體外誘導(dǎo)人臍帶血間充質(zhì)干細(xì)胞為軟骨細(xì)胞的初步研究

體外誘導(dǎo)人臍帶血間充質(zhì)干細(xì)胞為軟骨細(xì)胞的初步研究【摘要】目的探討胰島素樣生長(zhǎng)因子-1(IGF-1)體外誘導(dǎo)人臍帶血間充質(zhì)干細(xì)胞(MSCs)向軟骨細(xì)胞分化的可能性。方法由人臍靜脈獲得MSCs，純化培養(yǎng)后用含100ng/mlIGF-1的培養(yǎng)基誘導(dǎo)，掃描電鏡鑒定誘導(dǎo)后細(xì)胞。結(jié)果來(lái)源于臍血的單個(gè)核細(xì)胞經(jīng)體外培養(yǎng)貼壁后出現(xiàn)形態(tài)學(xué)上可見(jiàn)間充質(zhì)樣的細(xì)胞，間充質(zhì)樣細(xì)胞為類似成纖維樣的細(xì)胞形態(tài)。IGF-1誘導(dǎo)16天后，MSCs開(kāi)始呈現(xiàn)軟骨細(xì)胞特點(diǎn)。結(jié)論人臍帶血MSCs可在體外經(jīng)IGF-1誘導(dǎo)為軟骨細(xì)胞。

【關(guān)鍵詞】胎血間質(zhì)干細(xì)胞軟骨細(xì)胞細(xì)胞分化胰島素樣生長(zhǎng)因子Ⅰ

Abstract:ObjectiveToexplorethefeasibilityofmesenchymalstemcells(MSCs)fromhumanumbilicalcordblood(HUCB)differentiatingintochondrocytesinvitro.MethodsMSCsisolatedfromHUCBwithPercolldensitygradientsolutionwereculture-expandedbecausethecellsattachedandgrewondishes,thenMSCswereinducedwith100ng/mlinsulin-likegrowthfactorⅠ(IGFⅠ).Thedifferentiatedcellswereidentifiedbyusingscanningelectronmicroscope(SEM).ResultsTheHUCB-derivedmononuclearcells,whensetinculture,gaverisetoadherentcells,whichexhibitedeitherafibroblast-likeormesenchymal-likephenotype.16daysafterIGFⅠmediumtreatment,MSCsinmonolayerculturesexhibitedachondrocyticphenotype.ConclusionMSCscanbeculturedanddifferentiatedintochondrocytesinducedbyIGFⅠinvitro.

Keywords:fetalblood;mesenchymalstemcells;chondrocytes;celldifferentiation;insulin-likegrowthfactorI

間充質(zhì)干細(xì)胞(mesenchymalstemcells,MSCs)作為一種多潛能干細(xì)胞，因其成功避開(kāi)了胚胎干細(xì)胞來(lái)源缺乏、異體排斥、道德倫理等諸多問(wèn)題在實(shí)驗(yàn)研究和臨床應(yīng)用中的限制，近年來(lái)已成為干細(xì)胞領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)。其不僅支持造血系統(tǒng)，還可向中胚層和外胚層來(lái)源的組織分化，在一定的實(shí)驗(yàn)條件控制下可分化為肌細(xì)胞、成骨細(xì)胞、脂肪細(xì)胞、神經(jīng)細(xì)胞、肝細(xì)胞、心肌細(xì)胞等［1～3］。目前，MSCs主要來(lái)源于骨髓，但由于骨髓源性MSCs存在高度病毒污染的可能，且隨著年齡增長(zhǎng)其細(xì)胞數(shù)量和擴(kuò)增、分化能力出現(xiàn)明顯下降趨勢(shì)，故尋找一種能替代骨髓MSCs，并可彌補(bǔ)其缺陷的MSCs來(lái)源，已越來(lái)越受到各國(guó)學(xué)者的關(guān)注。人臍帶血是胎兒出生時(shí)臍帶內(nèi)及胎盤(pán)近胎兒一側(cè)血管內(nèi)的血液，含有豐富的干細(xì)胞，主要包含造血干細(xì)胞和MSCs。臍帶血中的MSCs可在體外培養(yǎng)，誘導(dǎo)分化后能成為神經(jīng)細(xì)胞、心肌細(xì)胞等［4,5］。隨著組織工程學(xué)研究的深入，對(duì)于相關(guān)功能細(xì)胞研究逐漸擴(kuò)展到干細(xì)胞領(lǐng)域，MSCs對(duì)軟骨組織修復(fù)有重要意義，本實(shí)驗(yàn)主要探索人臍帶血MSCs的分離培養(yǎng)以及分析其向軟骨細(xì)胞分化的可行性。

1材料和方法

材料

主要試劑和儀器：Dulbecco改良培養(yǎng)基、胎牛血清均為HYCLONE公司產(chǎn)品；胰島素樣生長(zhǎng)因子-1；Percoll分離液；其它試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純?cè)噭?。CO2培養(yǎng)箱；AE31型倒置顯微鏡；Apollo300型掃描電子顯微鏡。

方法

臍帶血MSCs的分離培養(yǎng)

從無(wú)妊娠并發(fā)癥足月分娩的臍靜脈穿刺抽取15ml臍帶血，肝素抗凝，加等量磷酸緩沖液稀釋，取50ml離心管，先加入15ml密度g/ml的Percoll梯度分離液，小心加入稀釋后的臍帶血，2000r/min離心25min后，用吸管吸取分層界面的白色環(huán)形絮狀物，洗滌離心2次，沉積細(xì)胞用含15％胎牛血清、100u/ml青霉素、100u/ml鏈霉素的DMEM高糖培養(yǎng)基懸浮，調(diào)整細(xì)胞密度為1×106個(gè)/ml，接種于25T的培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)，放置在37℃、5％CO2、飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。孵育72h后更換培養(yǎng)基，去除紅細(xì)胞及其它未貼壁細(xì)胞，以后視細(xì)胞生長(zhǎng)情況平均3～4天換液1次。

臍帶血MSCs傳代培養(yǎng)

MSCs約于7周相互匯合達(dá)到培養(yǎng)瓶底70％～80％的生長(zhǎng)表面，此時(shí)進(jìn)行傳代培養(yǎng)。倒掉舊培養(yǎng)基，加入2ml％的胰酶消化，作用30s后棄掉大部分，留置少許于瓶中，適當(dāng)用力振蕩培養(yǎng)瓶，整瓶細(xì)胞放入培養(yǎng)箱中5min，在倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞解離程度，以細(xì)胞突起縮回，細(xì)胞間隙增大，細(xì)胞近乎圓形為度，加入含15％胎牛血清的DMEM高糖培養(yǎng)基終止消化，用吸管輕柔吹打瓶底，收集細(xì)胞，洗滌離心，接種于置有蓋玻片的24孔培養(yǎng)板中。

臍帶血MSCs誘導(dǎo)培養(yǎng)

取第2代細(xì)胞按密度為5×104/ml接種于24孔培養(yǎng)板(孔內(nèi)置無(wú)菌蓋玻片)中，第2天換液，其中半數(shù)培養(yǎng)孔用誘導(dǎo)軟骨細(xì)胞培養(yǎng)基(15％FCS的DMEM含終濃度為100ng/mlIGF-1)進(jìn)行培養(yǎng)，3天換培養(yǎng)液1次，連續(xù)觀察細(xì)胞生長(zhǎng)情況，并于第16天獲得細(xì)胞，通過(guò)掃描電子顯微鏡進(jìn)行形態(tài)學(xué)檢測(cè)。

軟骨細(xì)胞檢測(cè)

活細(xì)胞觀察

誘導(dǎo)后，每天在倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞生長(zhǎng)情況，特別注意其形態(tài)的改變，記錄可見(jiàn)變化特征及其出現(xiàn)時(shí)間，拍照。

掃描電子顯微鏡觀察

誘導(dǎo)培養(yǎng)16天時(shí)，以磷酸緩沖液輕輕沖洗，％戊二醛固定，酒精梯度脫水，室溫干燥后表面噴鍍金，掃描電子顯微鏡觀察?！菊磕康奶接懸葝u素樣生長(zhǎng)因子-1(IGF-1)體外誘導(dǎo)人臍帶血間充質(zhì)干細(xì)胞(MSCs)向軟骨細(xì)胞分化的可能性。方法由人臍靜脈獲得MSCs，純化培養(yǎng)后用含100ng/mlIGF-1的培養(yǎng)基誘導(dǎo)，掃描電鏡鑒定誘導(dǎo)后細(xì)胞。結(jié)果來(lái)源于臍血的單個(gè)核細(xì)胞經(jīng)體外培養(yǎng)貼壁后出現(xiàn)形態(tài)學(xué)上可見(jiàn)間充質(zhì)樣的細(xì)胞，間充質(zhì)樣細(xì)胞為類似成纖維樣的細(xì)胞形態(tài)。IGF-1誘導(dǎo)16天后，MSCs開(kāi)始呈現(xiàn)軟骨細(xì)胞特點(diǎn)。結(jié)論人臍帶血MSCs可在體外經(jīng)IGF-1誘導(dǎo)為軟骨細(xì)胞。

【關(guān)鍵詞】胎血間質(zhì)干細(xì)胞軟骨細(xì)胞細(xì)胞分化胰島素樣生長(zhǎng)因子Ⅰ

Abstract:ObjectiveToexplorethefeasibilityofmesenchymalstemcells(MSCs)fromhumanumbilicalcordblood(HUCB)differentiatingintochondrocytesinvitro.MethodsMSCsisolatedfromHUCBwithPercolldensitygradientsolutionwereculture-expandedbecausethecellsattachedandgrewondishes,thenMSCswereinducedwith100ng/mlinsulin-likegrowthfactorⅠ(IGFⅠ).Thedifferentiatedcellswereidentifiedbyusingscanningelectronmicroscope(SEM).ResultsTheHUCB-derivedmononuclearcells,whensetinculture,gaverisetoadherentcells,whichexhibitedeitherafibroblast-likeormesenchymal-likephenotype.16daysafterIGFⅠmediumtreatment,MSCsinmonolayerculturesexhibitedachondrocyticphenotype.ConclusionMSCscanbeculturedanddifferentiatedintochondrocytesinducedbyIGFⅠinvitro.

Keywords:fetalblood;mesenchymalstemcells;chondrocytes;celldifferentiation;insulin-likegrowthfactorI

間充質(zhì)干細(xì)胞(mesenchymalstemcells,MSCs)作為一種多潛能干細(xì)胞，因其成功避開(kāi)了胚胎干細(xì)胞來(lái)源缺乏、異體排斥、道德倫理等諸多問(wèn)題在實(shí)驗(yàn)研究和臨床應(yīng)用中的限制，近年來(lái)已成為干細(xì)胞領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)。其不僅支持造血系統(tǒng)，還可向中胚層和外胚層來(lái)源的組織分化，在一定的實(shí)驗(yàn)條件控制下可分化為肌細(xì)胞、成骨細(xì)胞、脂肪細(xì)胞、神經(jīng)細(xì)胞、肝細(xì)胞、心肌細(xì)胞等［1～3］。目前，MSCs主要來(lái)源于骨髓，但由于骨髓源性MSCs存在高度病毒污染的可能，且隨著年齡增長(zhǎng)其細(xì)胞數(shù)量和擴(kuò)增、分化能力出現(xiàn)明顯下降趨勢(shì)，故尋找一種能替代骨髓MSCs，并可彌補(bǔ)其缺陷的MSCs來(lái)源，已越來(lái)越受到各國(guó)學(xué)者的關(guān)注。人臍帶血是胎兒出生時(shí)臍帶內(nèi)及胎盤(pán)近胎兒一側(cè)血管內(nèi)的血液，含有豐富的干細(xì)胞，主要包含造血干細(xì)胞和MSCs。臍帶血中的MSCs可在體外培養(yǎng)，誘導(dǎo)分化后能成為神經(jīng)細(xì)胞、心肌細(xì)胞等［4,5］。隨著組織工程學(xué)研究的深入，對(duì)于相關(guān)功能細(xì)胞研究逐漸擴(kuò)展到干細(xì)胞領(lǐng)域，MSCs對(duì)軟骨組織修復(fù)有重要意義，本實(shí)驗(yàn)主要探索人臍帶血MSCs的分離培養(yǎng)以及分析其向軟骨細(xì)胞分化的可行性。

1材料和方法

材料

主要試劑和儀器：Dulbecco改良培養(yǎng)基、胎牛血清均為HYCLONE公司產(chǎn)品；胰島素樣生長(zhǎng)因子-1；Percoll分離液；其它試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純?cè)噭?。CO2培養(yǎng)箱；AE31型倒置顯微鏡；Apollo300型掃描電子顯微鏡。

方法

臍帶血MSCs的分離培養(yǎng)

從無(wú)妊娠并發(fā)癥足月分娩的臍靜脈穿刺抽取15ml臍帶血，肝素抗凝，加等量磷酸緩沖液稀釋，取50ml離心管，先加入15ml密度g/ml的Percoll梯度分離液，小心加入稀釋后的臍帶血，2000r/min離心25min后，用吸管吸取分層界面的白色環(huán)形絮狀物，洗滌離心2次，沉積細(xì)胞用含15％胎牛血清、100u/ml青霉素、100u/ml鏈霉素的DMEM高糖培養(yǎng)基懸浮，調(diào)整細(xì)胞密度為1×106個(gè)/ml，接種于25T的培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)，放置在37℃、5％CO2、飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。孵育72h后更換培養(yǎng)基，去除紅細(xì)胞及其它未貼壁細(xì)胞，以后視細(xì)胞生長(zhǎng)情況平均3～4天換液1次。

臍帶血MSCs傳代培養(yǎng)

MSCs約于7周相互匯合達(dá)到培養(yǎng)瓶底70％～80％的生長(zhǎng)表面，此時(shí)進(jìn)行傳代培養(yǎng)。倒掉舊培養(yǎng)基，加入2ml％的胰酶消化，作用30s后棄掉大部分，留置少許于瓶中，適當(dāng)用力振蕩培養(yǎng)瓶，整瓶細(xì)胞放入培養(yǎng)箱中5min，在倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞解離程度，以細(xì)胞突起縮回，細(xì)胞間隙增大，細(xì)胞近乎圓形為度，加入含15％胎牛血清的DMEM高糖培養(yǎng)基終止消化，用吸管輕柔吹打瓶底，收集細(xì)胞，洗滌離心，接種于置有蓋玻片的24孔培養(yǎng)板中。

臍帶血MSCs誘導(dǎo)培養(yǎng)

取第2代細(xì)胞按密度為5×104/ml接種于24