基因工程基本操作技術

基因工程基本操作技術第一頁，共七十九頁，編輯于2023年，星期五第一節(jié)離心技術離心技術基本原理離心機主要構造和類型離心技術應用第二頁，共七十九頁，編輯于2023年，星期五生物樣品懸浮液在高速旋轉下，由于巨大的離心力作用，使懸浮的微小顆粒(細胞器、生物大分子的沉淀等)以一定的速度沉降，從而與溶液得以分離。

沉降速度取決于顆粒的質量、大小和密度。離心技術主要用于各種生物樣品的分離和制備。離心技術在生物科學，特別是在生物化學和分子生物學研究領域，己得到十分廣泛的應用，每個生物化學和分子生物學實驗室都要配置各種類型的離心機。第三頁，共七十九頁，編輯于2023年，星期五一、基本原理當一個粒子(生物大分子或細胞器)在高速旋轉下受到離心力作用時，此離心力“F”由下式定義，即：a----粒子旋轉的加速度m----沉降粒子的有效質量ω---粒子旋轉的角速度r----粒子的旋轉半徑(cm)第四頁，共七十九頁，編輯于2023年，星期五

∴RCF=1.119×10-5×(rpm)2rrpm---revolutionsperminute為每分鐘轉數(shù),r/min低速離心時常以轉速“rpm”來表示高速離心時則以“g”表示第五頁，共七十九頁，編輯于2023年，星期五將離心機轉數(shù)換算為相對離心力時，首先，在r標尺上取已知的半徑和在N標尺上取已知的離心機轉數(shù)。然后，將這兩點間劃一條直線，在圖中間RCF標尺上的交叉點極為相應的相對離心力數(shù)值。注意，若已知的轉數(shù)值處于N標尺的右邊，則應讀取RCF標尺右邊的數(shù)值；同樣，轉數(shù)值處于N標尺的左邊，則讀取RCF標尺左邊的數(shù)值．第六頁，共七十九頁，編輯于2023年，星期五二、離心機的主要構造和類型

實驗用離心機

制備性離心機分析性離心機

工業(yè)用離心機離心機第七頁，共七十九頁，編輯于2023年，星期五1、制備性離心機可分為三類離心機一般有離心主機，轉頭和離心管三部分組成。（1）普通離心機：最大轉速6000rpm左右（2）高速冷凍離心機：最大轉速為20000～25000rpm（r/min）（3）超速離心機：轉速可達50000～80000rpm，裝有真空系統(tǒng)，這是它與高速離心機的主要區(qū)別。第八頁，共七十九頁，編輯于2023年，星期五第九頁，共七十九頁，編輯于2023年，星期五分析性離心機

分析性離心機使用了特殊設計的轉頭和光學檢測系統(tǒng)，以便連續(xù)地監(jiān)測物質在一個離心場中的沉降過程，從而確定其物理性質。

第十頁，共七十九頁，編輯于2023年，星期五2、轉頭(1)角式轉頭

第十一頁，共七十九頁，編輯于2023年，星期五角式轉子的特點：

（1）重心低,轉速可較高

（2）樣品粒子穿過溶劑層的距離略大于離心管的直徑;

（3）“管壁效應”：

有一定的角度,在離心過程中撞到離心管外壁的粒子沿著管壁滑到管底形成沉淀,此效應使最后在管底聚成的沉淀較緊密。

第十二頁，共七十九頁，編輯于2023年，星期五(2)水平轉子（1）轉子靜止時,處在轉子中的離心管中

心線與旋轉軸平行,

（2）轉子旋轉加速時,離心管中心線由

行位置逐漸過渡到垂直位置,即與旋

轉軸成90°角,

（3）粒子的沉淀方向同旋轉半徑方向基本一致有少量的“管壁效應”水平轉子的特點：

（1）轉子的重心位置較高

（2）樣品粒子沉降穿過溶劑層的距離大于直徑

（3）對于多種成分樣品分離特別有效

（4）常用于速率區(qū)帶離心和等密度離心第十三頁，共七十九頁，編輯于2023年，星期五第十四頁，共七十九頁，編輯于2023年，星期五第十五頁，共七十九頁，編輯于2023年，星期五

(3)區(qū)帶轉頭：

區(qū)帶轉頭無離心管，主要由一個轉子桶和可旋開的頂蓋組成。

(4)垂直轉頭：其離心管是垂直放置的。

(5)連續(xù)流動轉頭：

轉頭與區(qū)帶轉頭類似，由轉子桶和有入口和出口的轉頭蓋及附屬裝置組成。第十六頁，共七十九頁，編輯于2023年，星期五3、離心管

塑料離心管常用材料有聚乙烯(PE)，聚碳酸酯(PC)，聚丙烯(PP)等，其中PP管性能較好。塑料離心管的優(yōu)點是透明(或半透明)，硬度小，可用穿刺法取出梯度。缺點是易變形，抗有機溶劑腐蝕性差，使用壽命短。不銹鋼管強度大，不變形，能抗熱，抗凍，抗化學腐蝕。但用時也應避免接觸強腐蝕性的化學藥品，如強酸、強堿等。第十七頁，共七十九頁，編輯于2023年，星期五第十八頁，共七十九頁，編輯于2023年，星期五離心操作的注意事項使用各種離心機時，必須事先在天平上精確

平衡離心管和其內(nèi)容物，轉頭中絕對不能裝

載單數(shù)的管子。當轉頭只是部分裝載時，管子必須互相對稱地放在轉頭中，以便使負載均勻地分布在轉頭的周圍。離心過程中不得隨意離開。第十九頁，共七十九頁，編輯于2023年，星期五裝載溶液時，根據(jù)待離心液體的性質及體積選用適合的離心管。液體不得裝得過多，以防離心時甩出，造成轉頭不平衡、生銹或被腐蝕。若要在低于室溫的溫度下離心時。轉頭在使用前應放置在冰箱或置于離心機的轉頭室內(nèi)預冷。每個轉頭各有其最高允許轉速和使用累計期限，使用轉頭時要查閱說明書，不得過速使用。第二十頁，共七十九頁，編輯于2023年，星期五第二十一頁，共七十九頁，編輯于2023年，星期五

根據(jù)離心原理,按照實際工作的需要，目前已有可設計出各種離心方法綜合起來大致可分為：三、離心分離方法沉降速度法：根據(jù)粒子大小、形狀不同進行分離。差速離心法

速率區(qū)帶離心法沉降平衡法

等密度離心法：又稱等比重離心法,依粒子密度差進行分離,等密度離心法和上述速率區(qū)帶離心法合稱為密度梯度離心法。經(jīng)典式沉降法：用于對生物大分子分子量的測定、純度估計、構象變化。

第二十二頁，共七十九頁，編輯于2023年，星期五用差速離心法分離已破碎的細胞各組份500g,10分鐘上清液沉淀(細胞核）已破碎的細胞

10,000g,10分鐘沉淀(細胞膜碎片,線粒體,溶酶體)100,000g,3小時上清液沉淀(核糖核蛋白體）

上清液(可溶性成份)

第二十三頁，共七十九頁，編輯于2023年，星期五常用的梯度材料：

1.糖類:蔗糖、甘油、聚蔗糖(Ficoll)、右旋糖酐、糖原

2.無機鹽類:CsCl(氯化銫)、RbCl(氯化銣)、NaCl、KBr等

3.有機碘化物:三碘苯甲酰匍萄糖胺等

4.硅溶膠:如Percoll。

5.蛋白質:如牛血清白蛋白

6.重水

7.非水溶性有機物:如氟代碳等

等密度離心法第二十四頁，共七十九頁，編輯于2023年，星期五1.測定生物大分子的相對分子重量

沉降速度

沉降平衡

接近沉降平衡

2.生物大分子的純度估計

3.分析生物大分子中的構象變化

分析性超速離心的應用第二十五頁，共七十九頁，編輯于2023年，星期五第二十六頁，共七十九頁，編輯于2023年，星期五第二節(jié)核酸的提取、純化與含量測定第二十七頁，共七十九頁，編輯于2023年，星期五就基因工程而言，核酸分子是其研究所涉及的主要對象，所以核酸的分離與提取是研究中很重要的基本技術。核酸樣品的質量將直接關系到實驗的成敗。第二十八頁，共七十九頁，編輯于2023年，星期五核酸的分類DNA:主要存在于細胞核的染色體中。核外也有少量DNA，如線粒體DNA（mtDNA），葉綠體DNA（cpDNA），質粒DNA。RNA:存在于細胞質中，如mRNA,rRNA,tRNA等。除上述DNA，RNA外，還有非細胞形式存在的病毒和噬菌體，其或只含DNA，或只含有RNA。第二十九頁，共七十九頁，編輯于2023年，星期五一、核酸提取的基本原理1、提取的含義:

提取是指在一定的條件下用一定的溶劑處理樣品，使欲分離的物質充分釋放到溶劑中的過程,又稱為抽提。常用的溶劑有水、稀鹽、稀酸、稀堿或甘油等較緩和的試劑。2、影響提取的主要因素:(1)提取物質的結構與性質(與其溶解度有關)如:極性物質易溶于極性溶劑，非極性物質易溶于非極性溶劑，酸性物質易溶于堿性溶劑，堿性物質易溶于酸性溶劑，兩性電解質在pI時，溶解度最少。

(2)溫度:一般溫度升高溶解度增大

(3)溶液的粘度；

(4)擴散速度；

(5)擴散面積。第三十頁，共七十九頁，編輯于2023年，星期五二、核酸提取的原理

在生物體內(nèi)核酸多以核蛋白的形式存在于組織中，根據(jù)核糖核蛋白(RNP)和脫氧核糖核蛋白(DNP)在不同濃度電解質溶液中溶解度明顯差別進行分離。故用0.14mol/LNaCl溶解提取核糖核蛋白。核蛋白0.14mol/LNaCl1.0mol/LNaClRNP溶解度大溶解度小DNP溶解度?。▋H為水中1%）溶解度大(比在水中大2倍)第三十一頁，共七十九頁，編輯于2023年，星期五1.核酸制備的一般原則(1)分離純化核酸總的原則：①應保證核酸一級結構的完整性②排除其它分子的污染。第三十二頁，共七十九頁，編輯于2023年，星期五(2)核酸純化應達到的要求：核酸的純化根據(jù)所需核酸的性質和特點除去其它核酸污染,并除去提取過程中的系列試劑(鹽、有機溶劑等）雜質，最后得到均一的核酸樣品。①核酸樣品中不應存在對酶有抑制作用的有機溶劑和過高濃度的金屬離子；②其它生物大分子的污染應降低到最低程度；③排除其它核酸分子的污染第三十三頁，共七十九頁，編輯于2023年，星期五2.核酸制備時應注意的事項:

①盡量簡化操作步驟，縮短提取過程。②減少化學因素對核酸的降解。PH4-10③減少物理因素對核酸的降解。機械剪切力和高溫④防止核酸的生物降解。第三十四頁，共七十九頁，編輯于2023年，星期五3.核酸制備的一般方法和原理(1)核酸酶的抑制和抑制劑劑降低溫度，改變pH及鹽的濃度，都利于對核酸酶活性的抑制，但均不如利用核酸酶抑制劑更有利，當然，幾個條件并用更好。對于DNA，抑制DNase活力很容易，但防止機械張力拉斷則更重要。對于RNA，因分子較小，不易被機械張力拉斷，但抑制RNase活力較難，故在RNA提取中設法抑制RNase更重要。第三十五頁，共七十九頁，編輯于2023年，星期五DNase抑制①加入少量金屬離子螯合劑，如0.01mol/LEDTA或檸檬酸鈉，DNase基本可以全部失活。②去垢劑、蛋白變性劑及DNase抑制劑也可使DNase失活。第三十六頁，共七十九頁，編輯于2023年，星期五RNase抑制①操作要帶手套。②所有器皿要嚴格消毒，③試劑處理④低溫操作⑤在分離過程中要加入一定的RNase抑制劑。

(TRZOL,DEPC,蛋白酶K)第三十七頁，共七十九頁，編輯于2023年，星期五（2）核酸制備中常用的去垢劑核酸本身帶負電荷，結合帶正電荷的蛋白質。用于核酸提取的去垢劑，一般都是陰離子去垢劑，去垢劑的作用：①溶解膜蛋白及脂肪，使細胞膜破裂；②溶解核糖體上面的蛋白質，使其解聚，將核酸釋放出來；③對RNase、DNase有一定的抑制作用。如：SDS、脫氧膽酸鈉、4-氨基水楊酸鈉、萘-1.5-二磺酸鈉、三異丙基萘磺酸鈉第三十八頁，共七十九頁，編輯于2023年，星期五（3）核酸制備中常用的蛋白質變性劑蛋白質變性劑的作用：

①使蛋白質變性、沉淀，從核酸提取液中分離除去，以防造成蛋白污染。②使蛋白質變性，故可使核糖體解聚釋放出核酸。③某些蛋白質變性劑也有抑制RNase活性和破裂細胞的作用。苯酚、氯仿、鹽酸胍、DEPC（4）核酸制備中常用的酶制劑DNase、RNase、蛋白酶K、溶菌酶第三十九頁，共七十九頁，編輯于2023年，星期五4、核酸提取的一般過程破碎細胞—提取--純化（1）破碎細胞（防止核酸酶的作用）微生物：溶菌酶、SDS裂解。高等植物：搗碎器破碎、液氮研磨。酶法：蛋白酶，如胰蛋白酶，冰凍法：反復凍融或液氮凍后組織搗碎。動物：液氮處理后用勻漿器破碎。細胞器DNA，首先純化細胞器。以上處理時均要同時加入核酸酶抑制劑第四十頁，共七十九頁，編輯于2023年，星期五（2）破碎抽提核酸除去雜質

①首先使脫氧核糖核蛋白、核糖體、病毒的核蛋白與其它成分分離

②使核酸與蛋白質分離③除去脂類

④多糖的除去第四十一頁，共七十九頁，編輯于2023年，星期五5、核酸樣品的保存

核酸保存的主要條件是溫度和介質溫度：4℃（5℃）最佳和最簡單

-70℃是長期保存的良好溫度，為一次性保存

-20℃保存（冰箱的自動化霜裝置）保存介質：

TE緩沖溶液(最常用)10mmol/LTris-ClpH8.01mmol/LEDTApH8.0第四十二頁，共七十九頁，編輯于2023年，星期五三、DNA/RNA提取實例第四十三頁，共七十九頁，編輯于2023年，星期五細胞破碎抽提去蛋白質沉淀核酸1、植物DNA提取基本過程第四十四頁，共七十九頁，編輯于2023年，星期五2、質粒DNA的提取方法方法：堿裂解法；煮沸裂解；羥基磷灰石柱層析法，質粒DNA釋放法；酸酚法等。概括起來主要是用非離子型或離子型去污劑、有機溶劑或堿進行處理及用加熱處理所有分離質粒DNA的方法都包括3個基本步驟：培養(yǎng)細菌使質粒擴增；收集和裂解細菌；分離質粒DNA(有時還要求純化質粒DNA，根據(jù)實驗所需)第四十五頁，共七十九頁，編輯于2023年，星期五質粒DNA－堿裂解法堿裂解法原理染色體DNA比質粒DNA分子大得多，且染色體DNA為線狀分子，而質粒DNA為共價閉合環(huán)狀分子；當用堿處理DNA溶液時，線狀染色體DNA容易發(fā)生變性，共價閉環(huán)的質粒DNA在回到中性pH時即恢復其天然構象；變性染色體DNA片段與變性蛋白質和細胞碎片結合形成沉淀，而復性的超螺旋質粒DNA分子則以溶解狀態(tài)存在液相中，從而可通過離心將兩者分開。第四十六頁，共七十九頁，編輯于2023年，星期五溶液I：50mM葡萄糖

10mMEDTApH8.025mMTris-HClpH8.010μg/mlRNaseA溶液II：0.2NNaOH1.0%SDS

以0.4NNaOH和2%SDS貯備液現(xiàn)用現(xiàn)配溶液III：5MKAc60ml

冰醋酸11.5ml

水28.5ml第四十七頁，共七十九頁，編輯于2023年，星期五對數(shù)期菌體溶液III中和溶液I充分重懸溶液II裂解上清液抽提離心洗滌酒精沉淀干燥溶解沉淀質粒DNA溶液堿裂解法流程圖第四十八頁，共七十九頁，編輯于2023年，星期五3、細胞器DNA－差速離心法差速離心法原理是利用物質比重的不同分離混合物的一種方法。將待分離物質置于均勻介質（蔗糖）中，以一定的轉速進行離心，比重大的物質優(yōu)先沉降，比重小的卻處于上層，從而得以分離。線粒體和葉綠體是生物體內(nèi)半自主性細胞器，自身可編碼蛋白，它們的比重和大小一定，因而在同一離心場內(nèi)的沉降速度也一定，根據(jù)這一原理，常用不同轉速的離心法，將細胞內(nèi)各種組分分級分離出來。第四十九頁，共七十九頁，編輯于2023年，星期五總結：DNA提取的基本步驟I.材料準備II.破碎細胞或包膜－內(nèi)容物釋放III.核酸分離、純化IV.沉淀或吸附核酸，并去除雜質

V.核酸溶解在適量緩沖液或水中第五十頁，共七十九頁，編輯于2023年，星期五材料準備最好使用新鮮材料，低溫保存的樣品材料不要反復凍融提取血液基因組DNA時，要選擇有核細胞（白細胞）組培細胞培養(yǎng)時間不能過長，否則會造成DNA降解含病毒的液體材料DNA含量較少，提取前先富集基因組DNA的提取質粒DNA的提取使用處于對數(shù)期的新鮮菌體（老化菌體導致開環(huán)質粒增加）培養(yǎng)時應加入篩選壓力，否則菌體易污染，質粒易丟失盡量選擇高拷貝的質粒，如為低拷貝或大質粒，則應加大菌體用量菌株不要頻繁轉接（質粒丟失）第五十一頁，共七十九頁，編輯于2023年，星期五細胞裂解材料應適量，過多會影響裂解，導致DNA量少，純度低針對不同材料，選擇適當?shù)牧呀忸A處理方式：植物材料－－液氮研磨動物組織－－勻漿或液氮研磨組培細胞－－蛋白酶K細菌－－溶菌酶破壁酵母－－破壁酶或玻璃珠高溫溫浴時，定時輕柔振蕩基因組DNA的提取質粒DNA的提取菌體量適當培養(yǎng)基去除干凈，同時保證菌體在懸浮液中充分懸浮變性的時間不要過長（5分鐘），否則質粒易被打斷復性時間也不宜過長，否則會有基因組DNA的污染G＋菌、酵母質粒的提取，應先用酶法或機械法處理，以破壁第五十二頁，共七十九頁，編輯于2023年，星期五采用吸附材料吸附的方式分離DNA時，應提供相應的緩沖體系采用有機（酚/氯仿）抽提時應充分混勻，但動作要輕柔離心分離兩相時，應保證一定的轉速和時間針對不同材料的特點，在提取過程中輔以相應的去雜質的方法基因組DNA的提取質粒DNA的提取核酸分離、純化第五十三頁，共七十九頁，編輯于2023年，星期五蛋白質的去除：酚/氯仿抽提使用變性劑變性（SDS、異硫氰酸胍等）高鹽洗滌蛋白酶處理核酸分離、純化第五十四頁，共七十九頁，編輯于2023年，星期五多糖的去除：高鹽法：用乙醇沉淀時，在待沉淀溶液中加入1/2體積的5MNaCl，高鹽可溶解多糖。用多糖水解酶將多糖降解。在提取緩沖液中加一定量的氯苯(1/2體積)，氯苯可以與多糖的羥基作用，從而去除多糖。用PEG8000代替乙醇沉淀DNA：在500μLDNA液中加入200μl20%PEG8000(含1.2MNaCl)，冰浴20min。核酸分離、純化第五十五頁，共七十九頁，編輯于2023年，星期五多酚的去除：在抽提液中加入防止酚類氧化的試劑：β-巰基乙醇、抗壞血酸、半胱氨酸、二硫蘇糖醇等加入易與酚類結合的試劑：如PVP、PEG(聚乙二醇)，它們與酚類有較強的親和力，可防止酚類與DNA的結合鹽離子的去除：70％的乙醇洗滌核酸分離、純化第五十六頁，共七十九頁，編輯于2023年，星期五當沉淀時間有限時，用預冷的乙醇或異丙醇沉淀，沉淀會更充分沉淀時加入1/10體積的NaAc（pH5.2，3M），有利于充分沉淀沉淀后應用70％的乙醇洗滌，以除去鹽離子等晾干DNA，讓乙醇充分揮發(fā)（不要過分干燥）若長期儲存建議使用TE緩沖液溶解TE中的EDTA能螯和Mg2+或Mn2+離子，抑制DNasepH值為8.0，可防止DNA發(fā)生酸解基因組DNA的提取質粒DNA的提取核酸沉淀、溶解第五十七頁，共七十九頁，編輯于2023年，星期五1.DNA中含有蛋白、多糖、多酚類雜質2.DNA在溶解前，有酒精殘留，酒精抑制后續(xù)酶解反應3.DNA中殘留有金屬離子1.重新純化DNA，去除蛋白、多糖、多酚等雜質2.重新沉淀DNA，讓酒精充分揮發(fā)3.增加70％乙醇洗滌的次數(shù)（2-3次）4、DNA提取常見問題問題一：DNA樣品不純，抑制后續(xù)酶解和PCR反應。

原因對策第五十八頁，共七十九頁，編輯于2023年，星期五1.材料不新鮮或反復凍融2.未很好抑制內(nèi)源核酸酶的活性3.提取過程操作過于劇烈，DNA被機械打斷4.外源核酸酶污染1.盡量取新鮮材料，低溫保存材料避免反復凍融2.液氮研磨或勻漿組織后，應在解凍前加入裂解緩沖液3.在提取內(nèi)源核酸酶含量豐富的材料的DNA時，可增加裂解液中螯合劑的含量4.細胞裂解后的后續(xù)操作應盡量輕柔5.所有試劑用無菌水配制，耗材經(jīng)高溫滅菌6.將DNA分裝保存于緩沖液中，避免反復凍融DNA提取常見問題問題二：DNA降解

原因對策第五十九頁，共七十九頁，編輯于2023年，星期五實驗材料不佳或量少破壁或裂解不充分沉淀不完全洗滌時DNA丟失盡量選用新鮮（幼嫩）的材料動植物要勻漿研磨充分；G＋菌、酵母裂解前先用生物酶或機械方式破壁高溫裂解時，時間適當延長（對于動物細胞、細菌可增加PK的用量）低溫沉淀，延長沉淀時間加輔助物，促進沉淀洗滌時，最好用槍頭將洗滌液吸出，勿傾倒問題三：DNA提取量少DNA提取常見問題

原因對策第六十頁，共七十九頁，編輯于2023年，星期五gDNA電泳圖第六十一頁，共七十九頁，編輯于2023年，星期五第六十二頁，共七十九頁，編輯于2023年，星期五四、RNA提取第六十三頁，共七十九頁，編輯于2023年，星期五RNA提取的通用方法異硫氰酸胍/苯酚法原理：細胞在變性劑異硫氰酸胍的作用下被裂解，同時核蛋白體上的蛋白變性，核酸釋放；釋放出來的DNA和RNA由于在特定pH下溶解度的不同而分別位于整個體系中的中間相和水相，從而得以分離；有機溶劑抽提，沉淀，得到純凈RNA。第六十四頁，共七十九頁，編輯于2023年，星期五材料準備：盡量新鮮。裂解變性：異硫氰酸胍（亞硫氫胍，巰基乙醇，N-月桂肌氨酸等）。使細胞及核蛋白復合物變性，釋放RNA，有效抑制核酸酶。純化分離：苯酚，氯仿，異戊醇。苯酚/氯仿可抽提去除雜物。洗滌：70％乙醇。沉淀：異丙醇、無水乙醇。乙酸鈉（pH4.0）：維持變性的細胞裂解液的pH值，沉淀RNA。此外還常用氯化鋰選擇沉淀RNA。RNA提取的通用方法

步驟:第六十五頁，共七十九頁，編輯于2023年，星期五影響RNA提取的因素材料：新鮮，切忌使用反復凍融的材料如若材料來源困難，且實驗需要一定的時間間隔。可以先將材料貯存在TRIzol或樣品貯存液中，于－70℃或－20℃保存如要多次提取，請分成多份保存液氮長期保存，－70℃短期保存第六十六頁，共七十九頁，編輯于2023年，星期五影響RNA提取的因素根據(jù)不同材料選擇不同的處理方法：培養(yǎng)細胞：通?？芍苯蛹恿呀庖毫呀饨湍负图毦阂话鉚RIzol可直接裂解，對于一些特殊的材料可先用酶或者機械方法破壁動植物組織：先液氮研磨和勻漿，后加裂解液裂解。期間動作快速，樣品保持冷凍樣品量適當，保證充分裂解為減少DNA污染，可適當加大裂解液的用量

樣品破碎及裂解：第六十七頁，共七十九頁，編輯于2023年，星期五

純化：在使用氯仿抽提純化時，一定要充分混勻，且動作快速；經(jīng)典的純化方法，如LiCl沉淀等，雖然經(jīng)濟，但操作時間長，易造成RNA降解；柱離心式純化方法：抽提速度快，能有效去除影響RNA后續(xù)酶反應的雜質，是目前較為理想的選擇。影響RNA提取的因素第六十八頁，共七十九頁，編輯于2023年，星期五RNA提取常見問題RNA的降解

OD260/OD280比值偏低電泳帶型異常下游實驗效果不佳第六十九頁，共七十九頁，編輯于2023年，星期五RNA降解

新鮮細胞或組織：裂解液的質量外源RNase的污染裂解液的用量不足組織裂解不充分另外某些富含內(nèi)源酶的樣品(如脾臟，胸腺等)，很難避免RNA的降解。建議在液氮條件下將組織碾碎，并且勻漿時使用更多裂解液。28S18S5S第七十頁，共七十九頁，編輯于2023年，星期五RNA降解冷凍樣品：樣品取材后應立即置于液氮中速凍，然后可以移至-70℃冰箱保存。樣品要相對小一點；先用液氮研磨，再加裂解液勻漿；樣品與裂解液充分接觸前避免融化，研磨用具必須預冷，碾磨過程中及時補充液氮。第七十一頁，共七十九頁，編輯于2023年，星期五OD260/OD280比值偏低

蛋白質污染：不要吸入中間層及有機相，加入氯仿后首先混勻，并且離心分層的離心力和時間要足夠。減少起始樣品量，確保裂解完全、徹底解決辦法:重新抽提一次，再沉淀，溶解。苯酚殘留：不要吸入中間層及有機相，加入氯仿后首先混勻，并且離心分層的離心力和時間要足夠。解決辦法:重新抽提一次，再沉淀，溶解。第七十二頁，共七十九頁，編輯于2023年，星期五OD260/OD280比值偏低抽提試劑殘留：確保洗滌時要徹底懸浮RNA，并且徹