新冠病毒疫苗專題報告-mRNA疫苗究竟是“何方神圣”

新冠病毒疫苗專題報告：mRNA疫苗究竟是“何方神圣”？什么是mRNA疫苗？mRNA疫苗的組成mRNA又稱為信使RNA，在遺傳過程中充當(dāng)DNA與蛋白質(zhì)之間的橋梁。顧名思義，mRNA疫苗就是以病原體抗原蛋白對應(yīng)的mRNA結(jié)構(gòu)為基礎(chǔ)，通過不同的遞送方式遞送至人體細(xì)胞內(nèi)，經(jīng)翻譯后能刺激細(xì)胞產(chǎn)生抗原蛋白、引發(fā)機體特異性免疫反應(yīng)的疫苗產(chǎn)品。mRNA疫苗的發(fā)現(xiàn)始于20世紀(jì)90年代，美國科學(xué)家JonWolff團(tuán)隊將體外合成的mRNA經(jīng)肌肉注射至小鼠骨骼肌內(nèi)，發(fā)現(xiàn)在骨骼肌細(xì)胞內(nèi)有特定表達(dá)的蛋白生成，產(chǎn)生免疫反應(yīng)。之后，mRNA相關(guān)診療方式開始研究應(yīng)用。起初，mRNA因其高免疫原性、低穩(wěn)定性和生產(chǎn)制備的局限性受到限制。近年來隨著mRNA合成、化學(xué)修飾和遞送技術(shù)的發(fā)展，mRNA的穩(wěn)定性和翻譯效率大幅提高，免疫原性逐步可控，在腫瘤免疫治療領(lǐng)域和突發(fā)傳染病領(lǐng)域顯示出巨大的商業(yè)價值。mRNA疫苗是如何發(fā)揮作用的？mRNA疫苗是通過以下步驟發(fā)揮免疫作用：

（1）基于已獲得的病原體抗原序列制備出對應(yīng)的mRNA，通過各種脂質(zhì)體遞送載體包裹mRNA；

（2）將其注射至人體；

（3）mRNA在細(xì)胞內(nèi)釋放表達(dá)抗原蛋白，人體的免疫系統(tǒng)會識別這些特異性抗原，刺激人體產(chǎn)生免疫反應(yīng)。mRNA疫苗技術(shù)的優(yōu)勢在哪里？疫苗研發(fā)的技術(shù)路線有哪些？傳統(tǒng)的滅活和減毒疫苗：優(yōu)點是免疫力持久、產(chǎn)量相對較高，但研發(fā)速度慢、篩選難度高，針對新型傳染病抗原體存在未知的不良反應(yīng)以及高風(fēng)險。重組蛋白疫苗（基因工程亞單位疫苗的一種）：是將可以表達(dá)病毒表面抗原的基因序列通過基因工程方式轉(zhuǎn)入原核生物等表達(dá)系統(tǒng)中，在其表達(dá)抗原蛋白后進(jìn)行提取純化進(jìn)而用于接種。優(yōu)點在于生產(chǎn)工藝非常成熟，安全性和穩(wěn)定性都很好；缺點是免疫原性相對較弱、需要添加佐劑，且生產(chǎn)工藝較為復(fù)雜。重組蛋白疫苗是目前最為常用的疫苗開發(fā)技術(shù)，多個疫苗大品種是采用這個技術(shù)路線進(jìn)行開發(fā)。病毒載體疫苗（基因工程活載體疫苗）：利用非致病性微生物搭載編碼抗原蛋白的基因序列，直接遞送至人體內(nèi)，利用人體細(xì)胞生產(chǎn)病毒抗原并引起機體的特異性免疫反應(yīng)。病毒載體疫苗具有相關(guān)的突發(fā)傳染病疫苗的成功經(jīng)驗，目前的代表性品種是埃博拉病毒疫苗。核酸疫苗（包括DNA疫苗、mRNA疫苗）：

將編碼抗原蛋白的基因序列與相關(guān)載體組合，直接遞送至人體內(nèi)，利用人體細(xì)胞生產(chǎn)病毒抗原蛋白并引起機體的特異性免疫反應(yīng)。DNA疫苗和mRNA疫苗在遞送方式相對簡單，且不會因為載體而引發(fā)機體免疫反應(yīng)。但目前尚無用于人體的疫苗產(chǎn)品獲批上市，因此對于該類疫苗的認(rèn)知尚不夠充分。mRNA疫苗的優(yōu)勢和特點？相比于第一二代疫苗，mRNA疫苗具有研發(fā)周期短（3-5年）、相對安全性、免疫應(yīng)答時間長、生產(chǎn)周期短（40天）等優(yōu)勢?！秏RNA疫苗的開發(fā)及臨床研究進(jìn)展》等文獻(xiàn)認(rèn)為，mRNA疫苗保持了DNA疫苗能夠表達(dá)胞內(nèi)抗原的優(yōu)點，同時克服了其免疫原性低、可能產(chǎn)生抗載體的非特異性免疫的缺點，且沒有整合到宿主DNA的風(fēng)險。但同時，mRNA疫苗的應(yīng)用需要解決其穩(wěn)定性較差、容易被降解的問題。mRNA疫苗的生產(chǎn)流程和關(guān)鍵技術(shù)點是什么？mRNA疫苗的生產(chǎn)流程mRNA疫苗的生產(chǎn)流程包括mRNA的合成修飾、遞送和放大生產(chǎn)三個部分。其中，最核心的開發(fā)難點和關(guān)鍵技術(shù)點在于合成修飾（提高mRNA分子的穩(wěn)定性，防降解）和遞送系統(tǒng)（提高進(jìn)入人體細(xì)胞的效率，使得產(chǎn)生抗原刺激人體產(chǎn)生免疫反應(yīng)）。mRNA的合成修飾——提高穩(wěn)定性

（1）利用基因工程制備出用于轉(zhuǎn)錄的質(zhì)粒DNA，以編碼特定mRNA序列，關(guān)系到mRNA的穩(wěn)定性。一般質(zhì)粒DNA的分子結(jié)構(gòu)包括5’帽子結(jié)構(gòu)（Cap），5’非翻譯區(qū)（UTR），信號肽區(qū)（SP），編碼病原體抗原蛋白的開放閱讀框(ORF)、里面包括抗原目的基因DNA（GOI）的配對序列，3’非翻譯區(qū)（UTR）和多聚腺苷酸Poly(A)尾巴結(jié)構(gòu)。其中5’帽子結(jié)構(gòu)和多聚腺苷酸Poly(A)尾巴結(jié)構(gòu)用以增強mRNA疫苗的穩(wěn)定性，使其可以在在5-25℃中暴露數(shù)周至36個月仍能保持其全部生物活性。通過修飾5’非翻譯區(qū)和3’非翻譯區(qū)結(jié)構(gòu)可以增強mRNA疫苗的半衰期，延長疫苗的作用時間。

（2）以DNA為模板轉(zhuǎn)錄RNA，獲得初始的mRNA分子。

（3）將帽子結(jié)構(gòu)（Cap）添加至mRNA的5’端完成mRNA的合成，提高mRNA的穩(wěn)定性；

（4）將合成的mRNA放入色譜柱中進(jìn)行純化，除去雜質(zhì)。mRNA的遞送——提高免疫效果

（1）利用載體遞送：早期mRNA疫苗主要利用病毒作為載體進(jìn)行遞送，但由于病毒本身也會刺激人體產(chǎn)生免疫反應(yīng)，可能會限制其運載能力。近年來非病毒載體如脂質(zhì)體納米顆粒（LNPs）、樹狀大分子、無機納米粒子、陽離子細(xì)胞穿膜肽等應(yīng)用廣泛。其中，脂質(zhì)體納米顆粒（LNPs）具有獨特的優(yōu)勢：1）為球形囊泡，可將mRNA包裹在內(nèi)，防止核酸酶的水解。2）結(jié)構(gòu)類似于細(xì)胞膜的脂質(zhì)雙分子層，易與細(xì)胞融合，轉(zhuǎn)染效率高。3）載樣量大，可遞送各種大小片段的mRNA。4）不具有生物特性，不產(chǎn)生免疫反應(yīng)。因此，脂質(zhì)體遞送是目前最常用的mRNA疫苗遞送手段。

（2）原位注射：是直接將裸露的mRNA注射在皮下、淋巴結(jié)、瘤內(nèi)等部位。

（3）物理遞送：除了以上兩種方法，還有使用物理方法使得mRNA穿透細(xì)胞膜，比如電基因槍、電穿孔法等。mRNA疫苗主要應(yīng)用在哪些領(lǐng)域？抗腫瘤mRNA疫苗抗腫瘤mRNA疫苗根據(jù)作用機理一般分為兩類，基于樹突狀細(xì)胞（DC）給藥的mRNA疫苗和直接注射的mRNA疫苗。（1）DC疫苗：通過體外轉(zhuǎn)錄后的mRNA轉(zhuǎn)染至DC后，在細(xì)胞質(zhì)中翻譯形成抗原，和DC細(xì)胞作用激活DC細(xì)胞。將已激活的DC細(xì)胞注入人體，激發(fā)體內(nèi)免疫系統(tǒng)應(yīng)答，達(dá)到殺死腫瘤細(xì)胞的目的。（2）直接注射的mRNA疫苗：以粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子（GM-CSF）作為佐劑，將編碼相關(guān)抗原的mRNA皮下注射入患者體內(nèi)，從而刺激機體產(chǎn)生抗原抗體，抑制癌細(xì)胞的增長。目前臨床上抗腫瘤mRNA疫苗主要有ModernaTherapeutics、BioNTechSE及CureVacAG三家企業(yè)在研，其中Moderna的針對實體瘤的mRNA-4157與BioNTech的針對轉(zhuǎn)移性黑色素瘤的BNT122進(jìn)展最快，均已開展臨床Ⅱ期試驗。傳染病mRNA疫苗針對傳染性病原體開發(fā)預(yù)防性疫苗是控制和阻止流行病大規(guī)模爆發(fā)的關(guān)鍵。傳統(tǒng)的疫苗通常建立在整個病毒株的基礎(chǔ)之上，包括減毒疫苗、滅活疫苗，也有基于病毒蛋白亞單位的重組蛋白疫苗。雖然這些傳統(tǒng)疫苗在許多疾病的預(yù)防上起到了重要作用，但是面對急性暴發(fā)的傳染病，例如此次的新型冠狀病毒，傳統(tǒng)疫苗的研發(fā)和生產(chǎn)周期太長，難以滿足控制疫情的需要，因此我們需要更加有效、更加通用的疫苗開發(fā)平臺，而mRNA疫苗就是破局的一個潛在方案。mRNA疫苗能夠靶定病毒的保守區(qū)域，直接在細(xì)胞中表達(dá)產(chǎn)生特定抗原，激活機體的免疫應(yīng)答產(chǎn)生抗體，從而達(dá)到預(yù)防傳染性疾病的目的。目前開發(fā)的傳染病mRNA疫苗主要針對流感、呼吸道合胞病毒RSV、HIV等，其中進(jìn)度最快的為Moderna針對巨細(xì)胞病毒的mRNA-1647，處于臨床Ⅱ期。此外，針對2019年新冠病毒也開發(fā)了相關(guān)疫苗。針對罕見病的mRNA疫苗除腫瘤和傳染性病外，mRNA疫苗同樣應(yīng)用于罕見病治療領(lǐng)域，如Moderna公司用于治療甲基丙二酸血癥（MMA）的mRNA-3704和治療丙酸血癥（propionicacidemia，PA）的mRNA-3927等。mRNA-3927項目：丙酸血癥是一種罕見的遺傳性代謝紊亂，由線粒體酶丙酰輔酶A羧化酶（PCC）缺陷所致，患者呈現(xiàn)包括肌肉張力弱、喂養(yǎng)不良、嘔吐以及更嚴(yán)重的心臟異常，癲癇和昏迷等癥狀。重癥患者唯一有效的治療方法是肝臟移植。由于PCC酶的復(fù)雜性需要線粒體定位，目前還沒有批準(zhǔn)可治療丙酸血癥的根治性療法。mRNA-3927通過編碼線粒體酶丙酰輔酶A羧化酶的α和β亞基，經(jīng)由脂質(zhì)納米顆粒遞送進(jìn)患者體內(nèi)，嘗試使機體恢復(fù)PCC酶表達(dá)功能。該產(chǎn)品計劃在美國和歐洲啟動一項開放標(biāo)簽、多中心、劑量遞增Ⅰ/Ⅱ期臨床試驗。mRNA疫苗的臨床安全性如何？部分產(chǎn)品已公布臨床Ⅰ期數(shù)據(jù)，顯示良好的耐受性和安全性CureVac公司的mRNA腫瘤疫苗BI1361849(CV9202)I(b)期數(shù)據(jù)：在入組的26位患者中僅有4位患者（15.4%）出現(xiàn)了≥3級不良反應(yīng)事件(AEs)，其中兩例為疲勞癥狀，一例吞咽困難，一例出現(xiàn)發(fā)熱癥狀。達(dá)到預(yù)先設(shè)定患者的≥3級不良反應(yīng)事件率≤30%的主要終點，且沒有患者出現(xiàn)免疫細(xì)胞因子風(fēng)暴或死亡等臨床緊急不良反應(yīng)事件(TEAEs)。試驗達(dá)到主要終點。Moderna公司的針對H10N8流感的mRNA疫苗臨床Ⅰ期數(shù)據(jù)：201位受試者中有124位(61.7%)出現(xiàn)了上呼吸道感染，背痛，咽炎和口痛等輕微不良反應(yīng)，沒有嚴(yán)重不良反應(yīng)事件(SAEs)發(fā)生。試驗達(dá)到主要終點。Moderna公司的針對H7N9流感的mRNA疫苗（mRNA-1851）臨床Ⅰ期數(shù)據(jù)：156位受試者中僅有4例嚴(yán)重的不良反應(yīng)事件發(fā)生(SAEs)。兩例丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶升高，一例天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶升高，一例出現(xiàn)血小板數(shù)目減少。但這些指標(biāo)異常的受試者均沒有表現(xiàn)出癥狀，無需干預(yù)便恢復(fù)正常了。試驗達(dá)到主要終點。mRNA疫苗國內(nèi)外主要企業(yè)有哪些？ModernaTherapeutics：行業(yè)先行者，獲批首個新冠病毒mRNA疫苗臨床Moderna公司創(chuàng)立于2010年，創(chuàng)始人團(tuán)隊來自哈佛，被稱為mRNA藥物開發(fā)的先行者。公司專注于mRNA藥物研發(fā)，涵蓋傳染病，腫瘤，心血管疾病和罕見遺傳疾病等領(lǐng)域。自2014年開啟第一個項目以來，Moderna和默克、、Vertex等戰(zhàn)略合作伙伴推進(jìn)24項研發(fā)項目，其中12項已進(jìn)入臨床研究，進(jìn)度最快的為針對實體瘤的治療性腫瘤疫苗mRNA-4157與針對巨細(xì)胞病毒的預(yù)防性疫苗mRNA-1647，處于臨床Ⅱ期。目前針對新型冠狀病毒的mRNA疫苗研發(fā)進(jìn)度最快的便是Moderna公司開發(fā)的mRNA-1273，針對新型冠狀病毒表面刺突蛋白（S蛋白）。3月11日獲批進(jìn)入臨床Ⅰ期（NCT04283461）。此臨床試驗旨在評估3種劑量的mRNA-1273疫苗接種對健康成人的安全性和免疫原性，以28天的時間間隔接種兩次。參考目前公布的臨床試驗方案，預(yù)計有望在2020年6月完成全部受試者接種，2021年6月完成整體臨床試驗。BioNTech：4大免疫療法平臺，進(jìn)度最快的產(chǎn)品已進(jìn)入臨床Ⅱ期BioNTechSE成立于2008年，結(jié)合了免疫學(xué)、尖端治療平臺以及各種患者分析和生物信息學(xué)工具，開發(fā)針對癌癥以及其他疾病的個體化免疫療法。BioNTech擁有四大技術(shù)平臺，mRNA療法平臺、細(xì)胞和基因治療平臺、蛋白質(zhì)療法平臺和小分子治療平臺，涵蓋腫瘤、傳染病和罕見疾病等治療領(lǐng)域。臨床管線主要集中在mRNA腫瘤治療方面，其中與Genentech公司聯(lián)合開發(fā)的個體化mRNA腫瘤疫苗iNeST（BNT122）和免疫檢查點抑制劑聯(lián)用治療轉(zhuǎn)移性黑素瘤進(jìn)展最快，處于臨床Ⅱ期。在新型冠狀病毒mRNA疫苗研發(fā)方面，BioNTech新冠病毒候選疫苗BNT162已與、分別達(dá)成開發(fā)合作協(xié)議。臨床試驗預(yù)計有望在4月下旬啟動。CureVacAG：老牌mRNA疫苗研發(fā)企業(yè)，3個產(chǎn)品進(jìn)入臨床Ⅰ期CureVac成立于2000年，是最早利用mRNA進(jìn)行疾病預(yù)防和治療的生物制藥公司。公司擁有4種RNA技術(shù)平臺：RNActive、RNArt、RNAntibody和RNAdjuvant，專注于開發(fā)針對腫瘤、罕見病和傳染性疾病的療法mRNA療法。2017年10月，與CureVac簽署18億美金的合作協(xié)議，開發(fā)新型mRNA癌癥疫苗。目前公司針對黑色素瘤等的腫瘤疫苗CV8102、針對非小細(xì)胞肺癌的腫瘤疫苗CV9202和針對狂犬病病毒的預(yù)防性疫苗CV7202均已進(jìn)入臨床Ⅰ期。CureVac的新冠病毒疫苗處于臨床前研發(fā)階段，預(yù)計到2020年6-7月申報進(jìn)入臨床試驗。國內(nèi)mRNA疫苗領(lǐng)先企業(yè)——斯微（上海）生物科技有限公司斯微生物2016年5月在上海成立，是國內(nèi)領(lǐng)先的mRNA藥物研發(fā)創(chuàng)新型企業(yè)，專注于利用自主知識產(chǎn)權(quán)的脂質(zhì)多聚物納米載體技術(shù)平臺

（LPP/mRNA?）進(jìn)行創(chuàng)新mRNA藥物的研究和開發(fā)，治療領(lǐng)域包括癌癥、傳染病、蛋白缺陷類疾病和遺傳病等治療領(lǐng)域。2020年2月5日，公告出資1000萬元參與斯微生物的A+輪融資并獲得其2.86%的股權(quán)。公司與同濟(jì)大學(xué)附屬東方醫(yī)院轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)平臺合作，快速推動新型冠狀病毒m