硝酸還原酶與谷氨酰胺合成酶的測定

硝酸還原酶與谷氨酰胺合成酶活性的測定摘要本實(shí)驗(yàn)以小麥為實(shí)驗(yàn)材料，對小麥進(jìn)行預(yù)處理，提取酶液進(jìn)行硝酸還原酶與谷氨酰胺合成酶活性的測定，說明小麥對氮素的利用途徑。關(guān)鍵詞小麥硝酸還原酶谷氨酰胺合成酶 酶活性引言硝酸還原酶（NR）是植物代謝中十分重要的一種酶,它主要是在硝酸亞硝化過程中起催化作用。同時(shí)，它對其他代謝如光合作用、碳代謝和能量代謝都有重要影響［1］。就植物的生長和發(fā)育而言，氮素的同化是個(gè)十分重要的生理過程。其中，無機(jī)氮必須同化為谷氨酰胺和谷氨酸等有機(jī)氮才能被植物體所吸收和利用。谷氨酰胺合成酶（GS）是高等植物氮代謝中十分重要的酶，它和谷氨酸合成酶聯(lián)合作用，催化氨的同化，使其轉(zhuǎn)變成Gln和Glu,在小麥植物體內(nèi)含氮有機(jī)物的生物合成中作為N的供體［2］。1、實(shí)驗(yàn)材料與方法1.1實(shí)驗(yàn)材料與試劑小麥、亞硝酸鈉、磷酸氫二鈉、對氨基苯磺酸、濃鹽酸、萘基乙烯胺、硝酸鉀、三氯乙酸、反應(yīng)液、終止液、顯色液、亞硝態(tài)氮標(biāo)準(zhǔn)溶液、三羥甲基氨基甲烷、硫酸鎂、二硫蘇糖醇、蔗糖、濃鹽酸、谷氨酸鈉鹽、半胱氨酸、乙二醇雙（氨乙基醚）四乙酸（EGTA）、鹽酸羥胺、氯化鐵、三氯乙酸、三磷酸腺苷（ATP）。1.2實(shí)驗(yàn)原理1.2.1硝酸還原酶活性的測定硝酸還原酶（NR）是植物氮素同化的關(guān)鍵酶，它催化植物體內(nèi)的硝酸鹽還原為亞硝酸鹽，產(chǎn)生的亞硝酸鹽與對-氨基苯磺酸（或?qū)?氨基苯磺酰胺）及a-萘胺（或萘基乙烯胺）在酸性條件下定量生成紅色偶氮化合物。此紅色偶氮化合物在540nm下有最大吸收峰，可用分光光度計(jì)測定。故硝酸還原酶活性可由產(chǎn)生的亞硝態(tài)氮的量表示，而亞硝態(tài)氮的量可有標(biāo)準(zhǔn)曲線查的。1.2.2谷氨酰胺合成酶活性的測定谷氨酰胺合成酶（GS）是植物體內(nèi)氨同化的關(guān)鍵酶之一，在ATP和Mg2+存在下，它能催化植物體內(nèi)在硝酸還原過程中產(chǎn)生的氨與谷氨酸形成谷氨酰胺，實(shí)現(xiàn)氨的同化，在生物體內(nèi)，谷氨酰胺既是氨的貯存形式（消除氨毒），又可用于谷氨酸的合成，在進(jìn)一步合成其他氨基酸。但在該實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)反應(yīng)體系中，谷氨酰胺與鹽酸羥胺等物質(zhì)發(fā)生反應(yīng)，生成Y-谷氨?；惲u肟酸。此物質(zhì)在酸性條件下可與Fe3+形成紅色的絡(luò)合物，該絡(luò)合物在540nm處有最大吸收峰，可用分光光度計(jì)測定。因此，谷氨酰胺合成酶的活性可用產(chǎn)生的Y-谷氨?；惲u肟酸與Fe3+形成的絡(luò)合物的量來表示，一般間接用540nm處吸光值的大小來表示，單位為：A*mg-3（protein）?h-i。1.3實(shí)驗(yàn)步驟1.3.1硝酸還原酶活性的測定1.3.1.1標(biāo)準(zhǔn)曲線制作取7支試管，按下表順序依次添加試劑。搖勻后在30°C下水浴20min，然后在540nm下比色。以亞硝態(tài)氮含量與對應(yīng)吸光值建立回歸方程。符號1234567

亞硝酸鈉

標(biāo)準(zhǔn)液試劑(ml試劑(ml)蒸餾水1%磷胺0.02%a-萘胺酶管含亞

硝態(tài)氮（ug）0.00.20.40.81.21.62.02.01.81.61.20.80.40.04.04.04.04.04.04.04.04.04.04.04.04.04.04.00.00.20.40.81.21.62.01.3.1.2硝酸還原酶活性測定植株預(yù)處理、取樣、酶活性反應(yīng)：先往對照瓶中加入1ml終止液，然后往3個(gè)瓶中均加入9ml反應(yīng)液；混勻后立即放入真空干燥箱中，抽真空15min（期間停頓幾次通入空氣，再抽真空，使葉片完全沉入瓶底）；之后將各瓶在30^、黑暗條件下靜置反應(yīng)30min；反應(yīng)時(shí)間到，立即往兩個(gè)測定瓶中加入1ml終止液；將各瓶搖勻，再靜置3min。最后進(jìn)行顯色反應(yīng)，根據(jù)標(biāo)線求得亞硝態(tài)氮含量。計(jì)算硝酸還原酶活性。1.3.2谷氨酰胺合成酶活性的測定1.3.2.1酶液的提取稱取植物葉片1.0g，置于預(yù)冷研缽中，加3ml酶液提取液，置冰浴上研成勻漿，轉(zhuǎn)移于寓心管中，在4P下、15.000轉(zhuǎn)離子20min，上清液即為酶液。1.3.2.2谷氨酰胺合成酶活性測定取3支試管，分別加入0.7ml酶液和0.7mlATP溶液：然后往其中1支加入1.6ml反應(yīng)混合液A（作為對照管），另外2支各加入1.6ml反應(yīng)混合液B（作為反應(yīng)管），混勻后，將3支試管均置于37°C水浴下反應(yīng)30min；反應(yīng)結(jié)束

后，3支試管均立即加入1ml顯色液，搖勻，靜置片刻后，取上清液在540nm處測定吸光值（用酶液提取液調(diào)零），根據(jù)吸光值計(jì)算酶活性。1.3.2.3酶液中可溶性蛋白含量測定（采用紫外吸收法）取酶液0.3ml，用蒸餾水定容至100ml，分別在260nm和280nm下測定吸光值（用蒸餾水調(diào)零），根據(jù)公式計(jì)算酶液中可溶性蛋白含量。2、實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析2.1硝酸還原酶活性的測定2.1.1標(biāo)準(zhǔn)曲線的測定以及硝酸還原酶活性的測定表T硝酸還原醇（MR）標(biāo)準(zhǔn)曲線0.080.060.040.02y=0.0310k=0.99680.060.040.02y=0.0310k=0.9968?我口.眺|2,0.0635.6,0.0485.2,0.035500.0260.0135—吸光度值—線性（吸光度值）0.51.5 2 2.5亞硝態(tài)氨圖1標(biāo)準(zhǔn)曲線2.1.2樣品活性的測定通過實(shí)驗(yàn)得出對照管，測試管1，測試管2的吸光值（表1）。表1硝酸還原酶的吸光值123平均值對照管0.0050.0150.0090.0097測試管10.0390.0160.0290.028測試管20.0310.0350.0360.034

通過以上的數(shù)值代入標(biāo)準(zhǔn)曲線中可以得出硝酸還原酶含量，即硝酸還原酶的活性（表2）。表2不同管內(nèi)亞硝態(tài)的量編號亞硝態(tài)氮的量P55對照管0.318a測試管10.629b測試管20.764c通過以上的數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)，可以得出亞硝態(tài)氮的量，即為硝酸還原酶的活性，從實(shí)驗(yàn)的結(jié)果來看，實(shí)驗(yàn)管和對照關(guān)差異顯著，實(shí)驗(yàn)前測試管用硝酸鉀處理，小麥中硝酸還原酶明顯增多，硝酸還原酶的活性明顯增強(qiáng)。2.2谷氨酰胺合成酶活性測定以Y-谷氨?；惲u肟酸與Fe3+形成的絡(luò)合物在540nm波長下的吸光值（表3）。表3540nm波長下的吸光值123平均值對照管0.5580.5960.6200.591測試管10.8061.0021.0180.942測試管21.3281.0961.1151.179可溶性蛋白利用紫外吸收法測定，通過測定在不同波長下溶液的吸光值，然后利用公式進(jìn)行計(jì)算，根據(jù)公式可以算出（表4）：可溶性蛋白的含量=1.55%80-0.76%60表4可溶性蛋白的含量編號可溶性蛋白的含量P55對照管0.053a測試管10.089b測試管20.101c由表3和表4得到的數(shù)據(jù)可以代入以下公式，計(jì)算得出谷氨酰胺合成酶的活力（表5）：通過測定谷氨酰胺合成酶在540nm吸光值和粗蛋白質(zhì)的含量，通過公式就可以計(jì)算出谷氨酰胺合成酶活性，計(jì)算公式常用的是：GS=A/（P*V*T）在上面的公式中：A為540nm波長下的吸光值；P為可溶性蛋白的含量；V為反應(yīng)體系中加入的酶量；t為反應(yīng)時(shí)間（h）。表5谷氨酰胺合成酶的活力編號谷氨酰胺合成酶的活力P55對照管0.319a測試管10.322b測試管20.337c通過試驗(yàn)結(jié)果表明，三個(gè)實(shí)驗(yàn)試管中谷氨酰胺合成酶的活力之間差異性不顯著，說明了植株體內(nèi)的谷氨酸含量不是很高，很可能與實(shí)驗(yàn)前的處理時(shí)間長短有關(guān)系。3、討論硝酸還原酶（NR）是陸生植物氮代謝的關(guān)鍵酶之一，它將進(jìn)入植物體內(nèi)的NO3-還原為NO-2,進(jìn)而在亞硝酸還原酶的作用下還原為氨進(jìn)入氮的同化。因此,NR活性直接影響植物對土壤中硝態(tài)氮的利用能力。生產(chǎn)中，硝酸還原酶活性可作為農(nóng)作物氮肥形態(tài)選擇的重要依據(jù)，也被認(rèn)為是作物氮高效的育種選種指標(biāo)之一［3,4］。GS在氮同化過程中起著十分重要的作用，GS也是分子生物學(xué)研究基因?qū)Ｒ恍员磉_(dá)和時(shí)空表達(dá)調(diào)控的好模式，所以成為人們研究的熱點(diǎn)之一；同時(shí)它的表達(dá)既受環(huán)境因素，如CO2、光、NaCl濃度等的影響，又受到發(fā)育因子的影響，因此，也是植物逆境生理研究的重要內(nèi)容之一［5］。在硝酸還原酶活性測定中，抽真空后不能見光是因?yàn)槊笇Ψ磻?yīng)條件很敏感，可能在光照的條件下就失活，另外，硝酸會見光分解。實(shí)驗(yàn)前充分光照是使小麥的酶活性達(dá)到最大值?？瞻讓φ盏哪康脑谟谟幸粋€(gè)在同樣條件下結(jié)果的對比。谷氨酰胺與鹽酸羥胺等物質(zhì)發(fā)生反應(yīng)，生成Y-谷氨?；惲u肟酸。此物質(zhì)在酸性條件下可與Fe3形成紅色的絡(luò)合物，該絡(luò)合物在540nm處有最大吸收峰。在試驗(yàn)中測得可溶性蛋白的含量，利用公式即可算出谷氨酰胺合成酶的活力。隨著氮代謝相關(guān)基因研究的進(jìn)一步深入，與植物氮素營養(yǎng)反應(yīng)相關(guān)的基因更為明確，利用基因表達(dá)差異進(jìn)行植物氮營養(yǎng)的早期檢測，將為更加準(zhǔn)確、及時(shí)地進(jìn)行肥料運(yùn)作提供科學(xué)依據(jù)。參考文獻(xiàn)陳薇，張德頤.植物組織中NR的提取、測定和純化.植物生理學(xué)通訊，1980(4):45-49.李常健，林清華，張楚富.高等植物谷氨酰胺合成酶研究進(jìn)展.生物學(xué)雜志,2001,18