分子克隆載體

分子克隆載體第一頁(yè)，共六十五頁(yè)，編輯于2023年，星期五目的基因載體限制性內(nèi)切酶限制性內(nèi)切酶DNAligase重組體載體自連目的基因自連第二頁(yè)，共六十五頁(yè)，編輯于2023年，星期五基因操作的基本步驟第三頁(yè)，共六十五頁(yè)，編輯于2023年，星期五載體

單獨(dú)一個(gè)包括啟動(dòng)子、編碼區(qū)和終止子的基因，或者組成基因的某個(gè)元件，一般是不易進(jìn)入受體細(xì)胞的，即使采用理化方法進(jìn)入細(xì)胞后，也不容易在受體細(xì)胞內(nèi)維持。

載體(vector):能攜帶外源基因（或DNA片段）進(jìn)入細(xì)胞復(fù)制、整合或表達(dá)的工具。

第四頁(yè)，共六十五頁(yè)，編輯于2023年，星期五作為克隆載體的DNA分子具備的條件：1具有對(duì)受體細(xì)胞的可轉(zhuǎn)移性，能攜帶外源基因進(jìn)入宿主細(xì)胞；2能在宿主細(xì)胞中自主復(fù)制，并實(shí)現(xiàn)外源基因的增殖；第五頁(yè)，共六十五頁(yè)，編輯于2023年，星期五3具有由單一限制酶識(shí)別位點(diǎn)組成的多克隆位點(diǎn)(MCS）；4克隆載體必須具有用于選擇克隆子的標(biāo)記基因；5克隆載體必須是安全的，不應(yīng)含有對(duì)受體細(xì)胞有害的基因，并且不會(huì)任意轉(zhuǎn)入除受體細(xì)胞以外的其他生物的細(xì)胞，尤其是人的細(xì)胞。第六頁(yè)，共六十五頁(yè)，編輯于2023年，星期五多克隆位點(diǎn)ori復(fù)制起始點(diǎn)遺傳標(biāo)記AmprMCS克隆載體第七頁(yè)，共六十五頁(yè)，編輯于2023年，星期五按功能分：

克隆載體

表達(dá)載體第八頁(yè)，共六十五頁(yè)，編輯于2023年，星期五

質(zhì)?？寺≥d體

(plasmidcloningvector)第九頁(yè)，共六十五頁(yè)，編輯于2023年，星期五

質(zhì)粒(plasmid):是一種寓于宿主細(xì)胞中染色體外裸露的dsDNA分子。一個(gè)質(zhì)粒就是一個(gè)DNA分子。

Plasmidchromosome

存在于細(xì)菌、真菌、藍(lán)藻和綠藻的細(xì)胞中，在細(xì)菌細(xì)胞中最多。第十頁(yè)，共六十五頁(yè)，編輯于2023年，星期五第十一頁(yè)，共六十五頁(yè)，編輯于2023年，星期五質(zhì)粒的存在形式：一般以超螺旋共價(jià)閉環(huán)DNA分子(ccc-DNA)的形式存在。也可以開環(huán)DNA分子(oc-DNA)和線性DNA分子(L-DNA)的形式存在。第十二頁(yè)，共六十五頁(yè)，編輯于2023年，星期五

質(zhì)粒DNA的大小質(zhì)粒宿主大?。╧b）

pPbs藍(lán)藻1.5CoLE1大腸桿菌6.4PV21三葉草根瘤菌700

多數(shù)在10kb左右第十三頁(yè)，共六十五頁(yè)，編輯于2023年，星期五質(zhì)粒的基本性質(zhì)：

1復(fù)制

按照質(zhì)?？刂瓶截悢?shù)的程度，可以將質(zhì)粒分為:

1）嚴(yán)謹(jǐn)型質(zhì)粒(stringentplasmid)

拷貝數(shù)少，為1～5個(gè)

2）松散型質(zhì)粒(relaxedplasmid)

拷貝數(shù)多，可達(dá)10個(gè)拷貝以上

第十四頁(yè)，共六十五頁(yè)，編輯于2023年，星期五

某種質(zhì)粒屬于嚴(yán)謹(jǐn)型或是松散型的，與宿主有一定的關(guān)系。

例子：質(zhì)粒ColE1-K30在大腸桿菌中屬于松散型的，在奇異變形桿菌中是嚴(yán)謹(jǐn)型的。

一般來(lái)說(shuō)，希望構(gòu)建的質(zhì)?？寺≥d體是松散型的，所以在構(gòu)建的克隆載體中應(yīng)含有松散型的復(fù)制起始位點(diǎn)和調(diào)控復(fù)制拷貝數(shù)的基因。第十五頁(yè)，共六十五頁(yè)，編輯于2023年，星期五2質(zhì)粒的不相容性(incompatibility):

兩種質(zhì)粒在同一宿主細(xì)胞中不能共存的現(xiàn)象。親緣關(guān)系密切的不同質(zhì)粒一般屬于不親和性質(zhì)粒。野生型質(zhì)粒與其衍生的重組質(zhì)粒屬于不親和性質(zhì)粒。當(dāng)質(zhì)粒載體承載目的基因轉(zhuǎn)化受體細(xì)胞時(shí)，考慮受體細(xì)胞內(nèi)原有的質(zhì)粒與作為克隆載體的質(zhì)粒是否屬于親和性質(zhì)粒。作為受體細(xì)胞最好不含內(nèi)源質(zhì)粒。

第十六頁(yè)，共六十五頁(yè)，編輯于2023年，星期五3質(zhì)粒的轉(zhuǎn)移性接合型質(zhì)粒(conjugativeplasmid)：

轉(zhuǎn)移基因tra：指令宿主細(xì)胞產(chǎn)生菌毛、合成細(xì)胞表面物質(zhì)，促使宿主細(xì)胞與受體細(xì)胞的結(jié)合，使質(zhì)粒從一個(gè)細(xì)胞轉(zhuǎn)移到另一個(gè)細(xì)胞。非接合型質(zhì)粒(non-conjugativeplasmid)：順式作用元件：bom位點(diǎn)移動(dòng)基因：mob基因

(分子質(zhì)量小、拷貝數(shù)多、被動(dòng)遷移)

第十七頁(yè)，共六十五頁(yè)，編輯于2023年，星期五構(gòu)建質(zhì)粒載體的基本原則1選擇合適的出發(fā)質(zhì)粒必備元件：

A復(fù)制起始點(diǎn)

B選擇標(biāo)記基因

C克隆位點(diǎn)

D啟動(dòng)子

E終止子等等………..第十八頁(yè)，共六十五頁(yè)，編輯于2023年，星期五構(gòu)建質(zhì)粒載體的基本原則2正確獲得構(gòu)建質(zhì)粒載體克隆元件一般用限制酶切割出發(fā)質(zhì)粒DNA分子，獲得含有某種元件的DNA片段。為了獲得含某種元件的DNA片段，選用的切割位點(diǎn)既要保證元件完整無(wú)缺，又要使DNA片段愈小愈好，盡可能不含或少含不必要的序列，使構(gòu)建的載體盡可能小。

第十九頁(yè)，共六十五頁(yè)，編輯于2023年，星期五構(gòu)建質(zhì)粒載體的基本原則組裝合適的選擇標(biāo)記基因

構(gòu)建供轉(zhuǎn)化大腸桿菌用的質(zhì)粒載體，可組裝藍(lán)/白顏色進(jìn)行選擇的(B-半乳糖苷酶基因)lacz’基因。但構(gòu)建供轉(zhuǎn)化藍(lán)藻用的質(zhì)粒載體不能用這個(gè)基因。因?yàn)樗{(lán)藻含有大量的藻藍(lán)蛋白。

第二十頁(yè)，共六十五頁(yè)，編輯于2023年，星期五構(gòu)建質(zhì)粒載體的基本原則4選用合適的啟動(dòng)子

如果用真核生物基因的啟動(dòng)子作為原核生物表達(dá)克隆載體的啟動(dòng)子，其功效下降；原核生物和病毒基因的啟動(dòng)子用作真核生物表達(dá)克隆載體的啟動(dòng)子，可保留其原來(lái)的功效。

第二十一頁(yè)，共六十五頁(yè)，編輯于2023年，星期五構(gòu)建質(zhì)粒載體的基本原則5在能達(dá)到預(yù)期目的的情況下，構(gòu)建過程要力求簡(jiǎn)單。

第二十二頁(yè)，共六十五頁(yè)，編輯于2023年，星期五構(gòu)建質(zhì)?？寺≥d體的基本策略1.構(gòu)建的質(zhì)?？寺≥d體應(yīng)該是能在轉(zhuǎn)化的受體細(xì)胞中進(jìn)行有效的復(fù)制，并作為質(zhì)?？寺≥d體，希望在受體細(xì)胞中有較多的拷貝數(shù)。2.構(gòu)建的質(zhì)?？寺≥d體必須含有允許外源DNA片段克隆的位點(diǎn)，并這樣的克隆位點(diǎn)應(yīng)盡可能多。第二十三頁(yè)，共六十五頁(yè)，編輯于2023年，星期五3.構(gòu)建的質(zhì)?？寺≥d體必須含有供選擇克隆子的標(biāo)記基因。4.構(gòu)建的質(zhì)?？寺≥d體DNA分子應(yīng)盡可能小。5.根據(jù)特殊需要，使構(gòu)建的質(zhì)?？寺≥d體中組裝各種元件，構(gòu)建成不同用途的質(zhì)?？寺≥d體。第二十四頁(yè)，共六十五頁(yè)，編輯于2023年，星期五質(zhì)粒的命名

用小寫字母p代表質(zhì)粒（plasmid），在p字母后用兩個(gè)或三個(gè)大寫字母代表發(fā)現(xiàn)這一質(zhì)粒的作者或?qū)嶒?yàn)室名稱，再加上質(zhì)粒編號(hào)。如：pBR322：p表示一種質(zhì)粒，而“BR”則是分別取自該質(zhì)粒的兩位主要構(gòu)建者F.Bolivar和R.L.Rodriguez，322為編號(hào)。第二十五頁(yè)，共六十五頁(yè)，編輯于2023年，星期五選擇標(biāo)記基因：(用于鑒別目的DNA的存在，將成功轉(zhuǎn)化了載體的宿主挑選出來(lái)）

(1)氨芐青霉素抗性基因(amprapr)(2)卡那霉素抗性基因(kanrkmr)(3)四環(huán)素抗性基因（tcrtetr）

(4)氯霉素抗性基因(cmprcmr)(5)新霉素抗性基因（neor）

第二十六頁(yè)，共六十五頁(yè)，編輯于2023年，星期五

pBR322的大小是4361bp的環(huán)狀雙鏈DNA，其堿基序列已經(jīng)全部清楚。是最早應(yīng)用于基因工程的載體之一。含有24種限制酶的單一識(shí)別位點(diǎn)，具有四環(huán)素抗性基因(tetr)和氨芐青霉素抗性基因(ampr)。將質(zhì)粒pSF124中含ampr基因的DNA片段和質(zhì)粒pSC101中含tetr基因的DNA片段同含ColE1復(fù)制起始點(diǎn)(來(lái)源于pMB1、松散型)的DNA片段重組，構(gòu)建成質(zhì)?？寺≥d體pBR322。pBR322第二十七頁(yè)，共六十五頁(yè)，編輯于2023年，星期五第二十八頁(yè)，共六十五頁(yè)，編輯于2023年，星期五普通型載體pBR322的結(jié)構(gòu)圖第二十九頁(yè)，共六十五頁(yè)，編輯于2023年，星期五pBR322

如何篩選？

利用Tetr基因內(nèi)部的BamHI位點(diǎn)來(lái)插入外源DNA片段，可以通過插入失活進(jìn)行篩選。

BamHIG/GATTC第三十頁(yè)，共六十五頁(yè)，編輯于2023年，星期五第三十一頁(yè)，共六十五頁(yè)，編輯于2023年，星期五

經(jīng)重組DNA分子轉(zhuǎn)化處理的受體菌在不含標(biāo)記藥物tc的瓊脂培養(yǎng)基上培養(yǎng)，則含或不含重組DNA分子的受體菌都能長(zhǎng)出菌落。然后取菌落的一部分接種在含tc的瓊脂培養(yǎng)基上，不會(huì)長(zhǎng)出菌落的原菌落才是真正在tcr基因區(qū)插入外源DNA片段的克隆子。

（為什么？）第三十二頁(yè)，共六十五頁(yè)，編輯于2023年，星期五pUC質(zhì)粒pUC質(zhì)粒系列是在pBR322基礎(chǔ)上改建成的；包括pBR322的ampr基因；缺乏控制拷貝數(shù)的rop基因。

第三十三頁(yè)，共六十五頁(yè)，編輯于2023年，星期五pUC的主要優(yōu)點(diǎn)：（1）分子量更小，僅為2686bp，容納外源DNA量增大；具有更高的拷貝數(shù)（每個(gè)細(xì)胞含500-700個(gè)拷貝）。（2）含易于檢測(cè)是否有外源DNA插入的標(biāo)記基因LacZ，可利用-互補(bǔ)原理進(jìn)行藍(lán)白篩選。（3）多克隆位點(diǎn)區(qū)（MCS）由人工合成的多個(gè)單一酶切位點(diǎn)構(gòu)成。

第三十四頁(yè)，共六十五頁(yè)，編輯于2023年，星期五pUC18pUC19含四個(gè)部分：（1）來(lái)自pBR322的質(zhì)粒復(fù)制起點(diǎn)（ori）；（2）ampr;（3）大腸桿菌β半乳糖苷酶基因（lacZ）的啟動(dòng)子及其編碼α-肽鏈的DNA序列；（4）多克隆位點(diǎn)（MCS）lacZ`OriAmprMCS第三十五頁(yè)，共六十五頁(yè)，編輯于2023年，星期五

BlueWhiteampramprInsertInsertNoinsertLacZ`LacZ`第三十六頁(yè)，共六十五頁(yè)，編輯于2023年，星期五λ噬菌體載體

（lambdaphagevector）第三十七頁(yè)，共六十五頁(yè)，編輯于2023年，星期五

把感染細(xì)菌的病毒稱為噬菌體。病毒主要有DNA（或RNA）和外殼蛋白組成。通過感染，病毒顆粒進(jìn)入宿主細(xì)胞。第三十八頁(yè)，共六十五頁(yè)，編輯于2023年，星期五T2噬菌體結(jié)構(gòu)示意圖第三十九頁(yè)，共六十五頁(yè)，編輯于2023年，星期五λ噬菌體的性質(zhì)1λ噬菌體由λDNA和外殼蛋白組成。2在噬菌體中DNA是線性的，全長(zhǎng)48502bp，左右各有12個(gè)核苷酸組成的5’凸出黏性末端，而且是互補(bǔ)的。

5‘GGGCGGCGACCTNN……..NN3’3’NN……..CCCGCCGCTGGA5’

把此末端稱為COS位點(diǎn)(cohesiveendsite)3其有50個(gè)以上基因4有56種限制酶識(shí)別位點(diǎn)5生長(zhǎng)途徑有溶源途徑和溶菌途徑。第四十頁(yè)，共六十五頁(yè)，編輯于2023年，星期五溶菌途徑：噬菌體感染宿主細(xì)胞后，其DNA不插入染色體DNA，經(jīng)過一段時(shí)間的潛伏期，就大量增殖新的病毒顆粒，使宿主細(xì)胞破裂，釋放的病毒顆粒又感染其他細(xì)胞。（左圖示）第四十一頁(yè)，共六十五頁(yè)，編輯于2023年，星期五

溶源途徑：感染宿主細(xì)胞后，其DNA與宿主細(xì)胞染色體DNA整合，一起復(fù)制和傳代，無(wú)感染其他細(xì)胞的能力。（右圖示）第四十二頁(yè)，共六十五頁(yè)，編輯于2023年，星期五裂解循環(huán)溶源態(tài)

λ噬菌體的生長(zhǎng)途徑第四十三頁(yè)，共六十五頁(yè)，編輯于2023年，星期五λ噬菌體的基因組分區(qū)左區(qū)：Nul基因—J基因之間的基因

其產(chǎn)物用于噬菌體DNA的包裝和噬菌體顆粒的形成。

第四十四頁(yè)，共六十五頁(yè)，編輯于2023年，星期五λ噬菌體的基因組分區(qū)中區(qū)：J基因右邊—gam基因之間的基因

溶源狀態(tài)的發(fā)生和維持以及遺傳重組所需要的基因。（外源DNA片段的插入）

第四十五頁(yè)，共六十五頁(yè)，編輯于2023年，星期五λ噬菌體的基因組分區(qū)右區(qū)：gam基因右邊—Rz基因之間的基因

主要用于噬菌體的復(fù)制和裂解宿主菌。

第四十六頁(yè)，共六十五頁(yè)，編輯于2023年，星期五用λ噬菌體作為克隆載體的依據(jù)1它是一種溫和噬菌體。2能承載比較大的外源DNA片段。野生型的頭部能包裝λDNA分子大小75%～105%的DNA片段，約36.4～51kb。3在λDNA分子上有許多限制性酶識(shí)別位點(diǎn)。第四十七頁(yè)，共六十五頁(yè)，編輯于2023年，星期五λDNA的限制性核酸內(nèi)切酶譜（Kb）第四十八頁(yè)，共六十五頁(yè)，編輯于2023年，星期五λ噬菌體載體的構(gòu)建過程1去除非必須區(qū)，建立外源DNA片段的克隆或替換位點(diǎn)；2在λDNA的非必須區(qū)內(nèi)插入選擇標(biāo)記基因

cI基因：它的表達(dá)使噬菌體進(jìn)入溶原狀態(tài)，基因產(chǎn)物活性受到影響會(huì)促進(jìn)噬菌體進(jìn)入裂解循環(huán)。

如果外源DNA片段插入基因cI中，將高效地使hfl突變的E.coli進(jìn)入裂解生長(zhǎng)狀態(tài)。

第四十九頁(yè)，共六十五頁(yè)，編輯于2023年，星期五

3建立重組λDNA分子的體外包裝系統(tǒng)在實(shí)驗(yàn)室重組的λDNA分子，必須經(jīng)過體外包裝成噬菌體顆粒后才有效地感染受體細(xì)胞。

λ噬菌體突變株D-和E-

當(dāng)兩個(gè)突變株分別感染受體細(xì)胞時(shí)，兩者都可復(fù)制λDNA，但不能把復(fù)制合成的λDNA包裝成噬菌體顆粒。二者蛋白混合，能有效地包裝。第五十頁(yè)，共六十五頁(yè)，編輯于2023年，星期五λ噬菌體的主要類型1插入型載體(insertionvector):

通過特定酶切位點(diǎn)允許外源DNA片段插入的載體。外源DNA片段大小0～6

kb。2置換型載體(replacementvector):

允許外源DNA片段替換非必須DNA片段的載體。外源DNA片段大小9～23kb。第五十一頁(yè)，共六十五頁(yè)，編輯于2023年，星期五插入型載體第五十二頁(yè)，共六十五頁(yè)，編輯于2023年，星期五

主要用于cDNA克隆，允許插入的外源DNA片段大小為0～6kb?；騝I內(nèi)的E.coRI位點(diǎn)作為唯一位點(diǎn)，可以用于外源DNA的插入。第五十三頁(yè)，共六十五頁(yè)，編輯于2023年，星期五

主要用于cDNA文庫(kù)、基因組文庫(kù)和表達(dá)融合蛋白。允許插入的外源DNA片段的大小為0～7.2kb?；騦ac5編碼區(qū)終止密碼子之前有一個(gè)E.coRI，可以用于外源DNA的插入。第五十四頁(yè)，共六十五頁(yè)，編輯于2023年，星期五置換型載體

在填充片段兩端有對(duì)稱分布的MCS，這兩個(gè)載體的差別是MCS位點(diǎn)的排列位置相反。第五十五頁(yè)，共六十五頁(yè)，編輯于2023年，星期五

M13噬菌體載體

基因工程中常對(duì)單鏈DNA測(cè)序、制備探針或?qū)嵤┒c(diǎn)突變，應(yīng)用此載體就可以獲得單鏈DNA。第五十六頁(yè)，共六十五頁(yè)，編輯于2023年，星期五第五十七頁(yè)，共六十五頁(yè)，編輯于2023年，星期五

黏粒載體(cosmidvector)基本特征：1是質(zhì)粒的衍生物，是帶有cos位點(diǎn)的質(zhì)粒。2其組成有質(zhì)粒的復(fù)制起點(diǎn)(ColE1)、抗性基因、cos位點(diǎn)、MCS。3大小為5～7kb4能克隆的外源DNA片段最大達(dá)40kb。第五十八頁(yè)，共六十五頁(yè)，編輯于2023年，星期五黏粒載體的特點(diǎn)：（1）具有λ噬菌體的特性（但因不含λ噬菌體的全部必需基因，因此不能通過溶菌周期，無(wú)法形成子代噬菌體顆粒）；（2）具有質(zhì)粒的特性（有質(zhì)粒復(fù)制子及抗菌素基因）；（3）具有高容量的克隆能力（本身僅5-7kb,克隆極限可達(dá)40kb左右）；（4）具有與同源序列質(zhì)粒進(jìn)行重組的能力。