基因工程的基本操作程序

基因工程的基本操作程序.第一頁(yè)，共三十頁(yè)，編輯于2023年，星期五第二頁(yè)，共三十頁(yè)，編輯于2023年，星期五基因工程的基本操作程序主要包括四個(gè)基本步驟：1）目的基因的獲取2）基因表達(dá)載體的構(gòu)建3）將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞4）目的基因的檢測(cè)與鑒定第三頁(yè)，共三十頁(yè)，編輯于2023年，星期五第四頁(yè)，共三十頁(yè)，編輯于2023年，星期五步驟一：目的基因的獲取

目的基因是人們所需要轉(zhuǎn)移或改造的基因,獲取目的基因是實(shí)施基因工程的第一步。

如蘇云金芽孢桿菌的抗蟲(chóng)基因，還有植物的抗?。共《?、抗細(xì)菌）基因、種子貯藏蛋白的基因，以及人的胰島素基因、干擾素基因等。第五頁(yè)，共三十頁(yè)，編輯于2023年，星期五目的基因的提取方法直接分離基因人工合成基因反轉(zhuǎn)錄法根據(jù)已知的氨基酸序列合成DNA：鳥(niǎo)槍法第六頁(yè)，共三十頁(yè)，編輯于2023年，星期五1.鳥(niǎo)槍法（散彈射擊法）

用限制酶將供體細(xì)胞中的DNA切成許多片段，將這些片段分別載入運(yùn)載體，然后通過(guò)運(yùn)載體分別轉(zhuǎn)入不同的受體細(xì)胞，讓供體細(xì)胞提供的外源DNA的所有片段分別在各個(gè)受體細(xì)胞中大量復(fù)制（即擴(kuò)增），從中找出含有目的基因的細(xì)胞，再利用一定發(fā)方法將目的基因的DNA片段分離出來(lái)。用限制酶切斷成許多片段第七頁(yè)，共三十頁(yè)，編輯于2023年，星期五1）反轉(zhuǎn)錄法：以目的基因轉(zhuǎn)錄成的信使RNA為模板，反轉(zhuǎn)錄成互補(bǔ)的單鏈DNA，然后在酶的作用下合成雙鏈DNA，從而獲得所需的基因。目的基因的mRNA單鏈DNA(cDNA)雙鏈DNA(即目的基因)反轉(zhuǎn)錄合成2.人工合成基因法第八頁(yè)，共三十頁(yè)，編輯于2023年，星期五2）根據(jù)已知的氨基酸序列合成DNA法：

根據(jù)已知蛋白質(zhì)的氨基酸序列，推測(cè)出相應(yīng)的信使RNA序列，然后按照堿基互補(bǔ)配對(duì)原則，推測(cè)出它的結(jié)構(gòu)基因的核苷酸序列，再通過(guò)化學(xué)方法，以單核苷酸為原料合成目的基因。蛋白質(zhì)的氨基酸序列mRNA的核苷酸序列結(jié)構(gòu)基因的核苷酸序列推測(cè)推測(cè)目的基因化學(xué)合成第九頁(yè)，共三十頁(yè)，編輯于2023年，星期五上述三種目的基因提取的方法有何優(yōu)缺點(diǎn)？?jī)?yōu)點(diǎn)缺點(diǎn)鳥(niǎo)槍法反轉(zhuǎn)錄法根據(jù)已知氨基酸合成DNA法操作簡(jiǎn)便廣泛使用工作量大，盲目，分離出來(lái)的有時(shí)并非一個(gè)基因?qū)Ｒ恍詮?qiáng)操作過(guò)程麻煩，mRNA很不穩(wěn)定，要求的技術(shù)條件較高專(zhuān)一性最強(qiáng)僅限于合成核苷酸對(duì)較少的簡(jiǎn)單基因第十頁(yè)，共三十頁(yè)，編輯于2023年，星期五哪些新技術(shù)能大大簡(jiǎn)化基因工程的操作技術(shù)？1）DNA序列自動(dòng)測(cè)序儀：2）PCR技術(shù)：

對(duì)提取出來(lái)的基因進(jìn)行核苷酸序列分析。

使目的基因的片段在短時(shí)間內(nèi)成百萬(wàn)倍地?cái)U(kuò)增。第十一頁(yè)，共三十頁(yè)，編輯于2023年，星期五第十二頁(yè)，共三十頁(yè)，編輯于2023年，星期五3）從基因文庫(kù)中獲取目的基因：基因文庫(kù):

將含有某種生物不同基因的許多DNA片段,導(dǎo)入受體菌的群體中儲(chǔ)存,各個(gè)受體菌分別含有這種生物的不同的基因,稱(chēng)為基因文庫(kù)(genelibrary)基因組文庫(kù):

基因文庫(kù)中包含了一種生物所有的基因,這種基因文庫(kù)叫做基因組文庫(kù).部分基因文庫(kù):

基因文庫(kù)中包含了一種生物的一部分基因,這種基因文庫(kù)叫做部分基因文庫(kù).第十三頁(yè)，共三十頁(yè)，編輯于2023年，星期五

用DNA重組技術(shù)將某種生物的總DNA用特定的限制性內(nèi)切酶切割成一個(gè)個(gè)片段，然后將這些片段隨機(jī)地連接在某些質(zhì)?；蚱渌d體上，再將它們轉(zhuǎn)移到適當(dāng)?shù)乃拗骷?xì)胞中，通過(guò)細(xì)胞的增殖而構(gòu)成各個(gè)片段的無(wú)性繁殖系（克?。?，當(dāng)這些克隆多到可以包括某種生物的全部基因時(shí)，這一批克隆的總體就稱(chēng)為該種生物的基因文庫(kù)。這一定義也適用于線粒體DNA和葉綠體DNA，分別稱(chēng)為某種生物的線粒體基因文庫(kù)或葉綠體基因文庫(kù)。為了有效地保存基因文庫(kù)，可通過(guò)細(xì)菌在固體培養(yǎng)基上繁殖而使包含各個(gè)特定DNA片段的細(xì)菌增多。通過(guò)分子雜交的方法，可以篩選出包含有所需基因的DNA片段的細(xì)菌（或噬菌體）。經(jīng)過(guò)擴(kuò)增得到大量這樣的細(xì)菌（或噬菌體），從中便可分離出所需基因的DNA片段。建立和使用基因文庫(kù)是分離高等真核生物基因的有效手段，對(duì)于基因定位和基因工程的研究都很有用。第十四頁(yè)，共三十頁(yè)，編輯于2023年，星期五第十五頁(yè)，共三十頁(yè)，編輯于2023年，星期五步驟二：基因表達(dá)載體的構(gòu)建1）用一定的限制酶切割質(zhì)粒，使其出現(xiàn)一個(gè)切口，露出黏性末端。

2）用同一種限制酶切斷目的基因，使其產(chǎn)生相同的黏性末端。

3）將切下的目的基因片段插入質(zhì)粒的切口處，再加入適量DNA連接酶，形成了一個(gè)重組DNA分子（重組質(zhì)粒）

目的基因與運(yùn)載體的結(jié)合過(guò)程，實(shí)際上是不同來(lái)源的基因重組的過(guò)程。第十六頁(yè)，共三十頁(yè)，編輯于2023年，星期五第十七頁(yè)，共三十頁(yè)，編輯于2023年，星期五常用的受體細(xì)胞：

有大腸桿菌、枯草桿菌、土壤農(nóng)桿菌、酵母菌和動(dòng)植物細(xì)胞等。將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞的原理借鑒細(xì)菌或病毒侵染細(xì)胞的途徑。步驟三：目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞第十八頁(yè)，共三十頁(yè)，編輯于2023年，星期五①直接導(dǎo)入法有電擊、顯微注射、直接吸收、基因槍等方法。（1）電擊法：借助電擊儀高壓脈沖把目的基因打入宿主細(xì)胞。（2）顯微注射法：利用微量注射器在顯微鏡下直接把目的基因注入宿主細(xì)胞。（3）直接吸收法：把目的基因和宿主細(xì)胞混在一起，讓其吸收。（4）基因槍法：在金屬微粒上涂一層目的基因，然后發(fā)射到宿主細(xì)胞中。②間接導(dǎo)入法常用的載體是質(zhì)粒、λ噬菌體、科斯質(zhì)粒。（1）質(zhì)粒是細(xì)菌染色體DNA以外的環(huán)狀雙鏈DNA分子，它能自我復(fù)制，也可整合到細(xì)胞染色體DNA中與其一起表達(dá)。質(zhì)粒通常還含有標(biāo)記基因，這可以從細(xì)胞的表型特征來(lái)識(shí)別。（2）λ噬菌體是一種細(xì)菌病毒，其環(huán)狀雙鏈DNA可以作為目的基因的載體。（3）科斯質(zhì)粒是一種雜種質(zhì)粒，含有質(zhì)粒和λ噬菌體的部分順序，很適合用作真核生物基因的載體。第十九頁(yè)，共三十頁(yè)，編輯于2023年，星期五1.將目的基因?qū)胫参锛?xì)胞第二十頁(yè)，共三十頁(yè)，編輯于2023年，星期五2.將目的基因?qū)雱?dòng)物細(xì)胞第二十一頁(yè)，共三十頁(yè)，編輯于2023年，星期五3.將目的基因?qū)胛⑸锛?xì)胞

大腸桿菌細(xì)胞最常用的轉(zhuǎn)化方法是:

首先用Ca2+處理細(xì)胞,以增大細(xì)菌細(xì)胞壁的通透性,使細(xì)胞處于一種能吸收周?chē)h(huán)境中DNA分子的生理狀態(tài),這種細(xì)胞稱(chēng)為感受態(tài)細(xì)胞.

第二步是將重組表達(dá)載體DNA分子溶于緩沖液中與感受態(tài)細(xì)胞混合,在一定的溫度下促進(jìn)感受態(tài)細(xì)胞吸收DNA分子,完成轉(zhuǎn)化過(guò)程.

第二步目的基因在受體細(xì)胞內(nèi)，隨其繁殖而復(fù)制，由于細(xì)菌繁殖的速度非?？?，在很短的時(shí)間內(nèi)就能獲得大量的目的基因。第二十二頁(yè)，共三十頁(yè)，編輯于2023年，星期五1）將細(xì)菌用CaCl2處理，以增大細(xì)菌細(xì)胞壁的通透性。

2）使含有目的基因的重組質(zhì)粒進(jìn)入受體細(xì)胞。

3）目的基因在受體細(xì)胞內(nèi)，隨其繁殖而復(fù)制，由于細(xì)菌繁殖的速度非常快，在很短的時(shí)間內(nèi)就能獲得大量的目的基因。第二十三頁(yè)，共三十頁(yè)，編輯于2023年，星期五步驟四：目的基因的檢測(cè)與鑒定四環(huán)素抗性基因氨芐青霉素抗性基因第二十四頁(yè)，共三十頁(yè)，編輯于2023年，星期五

不能，受體細(xì)胞必須表現(xiàn)出特定的性狀，才能說(shuō)明目的基因完成了表達(dá)。受體細(xì)胞攝入DNA分子后就說(shuō)明目的基因完成了表達(dá)嗎？若不能表達(dá)，要對(duì)抗蟲(chóng)基因再進(jìn)行修飾。第二十五頁(yè)，共三十頁(yè)，編輯于2023年，星期五第二十六頁(yè)，共三十頁(yè)，編輯于2023年，星期五

前三步的處理十分繁鎖，為保證目的基因得到有效利用，通常用大量的受體細(xì)胞來(lái)接受不多的目的基因。這樣，處理的受體細(xì)胞中真正攝入了目的基因的很少，必須將它從中檢測(cè)出來(lái)。無(wú)表達(dá)產(chǎn)物無(wú)表達(dá)產(chǎn)物有表達(dá)產(chǎn)物無(wú)表達(dá)產(chǎn)物細(xì)菌的檢測(cè)，將每個(gè)受體細(xì)胞單獨(dú)培養(yǎng)形成菌落，檢測(cè)菌落中是否有目的基因的表達(dá)產(chǎn)物。淘汰無(wú)表達(dá)產(chǎn)物的菌落，保留有表達(dá)產(chǎn)物的進(jìn)一步培養(yǎng)、研究。第二十七頁(yè)，共三十頁(yè)，編輯于2023年，星期五多細(xì)胞生物的檢測(cè)，將每個(gè)受體細(xì)胞單獨(dú)培養(yǎng)并誘導(dǎo)發(fā)育成完整個(gè)體，檢測(cè)這些個(gè)體是否攝入目的基因，攝入的基因是否表達(dá)（是否表現(xiàn)出相應(yīng)的性狀）。淘汰無(wú)變化的個(gè)體，保留有相應(yīng)變化的個(gè)體進(jìn)一步培養(yǎng)、研究。例：用棉鈴飼喂棉鈴蟲(chóng)，如蟲(chóng)吃后不出現(xiàn)中毒癥狀，說(shuō)明未攝入目的基因或攝入目的基因未表達(dá)。如蟲(chóng)吃后中毒死亡，則說(shuō)明攝入了抗蟲(chóng)基因并得到表達(dá)。第二十八頁(yè)，共三十頁(yè)，編輯于2023年，星期五1）以下說(shuō)法正確的是（）

A、所有的限制酶只能識(shí)別一種特定的核苷酸序列

B、質(zhì)粒是基因工程中唯一的運(yùn)載體

C、運(yùn)載體必須具備的條件之一是：具有多個(gè)限制酶切點(diǎn)，以便與外源基因