticAnalyzer第二十七頁，共六十二頁，編輯于2023年，星期五第二十八頁，共六十二頁，編輯于2023年，星期五非常規(guī)DNA測序——光點(diǎn)測序光點(diǎn)測序脫氧三磷酸核苷酸連接到DNA3’-末端時(shí)會釋放1個(gè)焦磷酸(PPi)焦磷酸在磷酸化酶的作用下轉(zhuǎn)化為化學(xué)能,并發(fā)出光亮往反應(yīng)液中每次只加入1種核苷酸,當(dāng)加入的核苷酸結(jié)合時(shí),反應(yīng)液發(fā)出亮點(diǎn),并記錄核苷酸種類當(dāng)核苷酸未結(jié)合時(shí),反應(yīng)液中的核苷酸酶迅速分解此核苷酸,由此來測定DNA序列第二十九頁，共六十二頁，編輯于2023年，星期五測序如何加快100倍的

乳膠材料和皮升級反應(yīng)孔的焦磷酸鹽測序法特點(diǎn)：一個(gè)典型的反應(yīng)可以在4小時(shí)內(nèi)測出2千5百萬個(gè)堿基，準(zhǔn)確率可達(dá)到99％Sanger毛細(xì)管電泳法測序平均每個(gè)小時(shí)可讀6萬7千個(gè)堿基，平均準(zhǔn)確率為99.4％PCR反應(yīng)：隨機(jī)切割基因組，將雙鏈解旋，給單鏈的DNA加上接頭每顆珠子帶有自己特有的單一的DNA片段，然后在倒入的含有PCR必需試劑的乳膠顆粒中發(fā)生PCR反應(yīng)，PCR在不同的地方終結(jié)使珠子帶有同一DNA模板的不同拷貝的DNA洗去乳膠物質(zhì)，使DNA變性，將帶有單鏈DNA的珠子加入到光學(xué)纖維玻片（fibre-opticslide）上加入更小的帶有焦磷酸鹽測序所需酶的顆粒第三十頁，共六十二頁，編輯于2023年，星期五工作流程a是光學(xué)纖維玻片裝載的地方，從ATGC瓶子來的溶液垂直流過開放板面，進(jìn)行PCR反應(yīng)b是電荷偶聯(lián)裝置（charge-coupleddevice,CCD，掃描儀一般也采用這種原理成像）,負(fù)責(zé)捕獲每個(gè)孔發(fā)出的光子c就是負(fù)責(zé)與人進(jìn)行交互作用的電腦裝置454生命科學(xué)公司W(wǎng)atson血液樣本，給DNA的老爸做一份基因組圖譜---100天第三十一頁，共六十二頁，編輯于2023年，星期五Solexa基本原理基因組DNA被隨機(jī)打斷成為小的DNA片斷；并在DNA片斷的兩端連上接頭(adapter)

Solexa測序?qū)Ｓ玫臏y序芯片（flowcell）表面連接有一層單鏈引物（Primer）,單鏈狀態(tài)的DNA片斷與芯片表面的引物通過堿基互補(bǔ)被一端“錨定”在芯片上通過擴(kuò)增反應(yīng)使得單鏈DNA成為雙鏈DNA

雙鏈再次變性后成為單鏈，其一端“錨定”在測序芯片上，另外一端（5’或3’）隨機(jī)和附近的另外一個(gè)引物互補(bǔ)，被“錨定”住，形成“橋“(bridge)

在測序芯片上同時(shí)有上千萬DNA單分子發(fā)生以上的反應(yīng)4中形成的單鏈橋，以周圍的引物為擴(kuò)增引物，在測序芯片表面再次進(jìn)行擴(kuò)增，形成雙鏈雙鏈經(jīng)變性成單鏈，再次形成橋，成為下一輪擴(kuò)增模板繼續(xù)擴(kuò)增反應(yīng)在反復(fù)進(jìn)行30輪擴(kuò)增，每個(gè)單分子得到了1000倍擴(kuò)增，成為單克隆“DNA簇群”“DNA簇群”在Solexa測序儀上進(jìn)行序列分析測序反應(yīng)：專利的“可逆性末端終結(jié)反應(yīng)”，提高堿基合成來進(jìn)行測序。四種堿基分別標(biāo)記四種不同熒光，每個(gè)堿基末端被保護(hù)基團(tuán)封閉，單次反應(yīng)只能加入一個(gè)堿基，經(jīng)過掃描，讀取該次反應(yīng)顏色后，該保護(hù)基團(tuán)被除去，下一個(gè)反應(yīng)可繼續(xù)進(jìn)行，如此反復(fù)，得出堿基的精確序列第三十二頁，共六十二頁，編輯于2023年，星期五Solexa測序原理第三十三頁，共六十二頁，編輯于2023年，星期五Solexa技術(shù)特色每張測序芯片有8個(gè)通道，每個(gè)通道可單獨(dú)運(yùn)行一個(gè)樣品，也可以把多個(gè)樣品混合在一起檢測；一次實(shí)驗(yàn)可讀取大于15億個(gè)堿基/芯片可精確讀取重復(fù)序列，如：AAAAAAAAAAAAAAAAA,TTTTTTTTTTTTT

實(shí)驗(yàn)費(fèi)用低，測序成本為傳統(tǒng)測序方法的1/100

無需建庫，自動化樣品制備，簡單，成本低樣本使用效率極高，所以對少量樣本也可以極靈敏精確地檢測（1ugDNA即可以進(jìn)行末端雙向測序反應(yīng)）可以進(jìn)行35堿基長度的末端雙向測序反應(yīng)第三十四頁，共六十二頁，編輯于2023年，星期五納米孔道測序法——Nanopore納米孔道測序法利用當(dāng)單鏈DNA分子在外加電壓下通過納米尺寸的孔道時(shí)產(chǎn)生的離子電流阻滯來測序電流阻滯的調(diào)制顯示出分子的長度、組成、結(jié)構(gòu)和動態(tài)行為第三十五頁，共六十二頁，編輯于2023年，星期五非常規(guī)DNA測序——DNA芯片測序基本原理將各種排列順序的寡核苷酸點(diǎn)播在芯片上,每個(gè)點(diǎn)播的寡核苷酸在排列的方陣中都有指定的位置待檢測的DNA分子與芯片溫浴,凡是能雜交的寡核苷酸都會在確定位置發(fā)出信號,然后根據(jù)獲取的信息將寡核苷酸的順序進(jìn)行對比組裝,拼接成完全的DNA順序第三十六頁，共六十二頁，編輯于2023年，星期五芯片技術(shù)測序第三十七頁，共六十二頁，編輯于2023年，星期五利用基因芯片進(jìn)行雜交測序的原理第三十八頁，共六十二頁，編輯于2023年，星期五4.2DNA順序的組裝

鳥槍法（shotgun）

克隆重疊法

引導(dǎo)鳥槍法

第三十九頁，共六十二頁，編輯于2023年，星期五4.2.1隨機(jī)測序與序列組裝流感嗜血桿菌（Haemorphilusinfluenzae）順序組裝1830kb（1995年，F(xiàn)leischmann）流程：超聲波將純化的DNA隨機(jī)打成2.0kb的片段瓊脂糖凝膠分離收集1.6~2.0kb片段連接到質(zhì)粒克隆載體，構(gòu)建質(zhì)粒文庫隨機(jī)挑取19687個(gè)克隆，進(jìn)行了28643次測序可讀順序11,631,485bp，6×基因組組裝獲得140個(gè)覆蓋全基因組的順序重疊群第四十頁，共六十二頁，編輯于2023年，星期五用鳥槍法完成流感嗜血桿菌基因組測序第四十一頁，共六十二頁，編輯于2023年，星期五空隙（gap）順序間隙（sequencegap）測序遺漏序列相鄰已知序列為探針篩選陽性克隆99個(gè)遺漏間隙物理間隙（physicalgap）建庫丟失（載體或宿主選用不當(dāng)）新建文庫：PCR或探針篩選42→23第四十二頁，共六十二頁，編輯于2023年，星期五流感嗜血桿菌基因組完整順序的組裝

第四十三頁，共六十二頁，編輯于2023年，星期五果蠅基因組鳥槍法測序180Mb，3對常染色體，1對性染色體

1/3為異染色質(zhì)4.2.1隨機(jī)測序與序列組裝

第四十四頁，共六十二頁，編輯于2023年，星期五果蠅測序策略構(gòu)建3個(gè)基因組文庫2kb：測序10kb：覆蓋重復(fù)序列-----contig130kb：大范圍序列組裝-----Scaffold末端測序3×106個(gè)末端測序2%來自于異色質(zhì)DNASTS結(jié)合物理圖篩選——95%區(qū)域單一重疊群（U-contig）和支架：20Mb,97.5%第四十五頁，共六十二頁，編輯于2023年，星期五

用于果蠅基因組鳥槍法測序的文庫載體

（kb)插入子長度

成對末端序列

測序的覆蓋面

高拷貝質(zhì)粒27323807.3x低拷貝質(zhì)粒105499745.4xBAC13098690.07x總數(shù)129082312.8x第四十六頁，共六十二頁，編輯于2023年，星期五鳥槍法的優(yōu)勢與局限優(yōu)點(diǎn)速度快，無需提供相關(guān)的遺傳圖與物理圖生殖道支原體（Mycoplasmagenitalium）590kb，5人8周局限大基因組，結(jié)構(gòu)過于復(fù)雜，序列組裝的起始階段工作量非常大小重復(fù)順序及其數(shù)量，在順序組裝時(shí)可能出現(xiàn)錯(cuò)誤連接美國斯坦福大學(xué)：CeleraGenomics公司果蠅基因組注釋，29%完全正確，26%基本正確，45%有嚴(yán)重錯(cuò)誤第四十七頁，共六十二頁，編輯于2023年，星期五4.2.2限定測序與序列組裝

在一些已經(jīng)繪制了遺傳圖與物理圖的生物基因組測序中，先進(jìn)行各個(gè)克隆的隨機(jī)測序，再按照基因組物理圖進(jìn)行序列組裝，即重疊克隆群測序第四十八頁，共六十二頁，編輯于2023年，星期五指導(dǎo)隨機(jī)測序法的工作流程

第四十九頁，共六十二頁，編輯于2023年，星期五4.2.3指導(dǎo)測序與序列組裝第五十頁，共六十二頁，編輯于2023年，星期五4.3基因組測序的其它路線

重要區(qū)域的優(yōu)先測序

人類主要組織相容性復(fù)合區(qū)

(humanmajorhistocompatibilitycomplex,hMHC)的測序正是根據(jù)這一考慮率先完成的

EST測序

瀏覽測序

第五十一頁，共六十二頁，編輯于2023年，星期五人類主要組織相容性復(fù)合區(qū)（MHC）位于第6號染色體，全長3.6x106bp，與人類免疫系統(tǒng)有關(guān)諸如類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎，牛皮蘚等炎癥以及從癌癥到閱讀障礙等不同的疾病均與該區(qū)的遺傳缺陷有關(guān)（Beck，1999）人類MHC區(qū)由224個(gè)基因座組成，其中有93個(gè)座位（41.5%）是直接通過基因組測序發(fā)現(xiàn)的人類MHC區(qū)是迄今為止已測序的人類基因組中基因分布最密集的區(qū)域，平均每16kb含一個(gè)基因，也是多態(tài)性最豐富的區(qū)域，有些座位等位基因成員超過200

第五十二頁，共六十二頁，編輯于2023年，星期五EST測序的優(yōu)點(diǎn)mRNA可直接反轉(zhuǎn)錄為cDNA，并很易構(gòu)建cDNA文庫

只需一次cDNA測序即可獲取EST的順序，500bp的cDNA序列足以鑒定所代表的基因

不必反復(fù)檢測EST順序的準(zhǔn)確性

第五十三頁，共六十二頁，編輯于2023年，星期五瀏覽測序（sequenceskimming）粗略分析初步測序結(jié)果從中尋找基因編碼順序的方法

第五十四頁，共六十二頁，編輯于2023年，星期五4.4人類基因組的測序與組裝

2001年2月由國際人類基因組測序聯(lián)合體與CeleraGenomics同時(shí)發(fā)表的兩份人類基因組順序草圖是采用物理圖與鳥槍法有機(jī)結(jié)合的技術(shù)路線完成的（Venteretal.2001;InternationalHumanGenomeSequencingConsortium,2001）

第五十五頁，共六十二頁，編輯于2023年，星期五基因組計(jì)劃專門術(shù)語SequenceRawsequence：Individualunassembledsequencereads,producedbysequencingofclonescontainingDNAinserts原始序列：直接從克隆載體插入子閱讀的單個(gè)序列，尚未組裝Paired-endsequence：Rawsequenceobtainedfrombothendsofaclonedinsertinanyvector,suchasaplasmidorbacterialartificialchromosome成對末端序列：從任何基因組文庫的克隆插入子兩端讀取的原始序列，包括質(zhì)粒、PAC和BAC載體插入子Finishedsequence：Completesequenceofacloneorgenome,withanaccuracyofatleast99.99%andnogaps完成序列：已完成測序的任何一個(gè)克隆或基因組的序列，它們是連續(xù)的，不含任何內(nèi)部間隙，誤差率0.01%Coverage(ordepth)：Theaveragenumberoftimesanucleotideisrepresentedbyahigh-qualitybaseinacollectionofrandomrawsequence.Operationally,ahigh-qualitybase'isdefinedasonewithanaccuracyofatleast99%(correspondingtoaPHREDscoreofatleast20)覆蓋面（或深度）：每個(gè)核苷酸在完成序列中平均出現(xiàn)的次數(shù)，或者是完成序列長度與組裝序列長度之比Fullshotguncoverage：Thecoverageinrandomrawsequenceneededfromalarge-insertclonetoensurethatitisreadyforfinishing;thisvariesamongcentresbutistypically8±10-fold.Cloneswithfullshotguncoveragecanusuallybeassembledwithonlyahandfulofgapsper100kb完全鳥槍法覆蓋面：從克隆的大插入子獲取的隨機(jī)的原始序列覆蓋面，用于序列的組裝。鳥槍法覆蓋面一般在8~10倍之間，組裝時(shí)只允許100kb含1個(gè)間隙Halfshotguncoverage：Halftheamountoffullshotguncoverage(typically,4±5-foldrandomcoverage)半鳥槍法覆蓋面：覆蓋面僅為完全覆蓋面的1/2第五十六頁，共六十二頁，編輯于2023年，星期五ClonesBACclone：BacterialartificialchromosomevectorcarryingagenomicDNAinsert,typically100±200kb.Mostofthelarge-insertclonessequencedintheprojectwereBACclonesFinishedclone：Alarge-insertclonethatisentirelyrepresentedbyfinishedsequence完成的克?。汉幸堰_(dá)到完成序列標(biāo)準(zhǔn)的克隆插入子Fullshotgunclone：Alarge-insertcloneforwhichfullshotgunsequencehasbeenproduced完全鳥槍法克?。喝坑渗B槍法測序的大插入子克隆Draftclone：Alarge-insertcloneforwhichroughlyhalf-shotgunsequencehasbeenproduced.Operationally,thecollectionofdraftclonesproducedbyeachcentrewasrequiredtohaveanaveragecoverageoffourfoldfortheentiresetandaminimumcoverageofthreefoldforeachclone草圖克隆：整體上覆蓋面僅為4×的大插入子克隆，其中某些序列的覆蓋面最小倍數(shù)為3Predraftclone：Alarge-insertcloneforwhichsomeshotgunsequenceisavailable,butwhichdoesnotmeetthestandardsforinclusioninthecollectionofdraftclones預(yù)草圖克?。阂延鞋F(xiàn)成的某些鳥槍法序列的大插入子克隆，但是尚未滿足草圖克隆的要求第五十七頁，共六十二頁，編輯于2023年，星期五ContigsandscaffoldsContig：Theresultofjoininganoverlappingcollectionofsequencesorclones重疊群：一組由重疊序列或克隆連接的序列Scaffold：Theresultofconnectingcontigsbylinkinginformationfrompaired-endreadsfromplasmids,paired-endreadsfromBACs,knownmessengerRNAsorothersources.Thecontigsinascaffoldareorderedandorientedwithrespecttooneanother支架：由質(zhì)粒或BAC成對末端序列以及其它來源的序列將重疊群連接組成的集合體，其中各個(gè)重疊群彼此的位置與方向已確定Fingerprintclonecontigs：Contigsproducedbyjoiningclonesinferredtooverlaponthebasisoftheirrestrictiondigestfingerprints指紋連接的克隆重疊群：根據(jù)克隆插入子指紋重疊組建的重疊群Sequenced-clonelayout：Assignmentofsequencedclonestothephysicalmapoffingerprintclonecontigs測序克隆排列：將已測序的克隆與指紋連接的克隆重疊群物理圖對比排列第五十八頁，共六十二頁，編輯于2023年，星期五Initialsequencecontigs：Contigsproducedbymergingoverlappingsequencereadsobtainedfromasingleclone,inaprocesscalledsequenceassembly起始序列重疊群：從單個(gè)克隆兩端獲取的閱讀序列中的查找重疊序列，并依此連接組建的重疊群，又稱序列組裝Sequence-contig

scaffolds：Scaffoldsproducedbyconnectingsequencecontigsonthebasisoflinkinginformation序列重疊群支架：依據(jù)連接信息將多個(gè)序列重疊群組建成更大的連續(xù)的DNA區(qū)段，簡稱為支架Sequenced-clonecontigs：Contigsproducedbymergingoverlappingsequencedclones測序的克隆重疊群：由已測序的克隆組成的重疊群Sequenced-clone-contigscaffolds：Scaffoldsproducedbyjoiningsequenced-clonecontigsonthebasisoflinkinginformation測序的克隆重疊群支架：根據(jù)連接信息將測序的克隆重疊群連接組成的支架Draftgenomesequence：Thesequenceproducedbycombiningtheinformationfromtheindividualsequencedclones(bycreatingmergedsequencecontigsandthenemployinglinkinginformat