DB35T 1280-2012大豆疫霉菌分子檢測技術(shù)規(guī)程

ICS65.020B16DB35福建省地方標(biāo)準(zhǔn)DB35/T1280—2012大豆疫霉菌分子檢測技術(shù)規(guī)程StandardprotocolformoleculardetectionofPhytophthorasojae2012-11-02發(fā)布 2013-02-01實(shí)施福建省質(zhì)量技術(shù)監(jiān)督局發(fā)布福建省"地方標(biāo)準(zhǔn)

大豆疫霉菌分子檢測技杰'杪程DB35/T1280—2012*2013年1月第一版2013年1月第一次印刷DB35/T1280DB35/T1280—2012IIIIDB35/T1280—2012DB35/T1280—2012II目次TOC\o"1-5"\h\z前言 III1 范圍 12規(guī)范性引用文件 1術(shù)語和定義 1原理 15材料與試劑 15.1主要儀器與器材 11.1 PCR檢測儀 15.1.2 凝膠成像儀 25.1.3 臺式離心機(jī) 25.1.4 渦旋混勻器 25.1.5 電泳儀 25.2主要試劑 25.2.1苯酚；氯仿；異戊醇；乙醇 25.2.2 二甲基亞硯 25.2.3 氫氧化鈉 25.2.4脫脂奶粉 22.5 PCR常規(guī)試劑 2采樣 26.1采樣工具 26.2樣品采集 22.1大豆植株 22.2土壤 23樣品貯運(yùn) - 26.4樣品存放 2操作方法 ./.■ 21 樣本DNA制備 21.1植物組織中病原菌DNA的提取 27. 1.2土壤中DNA的提取 31.3DNA的保存 37.2 檢測 37. 2.1加樣 37. 2.2PCR檢測 37.2.2.1反應(yīng)體系 37.2.2.2反應(yīng)條件 37.2.3套式PCR檢測 37.2.3.1套式PCR模板DNA制備 37.2.3.2套式PCR反應(yīng)體系 37.2.3.3套式PCR反應(yīng)條件 47.3 瓊脂糖凝膠電泳 48結(jié)果判定 4PCR檢測結(jié)果判定 4套式PCR結(jié)果判定 49樣品處理 4附錄A（資料性附錄） 大豆疫霉菌樣本檢測報(bào)告 5附錄B（資料性附錄） 大豆疫霉PCR檢測試劑 6DB35/T1280—2012DB35/T1280—2012本標(biāo)準(zhǔn)按照GB/T1.1-2009的要求編寫。本標(biāo)準(zhǔn)由福建省農(nóng)業(yè)廳提岀并歸口。本標(biāo)準(zhǔn)起草單位：福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所。本標(biāo)準(zhǔn)主要起草人：陳慶河、翁啟勇、李本金、蘭成忠、趙健、邱榮洲。DB35/T1280DB35/T1280—201222DB35/T1280—2012DB35/T1280—201211大豆疫霉菌分子檢測技術(shù)規(guī)程1范圍本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了大豆疫霉菌PCR檢測的樣品制備、檢測技術(shù)和操作程序。本標(biāo)準(zhǔn)適用于大豆植物組織及土壤中大豆疫霉菌的分子檢測。2術(shù)語和定義下列術(shù)語和定義適用于本文件。2.1巢式PCR(nestedPCR)是指利用兩套PCR引物(巢式引物)對進(jìn)行兩輪PCR擴(kuò)增反應(yīng)。在第一輪擴(kuò)增中，外引物用以產(chǎn)生擴(kuò)增產(chǎn)物，此產(chǎn)物在內(nèi)引物的存在下進(jìn)行第二輪擴(kuò)增。由于巢式PCR反應(yīng)有兩次PCR擴(kuò)增，從而降低了擴(kuò)增多個(gè)靶位點(diǎn)的可能性，增加了檢測的敏感性，又有兩對PCR引物與檢測模板的配對，增加了檢測的特異性。3原理大豆疫霉菌(Phytophthorasoja畝隸屬鞭毛菌亞門，卵菌綱，霜霉目，腐霉科，疫霉屬。真核生物核糖體基因包括5S、5.8S、18S、25S在內(nèi)的4個(gè)rDNA基因，是細(xì)胞核內(nèi)染色體上的多拷貝、中度重復(fù)序列，由于其進(jìn)化速率慢，常用于探討科級和科級以上等級的分類、檢測和鑒定。核糖體基因轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)(InternaltranjiribedspacerITS)是介于18SrDNA、5.8SrDNA和25SrDNA之間的區(qū)域，該區(qū)域進(jìn)化速率較編碼區(qū)快，研究表明ITS在真菌的種間存在著豐富的變異，而在種內(nèi)不同菌株間卻高度保守，可以為病原菌的分子檢測提供理想的靶序列。根據(jù)大豆疫霉菌ITS的特異序列，合成一對特異性引物，獲得大豆疫霉菌特異性擴(kuò)增片段，用于大豆疫霉菌的快速分子檢測。4材料與試劑4.1主要儀器與器材1.1PCR檢測儀4.1.2凝膠成像儀4.1.3臺式離心機(jī)4.1.4渦旋混勻器4.1.5電泳儀4.2主要試劑除特別說明以外，本標(biāo)準(zhǔn)所用試劑均為分析純。4.2.1苯酚；氯仿；異戊醇；乙醇4.2.2二甲基亞砜4.2.3氫氧化鈉4.2.4脫脂奶粉4.2.5PCR常規(guī)試劑5采樣5.1采樣工具分樣套篩、剪刀、鑷子、1.5mL微量離心管、研缽。5.2樣品采集5.2.1大豆植株采集疑似大豆疫病的植株根部及地表上2cm?4cm的莖部樣品。2.2土壤每塊大豆田隨機(jī)選5個(gè)點(diǎn)，取2cm?15cm深度的50g土壤樣品。5.3樣品貯運(yùn)樣品采集后，放入密閉的容器內(nèi)，送實(shí)驗(yàn)室。將取樣結(jié)果進(jìn)行記錄，記錄表格見附錄A。5.4樣品存放處理的樣品應(yīng)保存在-20°C以下，避免反復(fù)凍融。6操作方法1樣本DNA制備6.1.1植物組織中病原菌DNA的提取取一段疑似病株組織，每毫克加入ionl0.5MNaOH,在研缽中充分研磨后移至1.5ml的離心管中，12000r/min離心5min,取5卩1上清液加入495卩10.1mMTris(pH8.0),混勾西取1卩1直接用于PCR反應(yīng)。6.1.2土壤中DNA的提取經(jīng)100目過篩后的土壤加入少量無菌水(10g土壤約加入5ml無菌水)后冷凍抽干24h~48h后加少量石英砂，倒入液氮充分研磨，將研磨后的土壤細(xì)粉分裝至1.5ml離心管中，每管加入500卩10.4%脫DB35/T1280—2012DB35/T1280—2012#附錄A（資料性附錄）

大豆疫霉菌樣本檢測報(bào)告

編號:樣品種類取樣時(shí)間取樣地點(diǎn)樣品數(shù)量取樣部位送檢日期送檢人送檢單位聯(lián)系電話檢測鑒定方法:檢測鑒定結(jié)果:備注:檢測人（簽名）：審核人（簽名）：檢測單位蓋章:

年月曰注：本單一式兩聯(lián)，第一聯(lián)送檢單位存檔，第二聯(lián)檢測單位存檔。DB35/T1280DB35/T1280—2012附錄B（資料性附錄）

大豆疫霉PCR檢測試劑P