第二章免疫組織化學(xué)的基本理論與技術(shù)

第二章免疫組織化學(xué)

的基本理論與技術(shù)一、免疫組織化學(xué)的基本理論1原理：免疫組織化學(xué)(Immunohistochemistry)是利用抗原與抗體特異性結(jié)合的原理，使標(biāo)記抗體的顯色劑(熒光素、酶、金屬離子、同位素)顯色來確定組織細(xì)胞內(nèi)抗原(多肽和蛋白質(zhì))，對其進(jìn)行定位、定性及定量的研究?？稍诠忡R和電鏡水平觀察細(xì)胞膜及細(xì)胞內(nèi)某種抗原物質(zhì)的存在，從而為研究生命大分子，特別是酶、蛋白質(zhì)、激素及受體蛋白等在組織內(nèi)分布、細(xì)胞內(nèi)定位以及代謝狀態(tài)等，提供了特異性強(qiáng)、靈敏度高而又直觀化的原位分析細(xì)胞組成物質(zhì)的手段。2免疫組織化學(xué)全過程包括:

⑴抗原提?、瓶贵w制備(博士德,華美,基因公司等購買)⑶抗體標(biāo)記⑷免疫染色⑸觀察分析等過程

二、抗原與抗體

1.抗原

Ag定義：是指能刺激機(jī)體產(chǎn)生免疫應(yīng)答，并與相應(yīng)的免疫產(chǎn)物（抗體）發(fā)生特異性結(jié)合的物質(zhì)。

蛋白質(zhì)：免疫原性最強(qiáng)；

多糖：免疫原性次之；

脂類和核酸：必需和蛋白質(zhì)及多糖形成復(fù)合物才具有良好的免疫原性。

2.抗體

Ab

定義：是機(jī)體受到抗原刺激后，由免疫細(xì)胞合成并分泌出一類具有與抗原發(fā)生特異性結(jié)合的球蛋白。

存在部位：主要存在于血清內(nèi)。

分類：根據(jù)重鏈的結(jié)構(gòu)及抗原特異性不同分為五種，即IgG、IgD、IgE、IgA、IgM。根據(jù)制備方法不同分為兩種即單克隆抗體與多克隆抗體IgG的結(jié)構(gòu)

IgG分子呈“Y”型由兩條L鏈和兩條H鏈組成。用木瓜酶水解IgG可得到3個(gè)片段：兩個(gè)相同F(xiàn)ab段或抗原結(jié)合段和另一Fc段或可結(jié)晶段。在Fab段與Fc段之間有一個(gè)對酶敏感的區(qū)域，稱鉸鏈區(qū)。漿細(xì)胞AbAb漿細(xì)胞BBAgBB漿細(xì)胞漿細(xì)胞AbAb多克隆抗體制備原理：將純化的抗原注射入動物體內(nèi)時(shí)，一系列抗體生成細(xì)胞會不同程度的與抗原結(jié)合，受抗原刺激后在血液中產(chǎn)生不同類型的抗體，這種由一種抗原刺激產(chǎn)生的抗體稱為多克隆抗體。單克隆抗體Ag合成抗體

效應(yīng)性B細(xì)胞(漿細(xì)胞)不能在體外生長瑞士Kohler英國Milstein

多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞不能合成抗體

能在體外大量繁殖

BB漿細(xì)胞漿細(xì)胞脾多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞AbAbAbAbAbAbAbAbAbAbAbAbAbAbAbAb一抗單克隆抗體多克隆抗體缺點(diǎn):價(jià)格較高，容易出現(xiàn)假陰性反應(yīng)。實(shí)質(zhì):是受同一種抗原刺激，由多個(gè)B淋巴細(xì)胞克隆所產(chǎn)生的抗體混合物。優(yōu)點(diǎn):容易制備，價(jià)格便宜缺點(diǎn):可能與多種特異性和非特異性的抗原決定簇反應(yīng)，出現(xiàn)非特異性染色，影響結(jié)果的判定。實(shí)質(zhì):是受同一種抗原刺激，由單個(gè)B淋巴細(xì)胞克隆所分泌的抗體。優(yōu)點(diǎn):特異性強(qiáng)，敏感性高，抗體產(chǎn)量高。首選三、免疫組織化學(xué)的基本技術(shù)

免疫組織化學(xué)技術(shù)是用標(biāo)記物或顯色物標(biāo)記的抗原(或抗體)檢測組織和細(xì)胞內(nèi)的抗原，從而達(dá)到診斷或研究的目的。特定抗原(或抗體)的顯示和定位是否準(zhǔn)確與細(xì)胞和組織標(biāo)本制各的質(zhì)量好壞有著密切關(guān)系。因此，組織和細(xì)胞標(biāo)本的取材和制備至關(guān)重要。

1.組織標(biāo)本制備（1）標(biāo)本新鮮：一般在2h以內(nèi)進(jìn)行。（2）取材部位：取含待檢抗原部位，還應(yīng)取病灶與正常交界處，即抗原陽性和陰性區(qū)，必要時(shí)取遠(yuǎn)離病變區(qū)的正常組織作為對照。對于只研究正常組織抗原，取材時(shí)應(yīng)盡可能避開壞死區(qū)。（3）避免擠壓：剪刀、刀片的刃口要鋒利。（4）取材大?。鹤鍪炃衅慕M織厚度不宜超過2mm，用作冰凍切片的以4mm為宜。（5）固定:化學(xué)固定,或于液氮中,或－70℃冰箱中保存。2．細(xì)胞標(biāo)本制備

(1)印片法應(yīng)用：活檢標(biāo)本、手術(shù)切除的標(biāo)本。方法：將新鮮標(biāo)本暴露病區(qū),用載玻片輕壓病區(qū)，脫落細(xì)胞粘附于載玻片上，立即浸入固定液中5-10min，取出后自然干燥，低溫保存。優(yōu)點(diǎn)：簡便省時(shí)，細(xì)胞抗原保存較好。缺點(diǎn)：細(xì)胞分布不均、重疊,影響觀察效果

(2)穿刺吸取涂片法

應(yīng)用：實(shí)質(zhì)器官的病變區(qū)。方法：①穿刺液較少時(shí)直接涂片,力求均勻。②穿刺液較多時(shí)，穿刺液滴入2毫升Hanks液內(nèi)，離心，制成細(xì)胞懸液，吸一滴于載玻片上，輕涂，干燥后固定。優(yōu)點(diǎn)：細(xì)胞均勻。缺點(diǎn)：細(xì)胞易變形。

(3)體液沉淀涂片法

1)細(xì)胞數(shù)較多，取一滴直接涂片。2)細(xì)胞數(shù)較少時(shí)，取5毫升自然沉淀液以1500rpm離心10min，棄上清，將沉淀涂片，略干后固定備用。

（4）體外培養(yǎng)細(xì)胞1)貼壁生長的細(xì)胞：將蓋玻片插入培養(yǎng)液中，讓細(xì)胞自然貼壁于蓋玻片上。2)懸浮生長的細(xì)胞：可用離心涂片機(jī)法制成涂片。（5）離心涂片機(jī)法制成2×105-6／ml細(xì)胞懸液,取50～100μl，加入涂片機(jī)內(nèi)，1000r／min,2min，細(xì)胞即可均勻分布于載玻片上。（二希）免披疫組罩織化味學(xué)的群固定亦方法免疫食組織柄化學(xué)濫固定軌的原擠則：最好廊地保釋存細(xì)茫胞和些組織退的形倦態(tài)結(jié)鋸構(gòu)和勵最大蛇限度待地保廢存抗?jié)膭e免疫藍(lán)活性榴。方法哀：一）介固定紫有物席理固看定，接如血償涂片荒可采鎮(zhèn)用空私氣南快速趴干燥輸、凍哥結(jié)干須燥等廣；二）揮化學(xué)下固定1．浸辣入法辱：組織柿立即敵浸于蔑固定夠液內(nèi),時(shí)間句在2～12極h之間嬸。2．灌太注法鑒：插管懷由左畏心室怎插入織主動老脈,先用PB棕S沖洗榆血液,再以泵梨或吊抹瓶灌栽注固呢定液漂。在微灌注柜后30很mi雙n內(nèi)取券材,再置攝同一走固定卷液內(nèi)宗浸入銅固定l～3h?？筛迨构替I定液到達(dá)匙全身帥各處網(wǎng)組織解。3．微妹波固冶定：微波腔處理愧后,溫度附升高,分子娛運(yùn)動汁加快,促進(jìn)斥固定液向籍組織植內(nèi)滲中透,短時(shí)啄間達(dá)嫂到固糊定效牌果。圣將標(biāo)窩本放入5～10胞ml固定疊液內(nèi),置于灶爐中愛央,周邊或放一扛燒杯盛40暖0純水堆以吸裹收爐援內(nèi)產(chǎn)予生的歪熱量,選擇微強(qiáng)檔傻照射10～30趟s,照后晴固定趕液溫秀度≤50抗℃。取淘出后,在相同巨固定醒液內(nèi)鵲再固蹲定2～6h搶(室溫)。（三媽）重緩要固耀定液(1貪)醛類沙固定喇劑:為雙殊功能板交聯(lián)摟劑,可使納組織路間相騰互交鈴聯(lián)，珠將抗如原保厭存于畫原位輔。特灰點(diǎn)是爹對組萌織的捎穿透壟性強(qiáng)幕，收宗縮性察小.是常煩用固打定劑狠。1)羅1珠0％中捐性緩星沖福熊爾馬辟林：李該固夜定劑驢易使便組織棗硬化孟而致茄浸蠟搜困難萌，因筋此固朝定時(shí)站間不齊宜過愿長。2)蠢4％多姻聚甲彎醛磷遵酸緩溜沖液稼：適肺應(yīng)性競較廣兄泛，班因較悲溫和腿，適撇于組柱織標(biāo)兄本的蒙較長悟時(shí)期埋的保辱存。3)Bo慶ui環(huán)n'覽s液：欣對組錢織固罰定力冰強(qiáng)且雖較均粗勻。江比單兔獨(dú)醛殘類固顧定更蘇適和岸免疫州組化厚染色龜，較赴常用伶，通楊常4℃下固燦定6～8h。4)Za身mb梁on麻i液：亦用于畝光、驚電鏡笨免疫塵細(xì)胞轉(zhuǎn)化學(xué)古觀察弊。(2晶)非醛年類固煤定劑碼：為非刷醛類巷雙功撕能試劇劑，孕單獨(dú)奏應(yīng)用猜時(shí)，殼邊緣忌固定驕效應(yīng)黎較重軋，但態(tài)與戊鋼二醛秧或多廟聚甲魚醛混處合使壩用時(shí)轎，效悅果明按顯好社轉(zhuǎn)。仍較適歇用于罵多肽單類激章素的令組織揮固定匆。1)碳化泄二亞劉胺液:適用魂于含預(yù)多肽侄激素益組織顧的固練定。2)碳二潔亞酰甘胺一挖戊二愈醛液(E斷CD紹—G液)：對姜酶等宿蛋白滿質(zhì)固嘩定效蓋果良維好，谷對細(xì)蔬胞內(nèi)艙抗原捉定位摧，超叮微結(jié)顛構(gòu)保濟(jì)存好諷，是重培養(yǎng)閃細(xì)胞虜電鏡蕩免疫拌細(xì)胞斧化學(xué)攜的良銳好固庸定劑芹，也攤常用無于多沙肽類運(yùn)激素勻固定桶。3)Ze壩nk齒er摸’s液：慢因含食重金鏡屬，識固定驗(yàn)時(shí)間桶要短致，以2～4h為宜伴。染咽色前摘必須浸脫汞融。(3秒)丙酮嫁及醇瞞類固遵定劑重：其作急用是勁沉淀饞蛋白勁質(zhì)和置糖，巨對組黑織穿憐透性慶很強(qiáng)猜，能卻夠較騙好地逮保存崗抗原飼的免霉疫活罷性。客但醇抵類對常低分后子蛋羅白、軋多肽滿及胞豬漿蛋秘白質(zhì)磚的保做存效腰果較糕差。底與冰汁醋酸諸、氯獵仿、籠甲醛壩等混盟合使雙用，歷效果蜘可明自顯改叮善。1)丙酮及：常用象于冰鍋凍切談片及傲細(xì)胞迷涂片之的后侵固定懇。保岔存抗宅原性大較好須，穿償透性鐘及脫傭水性生較強(qiáng)遣。2)95悼%乙醇誼：用于瘦冰凍收切片息及細(xì)喝胞涂置片的鍬后固逃定。壤效果停較差,和其撫他試鹿劑混邪合使烈用,染色乏較好刃。3)AA吹F液：較常辱用的渠固定課液。(9忌5～10埋0％乙伯醇85休ml，冰挎醋酸5m逆l，濃漿甲醛10剪m1貼)。4)Ca施rn宗oy液：10暗0％乙繩醇醇60飾ml，氯翻仿30丹ml，冰精醋酸10豎ml，混詞合后4℃保存籮備用圈。3．固伍定劑催的選惰擇固定偉劑的絮種類惡很多歷，至剛今尚幅無統(tǒng)瓦一標(biāo)是準(zhǔn)的錫固定刪劑，10％中降性甲奶醛是創(chuàng)國際書最通流用的你固定挽劑。幕需指職出，蹦同一您固定進(jìn)液固渠定的頌組織臭，染趁色結(jié)慮果可營截然郊不同內(nèi)；不素同的靈抗原船和不搭同的百組織驢標(biāo)本熟往往煎需反伶復(fù)試蒜驗(yàn)，蛋必要投時(shí)可烘做多途種固強(qiáng)定液滾對比賺，才診能選予出最悲佳的斥固定治液。抗原適用固定液細(xì)胞表面抗原100％丙酮，95％乙醇，10％福爾馬林，Bouin液免疫球蛋白Zenker固定液，10％福爾馬林，95％7,醇，100％丙酮酶，蛋白類10％福爾馬林，Bouin液，95％乙醇，100％丙酮肽類激素Bouin液，10％福爾馬林，95％乙醇，100％丙酮固醇類10％福爾馬林，Bouin液補(bǔ)體95％乙醇，100％丙酮，10％福爾馬林，Bouin液腫瘤胚胎抗原10％福爾馬林(四)組織裙包埋濟(jì)和切答片技喉術(shù)固定剃的和礦未經(jīng)偉固定球的組裂織、揮細(xì)胞楊以及殲各種種涂片漢和切趨片方黃法均燥可用也于免卷疫組粱化，嶄但其料效果某不同哥。光摘鏡免載疫組哄織化缸學(xué)的葉切片升厚度賴一般踐為4～6μ速m，而辱神經(jīng)嫩組織若切片州通常叉為20～10埋0μ蔽m厚，舊以便漲顯示屆神經(jīng)郊纖維宗的走捉行。1．冰喪凍切著片冰凍糞切片(f陜r(jià)o注ze捐n庭se敗ct旦io靠n)是酶陰組織擔(dān)化學(xué)夏和免闖疫組穴織化熔學(xué)染瀉色中商最常賴用的每一種挨切片婚方法屑。優(yōu)點(diǎn)蠶：1）能厲較好痰地保腔持抗竹原活起性(尤其或是表秀面抗原)和酶旅的活說性。2）冰斃凍切楊片簡縣便快命速，盛省去擱固定庭、包君埋和切造片處蔬理等當(dāng)一系省列繁扣瑣步權(quán)驟。適用礦范圍靠：新鮮糞的組附織及表已固霉定的仙組織番均可佩作冰凍級切片餅。缺點(diǎn)庭：1）不職能用也于回根顧性乎研究抗。2）不饑?yán)趶?qiáng)常規(guī)達(dá)檢查皺和長專期保竟存標(biāo)壺本。3）不壤如石伸蠟切柳片結(jié)猴構(gòu)清默晰。（1）冷牲凍、滔包埋為防趣止冷度凍中唉形成漿冰晶恭破壞折組織搬結(jié)構(gòu)部和保底持抗校原，化采取汗：1)浸入晶深低富溫預(yù)恐冷的姓（干印冰容規(guī)器內(nèi)票，-7宣0℃席)正已午烷液觀內(nèi)驟柜冷30～60秒，烘或用OC殃T包埋歷劑浸敏透，棍使組緣瑞織速黎凍，久溫度沖驟降淘，減澆少冰燙晶的勾形成曲。方牧法：釘①干欠冰-丙酮供法：溜②央液氮質(zhì)法：2)將固僚定后姑或未駛固定猛的組芽織置俗于20％-3錘0％蔗餐糖溶漲液l～3天。圈利用渣高滲攻吸收兼中水篇份;減少宣組織貝含水艦量。搜包埋吃、冷角凍步畏驟同暴上。(2懷)切片技術(shù)屬難度窩較大嫂，選蹤蝶擇好食的冰丹凍切答片機(jī)蔥是保糟證切污片質(zhì)絲式量的尾關(guān)鍵養(yǎng)。1)恒冷根箱切欣片機(jī)(c模ry形os勾ta岸t)肆—常用雁、理澤想的美切片錘機(jī)：切片惡機(jī)置抵于-3女0℃低溫慈密閉識室內(nèi)杜，可菊連續(xù)議切薄問片．膽切片尖時(shí)，怖低溫鴿室內(nèi)集溫度挺以-1瓦5～-1爆8℃為宜封，溫?cái)[度過擴(kuò)低組滲織易而破碎收。2)開放辦式冰援凍切屯片機(jī)心：切虹片時(shí)垂暴露縫空氣衛(wèi)中，朗切片懶技術(shù)叫難度正大。憑在高哨溫季大節(jié)，植切片姥更加塊困難北，目章前處糞于淘足汰階備段。(3等)冰凍匆切片清的保丈存使名用如不印染色愈，必互須室奶溫下專吹干30尊mi鼓n以上腸，裝名入密優(yōu)封的聯(lián)標(biāo)本航盒內(nèi)超，外抖包塑咽料袋天，置尾于-2曠0℃低溫機(jī)冰箱訓(xùn)，一竄個(gè)月嫂內(nèi)使撕用。染色窗前，湯從冰得箱內(nèi)烘取出春切片遮，置辟室溫驅(qū)干燥10按mi泄n，再業(yè)經(jīng)丙致酮固頁定5～10塑mi寫n(未固臣定者)，即則可進(jìn)禽入染娘色程初序。2.石蠟棚切片石蠟肢切片(p菊ar購af畜fi張nse溪cf帥io限n)：指顏在切肚片前應(yīng)，固千定的兆組織薯塊需繼經(jīng)乙羊醇逐揭級脫紫水，修二甲老苯透歲明，園再浸液蠟包截埋。組織里在浸點(diǎn)蠟、策包埋嫁時(shí)，戲石蠟間溫度德應(yīng)低夫于60鞏℃，各榨步驟尊時(shí)間紫均不踩宜過璃長(1～2h拾)，以落免組雅織變頭脆。切片胞一般減厚約3～5μ鈔m，切牙片于37胃℃烘烤回過夜際，可掙置4℃保存闖，脫捷水、宇透明連也可右在4℃進(jìn)行廳。（怎詳見盼組織咸學(xué)與笨胚胎飯學(xué)第耀六版哲）3．振尤動切樣片振動頸切片難是將爪新鮮密組織(不固周定不跟冷凍擋，或射低濃堆度固宗定液屈稍稍嬸固定)后用率振動氧切片輪機(jī)切緞成20～10卡0μ霉m厚，辰漂浮弟免疫能組化筐染色怖，檢案出陽法性部土位，捏后固亂定，斜常規(guī)失電鏡亂樣品惜制備桌。適舌于免認(rèn)疫電聾鏡細(xì)教胞化東學(xué)觀跌察。4．披塑料棍包埋萄切片(p且la隙st傻ic觀s恒ec搞ti畜on佩)常用侮的包套埋材紫料有諒兩大吵類：化甲基私丙烯姨酸鹽女類和嘴環(huán)氧據(jù)樹脂業(yè)類。前者助能較片好地化保存盛抗原束，不以與組葬織產(chǎn)陶生共裝聚合回，染緣瑞色前己不必收脫去幣包埋竿材料撈，但柏形態(tài)己結(jié)構(gòu)劑欠佳哪，切持片易射皺折面；后者俱能較熱好地價(jià)保持雙形態(tài)竭結(jié)構(gòu)追，但林在聚忽合過慰程中閑易與虎組織午作用標(biāo)，改資變抗紛原結(jié)春構(gòu)。優(yōu)點(diǎn)填：組略織塊恩可同勉時(shí)用半于一袋般光山鏡切暫片、劈燕半薄爽切片(0判.5～1.獄5μ放m)和電剃鏡超當(dāng)薄切它片。缺點(diǎn)因：所付經(jīng)步胞驟繁之瑣，猶抗原嶼活性乖易喪嶺失。應(yīng)用轎范圍拿：塑票料包于埋切遣片主顆要用貌于免莫疫電譯鏡超謊薄切砌片前盲定位灘。5.超薄爽切片超薄仔切片(ul浴tr羅at背hi音nse遼ct古io粘n)適用巷于免牧疫電局鏡細(xì)煤胞化探學(xué)，印需用罷超薄蜘切片徑機(jī)(詳見頸有關(guān)跨電鏡化技術(shù)救資料)。6．載肯玻片中及蓋血玻片盾的處不理和密切片狠的附潔貼(1扇)載玻幣片及呼蓋玻薄片的研處理1)載玻宅片：呢清洗渠液(酸)浸泡12測-2蒙4h，水野洗，95％乙漸醇浸黎泡2h后擦旨干或撓烤干淡。2)蓋玻抽片：推清洗廢液浸朱泡2h，或尤鹽酸熊乙醇忍浸泡態(tài)后水蹄洗，95％乙浩醇浸律泡，兄擦干償。(2嘴)切片嬸的附顆貼為防索止染丹色過喊程脫地片，篇適用儉免疫乞組化芒染色器中的酸附貼刊劑：1)甘油墻．明恩膠；2)甲醛望一明頌?zāi)z；3）鉻民明礬-明膠失；4）多鋸聚賴?yán)彼?P故ol南y-綱L-郊Ly癥si眾ne討)；5）AP方ES；6）AP夏ES和Po衛(wèi)ly翁-L粒-l卸ys帝in析e聯(lián)合鋪應(yīng)用煤：適穴于特肅別容雪易脫睬片的先情況攪。（五）緊免疫曾組織拿化學(xué)肝的染損色方揭法及喚注意帖事項(xiàng)一）免疫捧組織買化學(xué)終染色漿方法1.按標(biāo)福記物衡種類箏分為屯：免疫蔥酶法離；免疫買金一快銀法而；鐵標(biāo)貼記法滾；免疫即熒光熟法；雙重領(lǐng)或多彎重免按疫染幸色法牢等。2.按標(biāo)增記抗肝體不面同分拜為:（1）直漆接法尊：抗原+一抗懼（標(biāo)記大物標(biāo)記劃）鏡下?lián)煊^察優(yōu)點(diǎn)：簡單愧，時(shí)比間短屠，特延異性摸強(qiáng)。缺點(diǎn)俘：靈著敏度濁差，合所需屢抗體嗎量大孔，不蓮經(jīng)濟(jì)患，淘幣汰。（2）禁間接傲法：經(jīng)過恥二次咳抗體抗原+一抗+二抗陡（標(biāo)縣記物敗標(biāo)記講）特點(diǎn)鍛：較狐直接蘆法靈圖敏，守可標(biāo)缺記一過種抗幕體→趨鑒定濁多種晌抗原陽。（3）非標(biāo)虹記抗判體橋店法（六橋連洪法、此多步優(yōu)法）經(jīng)過豆三次曉抗體特點(diǎn)班：任何羞抗體稅均未卷被酶提標(biāo)記壁；酶是退與抗捎酶若抗體河結(jié)合壇，避六免因姨共價(jià)拾結(jié)合星對抗昨體和掃酶活貍性的培影響狐，提播高敏可感性居，節(jié)奸約一醬抗用描量?？箻?biāo)勞記物跪抗體秤（用壇與一匯抗同罩種動曾物產(chǎn)盡生）抗標(biāo)罵記物違抗體+標(biāo)記鎮(zhèn)物=免疫靠復(fù)合池物(如PA姓P，AP浴AA若P)尺,抗原+一抗+二抗+三抗短（PA區(qū)P，AP半AA塔P）1）單尊橋法抗原+一抗+二抗止（橋謊抗體道）+三抗磁（抗申酶抗似體）底物叼顯色2）雙橋付法在三意抗之木后，株將二跟抗和豬三抗引再重啦復(fù)一看次，鴨可增頂大染融色強(qiáng)尖度?！飰禾貏e頸提示糟：注架意動背物種梨屬關(guān)韻系的鍵一致歸性。（4）葡薦萄球輛菌A蛋白慰法（5）AB孩C法、SA徹BC、En盒vi朋si屋on輸…2免疫呆組化珠染色悶基本腰技術(shù)（1）抗格體稀叢釋度1）工騙作液--晶-2）血原液--抗-預(yù)實(shí)萍驗(yàn)3）拌抗體邀濃度意選擇--笨--控制瘦一定旨濃度昆范圍（2）抗邪體滴維片技嘩術(shù)（3）PB賊S洗滌1）目院的--銹--統(tǒng)-保證露離子輸濃度艙、PH、減駐少非桿特異撫反應(yīng)2）方項(xiàng)法（3）抗屑體孵或育技駛術(shù)濕盒較、溫雄度、銜時(shí)間二）肢免疫超組化匯染色負(fù)注意款事項(xiàng)窩：①pH：中性朋及弱舍堿性反應(yīng)阿液和瘦洗滌炕液：pH若7皇.2或-7梢.4緩沖與液配交制②難離子鄉(xiāng)豐濃度告：低離業(yè)子濃馳度：0.尖01厘-0挺.0豈2m廣ol／L緩沖賄液③冬去污呆劑：0.爽05％Tw腰ee誘n2襲00.匯01%ED飼TA0.交1％-l％Tr鳥it辱onX-摟10尾0可分摧別加吵入反撓應(yīng)液由和染退色前蕩洗滌仁液內(nèi)④葬抗體沫稀釋推液中弟蛋白樂質(zhì)濃去度：減少缸抗體國的非苗特異諒性吸胞附0.稅1-秧0.各6％牛賄血清崇白蛋扇白(BS楊A(yù))5-降10％正迅常山年羊血里清⑤冠防腐兔劑：Na頁N3(0舌.0渠l％)-栽--抑制雨非特枯異性弟著色仔、提老高靈區(qū)敏性⑥憶溫度阻和時(shí)與間：⑦眠濕度⑧雜洗滌襯：可除驗(yàn)去前籌一步?jīng)]所加織的未杰結(jié)合妨抗原江或抗棟體，胸以消碰除因胡非特誕異性府染色脖。洗滌很液中渣可加遼入去環(huán)污劑振蕩（六疏）對銷照目的嘩：證明肯和肯格定陽查性結(jié)雖果的棚特異雞性。主要胳是針令對第醬一抗快體對行照，患常用懶的對疏照方儲法包耳括：①墾陽性答對照縱；②錯(cuò)陰性童對照淚；③膜阻斷糟試驗(yàn)畫；④雷替代悅對照妄；⑤產(chǎn)空白酬對照繞；⑥剃自身眉對照顧；⑦壯吸收硬試驗(yàn)課。(一)陽性漠對照已知好抗原陽陽性舟的切哀片--門--衰-陽性鍋對照待檢柏標(biāo)本舌呈陰廁性結(jié)拐果時(shí)判，陽紀(jì)性對丈照尤卷為重主要。(二)陰性給對照不含旱已知腥抗原答的標(biāo)下本--辱--陰性秒對照空白亦、替留代、框吸收旅和抑寇制試蔽驗(yàn)都搬屬陰述性對趨照待檢跟標(biāo)本哨呈陽聾性結(jié)割果時(shí)碑，陰辣性對惰照就識更加令重要蓮，用撕以排陽除假封陽性室。準(zhǔn)確真判斷猴陽性氣和陰初性,排除鳳假陽耳性和闖假陰侍性結(jié)殘果對照也實(shí)驗(yàn)多次紛重復(fù)硬實(shí)驗(yàn)幾種維方法的進(jìn)行琴驗(yàn)證（七賀）免旺疫細(xì)如胞化傳學(xué)結(jié)墊果的苗判斷特異丹性染葉色與環(huán)非特?cái)偖愋哉杖旧珒r(jià)的鑒祝別點(diǎn)特異年性染辜色表默現(xiàn)：常分諸布于釀特定夾的部削位,即具趁有結(jié)店構(gòu)性斧。在同斑一切斧片上社呈現(xiàn)清不同遺程度消的陽派性染說色結(jié)婆果。非特欺異性比染色么表現(xiàn)溫：無一料定的抱分布冒規(guī)律,常為屋成片遺的均呀勻著席色；細(xì)胞藥和周刊圍的說結(jié)締戀組織究均無習(xí)區(qū)別亞的著始色,或CT呈現(xiàn)過強(qiáng)染口；切片佛的邊笛緣、央刀痕史、組間織折辯疊部存位易識出現(xiàn)正。非特室異性移和特慎異性豈染色閉同時(shí)宮存在衡：過強(qiáng)鞠的非弄特異嗽性染迎色背奶景1陽性欠細(xì)胞妄的染膨色特濱征(1)陽性攏細(xì)胞濃染色分布園為灶然性和放彌漫佛性，三種夠類型玻：①羊胞漿田：大時(shí)部分滴抗原濁見于釣細(xì)胞仍漿②呼細(xì)胞吩核③真細(xì)胞際膜表訴面(2狐)細(xì)胞哥內(nèi)含陷抗原這量不勢同咱染固色強(qiáng)池度不冤一(3）陽紙性細(xì)丑胞與暫陰性圍細(xì)胞西相互慮交雜做分布;(4性)相同政的陽遷性染屢色強(qiáng)卷度,不能叛用于覆判斷宗陽性壘。如：什切片凳邊緣屠、刀吵痕、養(yǎng)皺折軍區(qū)；壞死拴或擠僚壓的玩細(xì)胞榮區(qū)；結(jié)締虧組織蜓等結(jié)攏束2）雙橋宅法在三州抗之彩后，弦將二穗抗和路三抗緊再重亡復(fù)一馬次，映可增熟大染認(rèn)色強(qiáng)盾度。★見特別做提示倆：注斑意動他物種可屬關(guān)消系的蘋一致紹性。（4）PA率P法（什過氧鳴化物