尾加壓素Ⅱ促進(jìn)腎系膜細(xì)胞增殖的細(xì)胞內(nèi)機(jī)制研究

尾加壓素Ⅱ促進(jìn)腎系膜細(xì)胞增殖的細(xì)胞內(nèi)機(jī)制研究【摘要】目的：研究尾加壓素Ⅱ(UⅡ)對腎系膜細(xì)胞(GMC)增殖功能的影響以及細(xì)胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制。方法：①采用［3H］_胸腺嘧啶(3H_TdR)摻入實(shí)驗(yàn)研究UⅡ?qū)MC增殖的影響。②加入不同的細(xì)胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)阻斷劑，觀察UⅡ作用的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路。結(jié)果：UⅡ以濃度［(10-9～10-7)mol/L］依賴的方式促進(jìn)GMC3H_TdR摻入，分別較對照組高%、%和%()。UⅡ刺激3H_TdR摻入的效應(yīng)能夠被L_鈣通道阻斷劑尼卡地平、鈣調(diào)素激酶(CaM_PK)阻斷劑W7和蛋白激酶C(PKC)阻斷劑H7所抑制，抑制率分別為%、%和%()。絲裂素活化蛋白激酶阻斷劑PD98059雖能輕度抑制UⅡ效應(yīng)，但無統(tǒng)計學(xué)意義()。結(jié)論：UⅡ明顯促進(jìn)GMC增殖，該效應(yīng)與胞外Ca2+內(nèi)流、CaM_PK以及PKC有關(guān)，并提示UⅡ可能在腎纖維化發(fā)生和發(fā)展過程中發(fā)揮著重要作用。

【關(guān)鍵詞】腎系膜細(xì)胞增殖尾加壓素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)

MechanismsofProliferationEffectofUrotensinⅡonGlomerularMesangialCellsofRats

ZHANGYong_gang，WEIRui_hong，LIYu_guang，PANGYong_zheng，TANGChao_shu

(DepartmentofCardiovascularDiseases,TheFirstAffiliatedHospital,ShantouUniversityMedicalCollege,Shantou515041,China；Departmentofinternalmedicine,TheSecondAffiliatedHospital,ShantouUniversityMedicalCollege,Shantou515041,China；InstituteofCardiovascularResearch,PekingUniversityFirstHospital,Beijing100034,China)

［Abstract］Objective:ToinvestigatetheproliferationeffectofurotensinⅡ(UⅡ)onglomerularmesangialcells(GMC)ofrats，andtostudythesignaltransductionpathways.Methods:GMCproliferationwasexaminedbytheincreasein3H_thymidine(3H_TdR)incorporationintoDNA.DifferentinhibitorswereusedtostudythesignaltransductionpathwaysinvolvedintheeffectofUⅡ.Results:UⅡ［(10-9～10-7)mol/L］induced3H_TdRincorporationinaconcentration_dependentmanner,whichwasincreasedby%,%and%()in10-9,10-8and10-7mol/Lgroups,respectively,comparedwiththecontrolgroup.TheCa2+channelblockernicardipine(10-5mol/L),proteinkinaseC(PKC)inhibitorH7(10-5mol/L)andCaM_PKinhibitorW7(10-5mol/L)significantlyinhibitedtheeffectofUⅡ,whichwasdecreasedby%、%和%(),comparedwiththeUⅡgroup(10-8mol/L).Howe_ver,PD98059(10-5mol/L),aninhibitorofmitogen_activatedproteinkinase,couldntinhibittheeffect.Conclusion:UⅡcanstimulateGMCproliferation,throughCa2+,PKCandCaM_PKsignaltransductionpathways,andmayplayimportantrolesinthedevelopmentofrenalfibrosis．

［KeyWords］glomerularmesangialcell;proliferation;urotensinⅡ;signaltransduction

尾加壓素Ⅱ(UrotensinⅡ,UⅡ)是一種近年在哺乳動物體內(nèi)發(fā)現(xiàn)的強(qiáng)力縮血管活性肽［1，2］，它及其受體GPR14主要分布在神經(jīng)系統(tǒng)［3］、心血管系統(tǒng)［2］和腎臟組織［4～6］。研究表明，UⅡ在高血壓、再狹窄、心力衰竭等心血管疾病、腎臟疾病以及糖尿病等疾病過程中發(fā)揮重要作用［7～12］。除縮血管活性外，UⅡ還是一種強(qiáng)烈的絲裂原，能夠促進(jìn)血管平滑肌細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、心肌成纖維細(xì)胞增殖，從而通過促絲裂作用加速疾病的發(fā)生和發(fā)展［13～15］。然而，UⅡ在腎臟疾病中的病理、生理作用及其機(jī)制尚不明確。為此，我們在體外培養(yǎng)的大鼠腎系膜細(xì)胞(Glomerularmesangialcells，GMC)上探討UⅡ刺激細(xì)胞增殖的作用及其細(xì)胞內(nèi)機(jī)制。

1材料與方法

材料

SD大鼠由北京大學(xué)醫(yī)學(xué)部實(shí)驗(yàn)動物部提供(中國)，大鼠UⅡ(純度%)為PhoenixPharmInc產(chǎn)品(美國)。RPMI1640培養(yǎng)基、鈣通道阻斷劑尼卡地平(NI)、蛋白激酶C(PKC)抑制劑H7、鈣調(diào)素激酶阻斷劑W7以及絲裂素活化蛋白激酶(MAPK)阻滯劑PD98059為Sigma公司(美國)產(chǎn)品，3H_胸腺嘧啶(3H_TdR)為AmershamPharmaciaBiotech公司(德國)產(chǎn)品，余為市售分析純試劑。

方法

大鼠腎小球分離和GMC培養(yǎng)見參考文獻(xiàn)［16］。

3H_TdR摻入實(shí)驗(yàn)［13］將培養(yǎng)的細(xì)胞用/L胰酶消化并制成細(xì)胞懸液，以2×104/孔接種于24孔板，貼壁培養(yǎng)24h后，換為乏血清培養(yǎng)(體積分?jǐn)?shù)1%血清)24h，使細(xì)胞處于G0期，加入不同濃度的UⅡ培養(yǎng)12h，然后加入3H_TdR(37kBq/孔)繼續(xù)培養(yǎng)12h，用Millipore抽濾，收集于玻璃纖維膜上，用體積分?jǐn)?shù)10%高氯酸破碎細(xì)胞，PBS沖洗，濾膜干燥后加入閃爍劑(PPO/POPOP/二甲苯/無水乙醇)，用液閃儀(Beckman公司，德國)檢測3H放射性強(qiáng)度，結(jié)果以cpm表示。

實(shí)驗(yàn)分組以不同濃度UⅡ?qū)MC3H_TdR摻入的影響分為①對照組，②UⅡ_1組(10-10mol/L)，③UⅡ_2組(10-9mol/L),④UⅡ_3組(10-8mol/L),⑤UⅡ_4組(10-7mol/L)。以不同信號途徑阻斷劑對UⅡ效應(yīng)的影響分為①對照組(不加任何處理因素)，②UⅡ組(只加UⅡ，濃度10-8mol/L，下同)，③UⅡ+NI(10-5mol/L)組，④UⅡ+H7(10-6mol/L)組，⑤UⅡ+W7(10-6mol/L)組，⑥UⅡ+PD98059(10-5mol/L)組。

統(tǒng)計學(xué)處理數(shù)據(jù)以±s表示，用方差分析組間q檢驗(yàn)。

2結(jié)果

UⅡ?qū)MC3H_TdR摻入的影響

UⅡ以濃度［(10-9～10-7)mol/L］依賴性方式促進(jìn)GMC3H_TdR摻入，以UⅡ_4組刺激作用尤為明顯。UⅡ2～4組3H_TdR摻入量分別較對照組高%，%和%()。而UⅡ_1組摻入量與對照組比無統(tǒng)計學(xué)意義(，表1)。

表1UⅡ?qū)MC3H_TdR摻入的影響

Table1EffectofUⅡon3H_TdRincorporationintoGMCofrats

與對照組比1)

不同信號轉(zhuǎn)導(dǎo)阻斷劑對UⅡ作用的影響

UⅡ組3H_TdR摻入量較對照組高％()。Ni、H7以及W7能明顯抑制UⅡ3H_TdR摻入，其抑制率分別為%、%和%()，PD98059不能夠明顯影響UⅡ的作用(，表2)。

表2細(xì)胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)阻斷劑對UⅡ刺激GMC3H_TdR摻入的影響

Table2Effectsofdifferentsignaltransductioninhibitorsonproli_ferationofratsGMCinducedbyUⅡ

與對照組比1)；與UⅡ組比2)

3討論

UⅡ是繼ET_1之后發(fā)現(xiàn)的又一新的縮血管活性肽，它能夠收縮哺乳動物的大中動脈血管、氣道和腸道平滑肌，收縮離體心肌組織，并有促絲裂作用，能刺激血管內(nèi)皮細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞、氣道平滑肌細(xì)胞以及腫瘤細(xì)胞增殖，誘導(dǎo)心肌細(xì)胞肥大［9］。我們曾在離體孵育的大鼠主動脈組織上發(fā)現(xiàn)，UⅡ能以劑量依賴性方式激活NO合酶，尤其是血管固有型NO合酶，增加血管NO生成，促進(jìn)血管外膜精氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)［17,18］。我們曾報道慢性缺氧致肺動脈高壓大鼠心肌UⅡ含量以及UⅡ受體結(jié)合位點(diǎn)明顯升高［19］，最近發(fā)現(xiàn)UⅡ能夠協(xié)同異丙腎上腺素所致心肌肥大和心肌纖維化過程［20］。有學(xué)者報道腎功能衰竭患者和糖尿病腎功能衰竭患者UⅡ表達(dá)明顯升高［21］，提示UⅡ可能在腎臟功能穩(wěn)態(tài)調(diào)節(jié)以及疾病發(fā)生中發(fā)揮重要作用，然而其作用機(jī)制尚不完全清楚。

本研究在體外培養(yǎng)的GMC上，采用3H_TdR摻入法，發(fā)現(xiàn)UⅡ能夠以濃度依賴的方式促進(jìn)細(xì)胞3H_TdR摻入增加，促進(jìn)細(xì)胞增殖。該作用能夠分別被Ca2+通道阻斷劑NI、鈣調(diào)素激酶阻斷劑W7以及PKC抑制劑H7所阻斷，提示凡影響胞漿Ca2+水平上的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，即L_鈣通道、CaM_PK以及PKC都能夠影響對GMC的促增殖效應(yīng)。然而，PD98059不影響UⅡ的效應(yīng)，提示受體酪氨酸激酶_MAPK細(xì)胞增殖途徑可能不是UⅡ促GMC增殖的主要途徑。UⅡ的病理、生理意義及其作用機(jī)制是近年的研究熱點(diǎn)之一。我們在國內(nèi)首先報道了UⅡ的促絲裂效應(yīng)。在培養(yǎng)的血管平滑肌細(xì)胞上，發(fā)現(xiàn)UⅡ能夠促進(jìn)細(xì)胞增殖，該作用需通過Ca2+、PKC、CaM_PK以及MAPK來實(shí)現(xiàn)［13］。我們還發(fā)現(xiàn)UⅡ能夠促進(jìn)新生乳鼠心肌成纖維細(xì)胞增殖和膠原分泌，其增殖效應(yīng)與細(xì)胞外Ca2+內(nèi)流、CaM_PK以及PKC激活有關(guān)，而促膠原合成作用可能通過其它途徑來實(shí)現(xiàn)［22］。在慢性缺血所致肺動脈高壓右心肥大大鼠上，我們發(fā)現(xiàn)右心室UⅡ以及受體結(jié)合位點(diǎn)明顯上調(diào)，而血漿UⅡ水平并無明顯變化，提出UⅡ可能主要以自分泌和旁分泌作用方式發(fā)揮效應(yīng)這一觀點(diǎn)［19］。上述結(jié)果進(jìn)一步被其他學(xué)者所證實(shí)［4,9］。最近我們還發(fā)現(xiàn)UⅡ能夠通過Ca2+、PKC以及MAPK途徑刺激大鼠主動脈組織合成和釋放內(nèi)皮素_1［23］。一系列研究表明，UⅡ可通過GPR14受體、Ca2+、c_Src、PKC、MAPK和ROCK途徑參與平滑肌細(xì)胞增殖以及促進(jìn)巨噬細(xì)胞向泡沫細(xì)胞轉(zhuǎn)化［9］，并且MAPK途徑激活還參與了UⅡ促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞增殖的過程［14］。而本研究則證實(shí)UⅡ還能夠通過激活L_鈣通道、鈣調(diào)素以及PKC途徑刺激GMC的增殖。這與UⅡ促進(jìn)心肌成纖維細(xì)胞的作用機(jī)制相近，但仍有待于進(jìn)一步研究。

GMC是腎小球固有細(xì)胞，正常情況下GMC生長和分裂速度都很慢。但在病理情況下，生長和抑制失衡，GMC增殖活躍，產(chǎn)生大量細(xì)胞外基質(zhì)，最終導(dǎo)致腎小球硬化和腎纖維化、腎功能進(jìn)行性下降。許多因素能夠促進(jìn)GMC活化，使之發(fā)生表型轉(zhuǎn)化并異常增殖，分泌細(xì)胞外基質(zhì)和活性因子、炎性介質(zhì)等，促使病變的發(fā)生和發(fā)展。本研究發(fā)現(xiàn)UⅡ能夠促進(jìn)GMC增殖，提示UⅡ可能在腎小球炎癥與硬化等疾病的發(fā)病過程中發(fā)揮重要作用。

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