原雞基因CD8a生物信息學(xué)初步分析論文

原雞基因CD8a生物信息學(xué)初步分析內(nèi)容摘要本文的實(shí)驗(yàn)對(duì)象是原雞的CD8a。本實(shí)驗(yàn)運(yùn)用生物信息學(xué)方法，對(duì)本條核酸序列進(jìn)行核酸一級(jí)結(jié)構(gòu)和其表達(dá)產(chǎn)物的一級(jí)結(jié)構(gòu)、二級(jí)結(jié)構(gòu)以及三級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行初步分析。通過分析我們得出，該條序列長度為648bp，有多種酶的限制性酶切位點(diǎn)，與其他雞形目的CD8a相似性很高，本條序列共編碼216個(gè)氨基酸。氨基酸疏水性不高，有12個(gè)磷酸化位點(diǎn)，沒有信號(hào)肽，有一個(gè)跨膜區(qū)，蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)主要是α螺旋，占22.69%；延伸鏈，占15.74%；無規(guī)卷曲，占61.57%，并且分布不連續(xù)。通過對(duì)其系統(tǒng)發(fā)生樹的建立，三種方法構(gòu)建的系統(tǒng)樹，所表現(xiàn)的CD8a和其他物種同源序列之間的關(guān)系基本一致?！娟P(guān)鍵詞】:原雞生物信息學(xué)CD8a目錄一、綜述 4二、分析研究材料與方法 5（一）研究材料 5（二）研究方法及工具 5（三）分析方法和具體步驟 6三、預(yù)測(cè)結(jié)果與分析 8（一）核酸序列一級(jí)結(jié)構(gòu)分析 81．核酸序列基本分析 82.核酸序列的酶切圖譜分析 93.堿基同源性初步分析 11（二）氨基酸序列的初步分析 121.氨基酸序列的組成 122．磷酸位點(diǎn)的預(yù)測(cè) 143．氨基酸的疏水性和親水性分析 144．氨基酸的跨膜區(qū)分布 155．信號(hào)肽區(qū)域的預(yù)測(cè) 16（三）氨基酸高能結(jié)構(gòu)的分析 171．氨基酸的二級(jí)結(jié)構(gòu)分析 172．蛋白質(zhì)序列的結(jié)構(gòu)功能域分析 183．蛋白質(zhì)的亞細(xì)胞定位 194．氨基酸序列三級(jí)結(jié)構(gòu)的分析 205．系統(tǒng)進(jìn)化樹的構(gòu)建及其進(jìn)化分析 20四、結(jié)果討論 21（一）核酸序列的基本分析 21（二）氨基酸序列的基本分析 21（三）蛋白質(zhì)高級(jí)結(jié)構(gòu)分析及功能預(yù)測(cè) 22（四）結(jié)論 22五、參考文獻(xiàn) 22

原雞基因CD8a生物信息學(xué)初步分析BioinformaticalAnalysisofaGallusgallusCD8aGene一、綜述生物信息學(xué)是一門新興的前沿的科學(xué)，它隨著計(jì)算機(jī)的技術(shù)的發(fā)展，逐步應(yīng)用于農(nóng)林學(xué)、生物學(xué)、醫(yī)學(xué)等研究中ADDINEN.CITE<EndNote><Cite><Author>Bernard</Author><RecNum>5</RecNum><record><rec-number>5</rec-number><foreign-keys><keyapp="EN"db-id="desxa5zpj55x9yefpfqvxd2ypfe5xevrdptz">5</key></foreign-keys><ref-typename="JournalArticle">17</ref-type><contributors><authors><author>Bernard,V.</author><author>Michaut,M.</author></authors></contributors><auth-address>NextGenerationSequencingPlatform-ICGex,CurieInstitute,Paris,France.</auth-address><titles><title>Explainbioinformaticstoyourgrandmother!</title><secondary-title>PLoSComputBiol</secondary-title></titles><periodical><full-title>PLoSComputBiol</full-title></periodical><pages>e1003305</pages><volume>9</volume><number>10</number><edition>2013/11/10</edition><dates><pub-dates><date>Oct</date></pub-dates></dates><isbn>1553-7358(Electronic) 1553-734X(Linking)</isbn><accession-num>24204239</accession-num><urls><related-urls><url>/entrez/query.fcgi?cmd=Retrieve&db=PubMed&dopt=Citation&list_uids=24204239</url></related-urls></urls><electronic-resource-num>10.1371/journal.pcbi.1003305 PCOMPBIOL-D-13-00879[pii]</electronic-resource-num><language>eng</language></record></Cite></EndNote>[1]，通過各種軟、數(shù)據(jù)庫、服務(wù)器對(duì)生物分子的分析及功能預(yù)測(cè)，在科技領(lǐng)域顯示了它越來越重要的作用。本文就是利用生物信息學(xué)方法，對(duì)原雞的CD8a進(jìn)行初步分析。原雞不僅適應(yīng)于熱帶、亞熱帶地區(qū)飼養(yǎng)繁衍，而且對(duì)高寒地區(qū)也具有良好的適應(yīng)能力，全年各個(gè)季節(jié)全國各地均可飼養(yǎng)。而且其抗病能力強(qiáng)，病害少，育雛成活率高，達(dá)到98%左右，屬于中國二級(jí)保護(hù)動(dòng)物。CD8分子是T淋巴細(xì)胞表面的I型跨膜蛋白ADDINEN.CITE<EndNote><Cite><Author>Wu</Author><RecNum>108</RecNum><record><rec-number>108</rec-number><foreign-keys><keyapp="EN"db-id="zdxed0p5hs9zroeapxd5zfd89zzz9twvpx5v">108</key></foreign-keys><ref-typename="JournalArticle">17</ref-type><contributors><authors><author>Wu,T.L.</author><author>Li,H.</author><author>Faust,S.M.</author><author>Chi,E.</author><author>Zhou,S.</author><author>Wright,F.</author><author>High,K.A.</author><author>Ertl,H.C.</author></authors></contributors><auth-address>1]DepartmentofImmunology,TheWistarInstitute,Philadelphia,Pennsylvania,USA[2]SchoolofMedicine,UniversityofPennsylvania,Philadelphia,Pennsylvania,USA[3]DepartmentofImmuneCellDevelopmentandHostDefense,FoxChaseCancerCenter,Philadelphia,Pennsylvania,USA.</auth-address><titles><title>CD8TCellRecognitionofEpitopesWithintheCapsidofAdeno-associatedVirus8-basedGeneTransferVectorsDependsonVectors'Genome</title><secondary-title>MolTher</secondary-title></titles><periodical><full-title>MolTher</full-title></periodical><edition>2013/10/01</edition><dates><pub-dates><date>Sep30</date></pub-dates></dates><isbn>1525-0024(Electronic) 1525-0016(Linking)</isbn><accession-num>24077034</accession-num><urls><related-urls><url>/entrez/query.fcgi?cmd=Retrieve&db=PubMed&dopt=Citation&list_uids=24077034</url></related-urls></urls><electronic-resource-num>mt2013218[pii] 10.1038/mt.2013.218</electronic-resource-num><language>Eng</language></record></Cite></EndNote>[2]，也是T淋巴細(xì)胞表面重要的標(biāo)志性分子ADDINEN.CITEADDINEN.CITE.DATA[3,4]。雞的CD8分子主要表達(dá)在細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞ADDINEN.CITE<EndNote><Cite><Author>Trifari</Author><RecNum>45</RecNum><record><rec-number>45</rec-number><foreign-keys><keyapp="EN"db-id="zdxed0p5hs9zroeapxd5zfd89zzz9twvpx5v">45</key></foreign-keys><ref-typename="JournalArticle">17</ref-type><contributors><authors><author>Trifari,S.</author><author>Pipkin,M.E.</author><author>Bandukwala,H.S.</author><author>Aijo,T.</author><author>Bassein,J.</author><author>Chen,R.</author><author>Martinez,G.J.</author><author>Rao,A.</author></authors></contributors><auth-address>SignalingandGeneExpressionDivision,LaJollaInstituteforAllergyandImmunology,SanDiego,CA92037.</auth-address><titles><title>MicroRNA-directedprogramofcytotoxicCD8+T-celldifferentiation</title><secondary-title>ProcNatlAcadSciUSA</secondary-title></titles><periodical><full-title>ProcNatlAcadSciUSA</full-title></periodical><pages>18608-13</pages><volume>110</volume><number>46</number><edition>2013/10/29</edition><dates><pub-dates><date>Nov12</date></pub-dates></dates><isbn>1091-6490(Electronic) 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10.1073/pnas.1317191110</electronic-resource-num><language>eng</language></record></Cite></EndNote>[5]、抑制性T細(xì)胞和樹突狀細(xì)胞的表面。ADDINEN.CITE<EndNote><Cite><Author>Brown</Author><RecNum>28</RecNum><record><rec-number>28</rec-number><foreign-keys><keyapp="EN"db-id="zdxed0p5hs9zroeapxd5zfd89zzz9twvpx5v">28</key></foreign-keys><ref-typename="JournalArticle">17</ref-type><contributors><authors><author>Brown,A.S.</author><author>Bourges,D.</author><author>Ang,D.K.</author><author>Hartland,E.L.</author><author>vanDriel,I.R.</author></authors></contributors><auth-address>TheDepartmentofBiochemistryandMolecularBiology,TheBio21MolecularScienceandBiotechnologyInstitute,TheUniversityofMelbourne,Parkville,Victoria,Australia.</auth-address><titles><title>CD8subunitexpressionbyplasmacytoiddendriticcellsisvariable,anddoesnotdefinestablesubsets</title><secondary-title>MucosalImmunol</secondary-title></titles><periodical><full-title>MucosalImmunol</full-title></periodical><edition>2013/11/07</edition><dates><pub-dates><date>Nov6</date></pub-dates></dates><isbn>1935-3456(Electronic) 1933-0219(Linking)</isbn><accession-num>24192911</accession-num><urls><related-urls><url>/entrez/query.fcgi?cmd=Retrieve&db=PubMed&dopt=Citation&list_uids=24192911</url></related-urls></urls><electronic-resource-num>mi201391[pii] 10.1038/mi.2013.91</electronic-resource-num><language>Eng</language></record></Cite></EndNote>[6]CD8分子是二聚體，并有CD8aa同型二聚體和CD8aβ異型二聚體兩種表達(dá)形式。CD8主要識(shí)別MHCⅠ類分子遞呈的內(nèi)源性抗原；雞CD8分子是雞免疫系統(tǒng)的重要組成部分，與哺乳動(dòng)物的CD8分子在生物進(jìn)化和功能上有明顯的相似性ADDINKyMedRef2008REF:REF[12，13]。CD8a參與胸腺分化以及T細(xì)胞活化的信號(hào)傳導(dǎo),ADDINEN.CITE<EndNote><Cite><Author>Cho</Author><RecNum>41</RecNum><record><rec-number>41</rec-number><foreign-keys><keyapp="EN"db-id="zdxed0p5hs9zroeapxd5zfd89zzz9twvpx5v">41</key></foreign-keys><ref-typename="JournalArticle">17</ref-type><contributors><authors><author>Cho,J.H.</author><author>Kim,H.O.</author><author>Kim,K.S.</author><author>Yang,D.H.</author><author>Surh,C.D.</author><author>Sprent,J.</author></authors></contributors><auth-address>ImmunologyResearchProgram,GarvanInstituteofMedicalResearch,Darlinghurst,NewSouthWales2010,Australia;</auth-address><titles><title>UniqueFeaturesofNaiveCD8+TCellActivationbyIL-2</title><secondary-title>JImmunol</secondary-title></titles><periodical><full-title>JImmunol</full-title></periodical><edition>2013/10/30</edition><dates><pub-dates><date>Oct28</date></pub-dates></dates><isbn>1550-6606(Electronic) 0022-1767(Linking)</isbn><accession-num>24166977</accession-num><urls><related-urls><url>/entrez/query.fcgi?cmd=Retrieve&db=PubMed&dopt=Citation&list_uids=24166977</url></related-urls></urls><electronic-resource-num>jimmunol.1302293[pii] 10.4049/jimmunol.1302293</electronic-resource-num><language>Eng</language></record></Cite></EndNote>[7]而CD8β主要協(xié)助CD8a發(fā)揮生物學(xué)功能。通過對(duì)不同物種的CD8a核酸序列的分析，人們發(fā)現(xiàn)CD8a是一個(gè)功能類似而且較為保守的跨膜蛋白，約由230個(gè)氨基酸組成，包含一個(gè)規(guī)范的信號(hào)肽，一個(gè)Ig高變區(qū)，Ig高變區(qū)暴露于同源的免疫球蛋白的CDR1、2、3的鉤環(huán)區(qū)；緊接著Ig高變區(qū)的是富含脯氨酸的鉸鏈區(qū)，之后是由二十個(gè)氨基酸構(gòu)成的跨膜區(qū)。本文首先對(duì)核酸序列進(jìn)行基本分析，通過對(duì)酶切位點(diǎn)的分析，我們可以對(duì)本條核酸序列酶切及體外擴(kuò)增，用于分子實(shí)驗(yàn)。對(duì)氨基酸序列的分析，我們可以找到其磷酸化的位置，有無信號(hào)肽，以及亞細(xì)胞定位和其二級(jí)結(jié)構(gòu)等，在此基礎(chǔ)上，來分析預(yù)測(cè)結(jié)構(gòu)和功能的關(guān)系。對(duì)CD8a基因的生物信息學(xué)分析，通過比較相同基因和不同基因的等位基因，有助于研究不同基因間的進(jìn)化關(guān)系，以及進(jìn)一步研究CD8a與免疫系統(tǒng)防御的關(guān)系，所以在原雞養(yǎng)殖和優(yōu)良育種方面具有很好的應(yīng)用前景ADDINEN.CITE<EndNote><Cite><Author>Meng</Author><RecNum>5</RecNum><record><rec-number>5</rec-number><foreign-keys><keyapp="EN"db-id="0w5v2v598ftz2ge2pvp5v0aufx0909sef5xz">5</key></foreign-keys><ref-typename="JournalArticle">17</ref-type><contributors><authors><author>Meng,X.T.</author><author>Hou,N.N.</author><author>Wang,X.J.</author><author>Jiao,H.C.</author><author>Zhao,J.P.</author><author>Song,Z.G.</author><author>Lin,H.</author></authors></contributors><auth-address>LabofEconutrition,DepartmentofAnimalScience,ShandongAgriculturalUniversity,Taian,Shandong271018,PRChina;ShandongKeyLabofAnimalBioengineeringandDiseaseControlandPrevention,Shandong,PRChina.</auth-address><titles><title>Increasedhepaticyolkprecursorsynthesis,secretionandfacilitateduptakebyfolliclesareinvolvedintherejuvenationofreproductiveperformanceofmoltedhens(Gallusgallusdomesticus)</title><secondary-title>GenCompEndocrinol</secondary-title></titles><periodical><full-title>GenCompEndocrinol</full-title></periodical><pages>198-207</pages><volume>194C</volume><edition>2013/10/01</edition><dates><pub-dates><date>Sep26</date></pub-dates></dates><isbn>1095-6840(Electronic) 0016-6480(Linking)</isbn><accession-num>24076539</accession-num><urls><related-urls><url>/entrez/query.fcgi?cmd=Retrieve&db=PubMed&dopt=Citation&list_uids=24076539</url></related-urls></urls><electronic-resource-num>S0016-6480(13)00385-7[pii] 10.1016/j.ygcen.2013.09.007</electronic-resource-num><language>Eng</language></record></Cite></EndNote>[8]。二、分析研究材料與方法（一）研究材料研究對(duì)象是原雞的CD8a作為研究材料，長度為648bp，在GenBank的登錄號(hào)為NM_205235.1。（二）研究方法及工具本論文采用生物信息學(xué)方法，用計(jì)算機(jī)對(duì)草魚的原雞的CD8a（648bp）的結(jié)構(gòu)、功能及進(jìn)化地位進(jìn)行了研究，主要用到的生物信息學(xué)數(shù)據(jù)庫、分析軟件以及網(wǎng)絡(luò)服務(wù)器如下 數(shù)據(jù)庫：NCBI（NationalCenterforBiotechnologyInformation，美國國家生物技術(shù)信息中心）軟件：Bioedit（用于核酸序列編輯與分析）DiscoverstudioVisualizer（用于蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的分析）MEGA（用于分子進(jìn)化遺傳分析） 網(wǎng)絡(luò)服務(wù)器（主要用于蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的預(yù)測(cè)）：BLAST程序（用于同源序列的比對(duì)）scratchProteinPredictor（蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)）Swiss-model；CBS服務(wù)器的NetPhos2.0ServerExposé服務(wù)器的ProstateCBS服務(wù)器的TMHMMServerv.2.0CBS服務(wù)器的SignalP3.0serverPBILLYON-GERLAND信息庫SMARTCBS服務(wù)器的CPHmodelsWolfPSORTCDART:ConservedDomainArchitectureRetrievalTool（三）分析方法和具體步驟首先，登錄NCBI，將待分析核酸序列存為FASTA格式，命名為48。將氨基酸序列存為FASTA格式，命名為CD8a。1.對(duì)本條核酸序列一級(jí)結(jié)構(gòu)的分析（1）核酸序列的基本分析采用Bioedit軟件，打開Bioedit，選擇文件，將保存好的FASTA格式的核酸序列打開。選中本條序列后點(diǎn)擊Sequence→NucleicAcid→NucleotideComposition，就會(huì)顯示核酸序列的分子量、堿基數(shù)量等結(jié)果，保存這個(gè)結(jié)果。（2）核酸序列的酶切圖譜分析用Chromaspro軟件進(jìn)行限制性酶切位點(diǎn)的分析，在Chromaspro軟件中打開該序列的FASTA格式，再點(diǎn)Analysis→RestrictionEnzyme，選擇allEnzyme即可顯示出分析結(jié)果，保存結(jié)果。（3）同源序列的搜索與對(duì)比首先打開NCBI首頁，再打開Blast，在BasicBlast中選Nucleotideblast。頁面打開后，在對(duì)話框中瀏覽文件，選擇保存好的FASTA格式的核酸序列，在Database中選others(nretc)，默認(rèn)其它參數(shù)。最后點(diǎn)BLAST，顯示分析結(jié)果，保存。2．氨基酸序列的初步分析（1）氨基酸序列的組成打開BioEdit軟件，打開本條氨基酸編碼的氨基酸序列，選中序列，點(diǎn)Sequence→Protein→AminoAcidComposition，顯示結(jié)果，保存。（2）氨基酸序列的磷酸化位點(diǎn)分析運(yùn)用丹麥科技大學(xué)（DTU）的CBS服務(wù)器上的NetPhos2.0Server程序。網(wǎng)址：http://www.cbs.dtu.dk/services/NetPhos/打開網(wǎng)址，瀏覽文件，選中FASTA格式的氨基酸序列，之后，在參數(shù)中選擇：tyrosine（酪氨酸）、threonine（苯丙氨酸）、serine（絲氨酸）這三種氨基酸為了看是這三種氨基酸否被磷酸化，點(diǎn)擊Submit提交，最后結(jié)果以圖像形式輸出。（3）氨基酸序列疏水性和親水性分析采用ExPAsy服務(wù)器上的ProtScale程序進(jìn)行氨基酸的疏水性分析網(wǎng)址：/cgi-bin/protscale.pl打開網(wǎng)址，之后將氨基酸序列復(fù)制粘貼到對(duì)話框，在參數(shù)選擇中，有不同的Windowsize和aminoacidscale，選擇不同的參數(shù)會(huì)得到不同的結(jié)果，在這里，我們選擇：Hphob./Roseman，點(diǎn)擊Sumbit提交，出現(xiàn)結(jié)果并保存。（4）氨基酸序列的跨膜區(qū)分析運(yùn)用丹麥科技大學(xué)（DTU）的CBS服務(wù)器上的TMHMMServerv.2.0程序。網(wǎng)址：http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/打開網(wǎng)址，瀏覽文件，將氨基酸序列的FASTA格式選入對(duì)話框中，輸出形式選Extensive，withgraphic，最后點(diǎn)擊Submit（提交），稍后會(huì)出現(xiàn)分析結(jié)果，保存結(jié)果。（5）氨基酸序列的信號(hào)肽預(yù)測(cè)使用SignalP3.0server程序。網(wǎng)址：http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/首先打開網(wǎng)址，瀏覽文件，將氨基酸序列FASTA格式選入對(duì)話框中，選擇參數(shù)：Organismgroup：選Eukaryotes（真核細(xì)胞）；Method（神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)算法）：本實(shí)驗(yàn)為了比較選Both；Graphics：選擇GIF(inline)；Outputformat：選擇Standard（標(biāo)準(zhǔn)）輸出方式；Truncation：由于無法預(yù)測(cè)信號(hào)肽長度一般選擇（0）阻斷，本次實(shí)驗(yàn)為了比較還選擇（30）為阻斷常數(shù)。點(diǎn)Submit按鈕，出現(xiàn)結(jié)果并保存。3.氨基酸高能結(jié)構(gòu)的分析（1）氨基酸序列的二級(jí)結(jié)構(gòu)分析及預(yù)測(cè)運(yùn)用PBILLYON-GERLAND數(shù)據(jù)庫對(duì)氨基酸的序列進(jìn)行二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)。網(wǎng)址：http://npsa-pbil.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl?page=/NPSA/npsa_hnn.html首先，打開網(wǎng)址，把氨基酸序列粘貼在對(duì)話框中。點(diǎn)擊Submit（提交），顯示結(jié)果并保存。（2）氨基酸序列的結(jié)構(gòu)功能域分析用簡單模塊構(gòu)架搜索工具SMART對(duì)氨基酸序列序列進(jìn)行結(jié)構(gòu)功能域分析。網(wǎng)址：http://smart.embl-heidelberg.de/，打開網(wǎng)址，在首頁上點(diǎn)throuththispage，進(jìn)入新頁面。在Sequence中粘貼氨基酸序列，最后點(diǎn)SequenceSMART即可得到結(jié)果，保存結(jié)果。（3）蛋白質(zhì)的亞細(xì)胞定位運(yùn)用WoLFPSORT程序?qū)Π被嵝蛄羞M(jìn)行亞細(xì)胞定位。網(wǎng)址：http://wolfpsort.seq.cbrc.jp/首先，打開網(wǎng)址，在“selectanorganismtype”中選擇“Animal”。之后，“Pleaseselectinputmethod”選擇“FromFile”；瀏覽文件，選入FASTA格式的氨基酸序列，最后，提交，將結(jié)果保存。(4)氨基酸序列三級(jí)結(jié)構(gòu)分析運(yùn)用丹麥科技大學(xué)(DTU)的CBS服務(wù)器上的CPHmodel3.0程序?qū)Π被嵝蛄羞M(jìn)行三級(jí)結(jié)構(gòu)的分析。網(wǎng)址：http://www.cbs.dtu.dk/services/CPHmodels/首先打開網(wǎng)址，將氨基酸序列放入對(duì)話框，點(diǎn)Submit，將新頁面中的Email地址填好，幾分鐘之后將結(jié)果打開，點(diǎn)query.pdb下載pdb格式的文件。打開AccelrysDiscoveryStudioVisualizer3.1軟件，在OPEN里打開剛才下載的文件，即可出現(xiàn)蛋白質(zhì)的3D結(jié)構(gòu)，保存結(jié)果。（5）系統(tǒng)發(fā)生樹的構(gòu)建及進(jìn)化地位分析運(yùn)用MEGA4軟件對(duì)的核酸序列和氨基酸序列進(jìn)行同源性分析，并繪制出系統(tǒng)發(fā)生樹。通過NCBI數(shù)據(jù)庫，BioEdit和MEGA軟件進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)生樹的構(gòu)建，來進(jìn)行進(jìn)化地位分析。首先在NCBI中通過ProteinBlast找到與該EST氨基酸序列相似的序列，并下載它們的氨基酸序列，連同本文預(yù)測(cè)序列一起放入一個(gè)記事本中保存，在BioEdit中打開，用FASTA格式保存。用MEGA軟件構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹。打開MEGA→Alignment→Alignmentexplorer/CLUSTAL→選createanewalignment，點(diǎn)OK→在彈出的對(duì)話框中點(diǎn)NO（表示放入的序列是蛋白質(zhì)的）→又出現(xiàn)了一個(gè)對(duì)話框，打開之前保存的FASTA格式的氨基酸序列→全選，再點(diǎn)W（AlignselectedblockbyclustalW）→點(diǎn)OK→然后再點(diǎn)Data→exportalignment→MEGAformat，保存→在之前小MEGA中打開上步保存的meg→phylogeny→constructphylogeny→最后再選NJ或MP即可得到進(jìn)化樹，保存結(jié)果。三、預(yù)測(cè)結(jié)果與分析登陸NCBI，登陸號(hào)為NM_205235.1，將核酸序列和氨基酸序列保存為FASTA格式，用來下文分析。（一）核酸序列一級(jí)結(jié)構(gòu)分析1．核酸序列基本分析運(yùn)用Bioedit軟件分析核酸序列的分子質(zhì)量、堿基組成和堿基分布。結(jié)果如下：圖1核酸序列4種堿基百分比直方圖通過分析，統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)得表一：堿基組成分析表ATCG數(shù)量170193162123百分比26.23﹪29.78﹪25.00﹪18.98﹪本序列全長648bp，單鏈分子量198449.00Daltons，雙鏈分子量394483.00Daltons。2.核酸序列的酶切圖譜分析結(jié)果如圖，包含了多種酶的限制性酶切位點(diǎn)。圖2核酸序列酶切位點(diǎn)預(yù)測(cè)圖3．堿基同源性初步分析在NCBI中，將本條序列BLAST，得到以下結(jié)果圖3核酸序列堿基同源性對(duì)比圖（1）圖4核酸序列堿基同源性對(duì)比圖（2）本文序列預(yù)測(cè)額和原雞CD8a分子基因相似度高達(dá)100%，我們跟蹤其中一條序列，得到以下結(jié)果圖5核酸序列堿基同源性對(duì)比圖（3）這是原雞CD8a分子基因和本條核酸序列的對(duì)照，在原雞的第62個(gè)堿基到第709個(gè)之間，這倆條序列相同。（二）氨基酸序列的初步分析1．氨基酸序列的組成用Bioedit軟件對(duì)氨基酸組成分析結(jié)果如下：圖6氨基酸百分比直方圖表2氨基酸組成分析表AminoAcidNumberMol﹪AminoAcidNumberMol﹪AlaA156.94MetM41.85CysC94.17AsnN136.02AspD52.31Prop156.94GluE94.17GlnQ146.48PheF125.56ArgR167.41GlyG125.56SerS177.87HisH41.85ThrT167.41IleI125.56ValV115.09LysK115.09TrpW20.93LeuL156.94Tyry41.852．磷酸位點(diǎn)的預(yù)測(cè)結(jié)果顯示，有9個(gè)絲氨酸（Ser）,2個(gè)蘇氨酸（Thr），1個(gè)酪氨酸（Tyr）可能被磷酸化，可能性分析如下：圖7序列中可能的磷酸化位點(diǎn)（1）圖8序列中可能的磷酸化位點(diǎn)（2）3．氨基酸的疏水性和親水性分析得到以下結(jié)果圖9氨基酸的親/疏水性分布圖氨基酸序列的親疏水性決定了蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)，從輸出結(jié)果來看，氨基酸序列集中在-1附近，所以疏水性不強(qiáng)，屬于親水性氨基酸。4．氨基酸的跨膜區(qū)分布運(yùn)用丹麥科技大學(xué)（DTU）的CBS服務(wù)器上的TMHMMServerv.2.0程序?qū)υ撔蛄羞M(jìn)行蛋白質(zhì)序列的跨膜區(qū)分析。得到結(jié)果如下圖圖9氨基酸序列跨膜區(qū)分析圖從分析結(jié)果來看，本條氨基酸序列中有一個(gè)跨膜區(qū)。5．信號(hào)肽區(qū)域的預(yù)測(cè)圖10氨基酸序列信號(hào)肽分析通過分析，本條序列沒有信號(hào)肽。（三）氨基酸高能結(jié)構(gòu)的分析1．氨基酸的二級(jí)結(jié)構(gòu)分析圖11氨基酸的二級(jí)結(jié)構(gòu)分析圖表3二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)結(jié)果a螺旋 （Hh）4922.69％310螺旋（Gg）00.00％Pi螺旋（Ii）00.00％β片層(Bb)00.00％延伸鏈(Ee)3415.74％β轉(zhuǎn)角(Tt)00.00％彎曲域(Ss)00.00％無規(guī)卷曲(Cc)13361.57％任意形式00.00％其它形式00.00％圖12氨基酸二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)圖13二級(jí)結(jié)構(gòu)分析直觀結(jié)果通過表格和上圖我們可以看出這條氨基酸序列的二級(jí)結(jié)構(gòu)主要是a螺旋，占22.69%；延伸鏈，占15.74%；無規(guī)卷曲，占61.57﹪，并且分布不連續(xù)。2．蛋白質(zhì)序列的結(jié)構(gòu)功能域分析有輸出結(jié)果，我們得出，本條序列的功能域是由第23個(gè)氨基酸到第133個(gè)氨基酸編碼的IG結(jié)構(gòu)域。E值是1.63e-03。3．蛋白質(zhì)的亞細(xì)胞定位運(yùn)用WoLFPSORT程序?qū)Π被嵝蛄羞M(jìn)行亞細(xì)胞定位。結(jié)果如下：圖15亞細(xì)胞定位分析結(jié)果圖（1）圖16亞細(xì)胞定位分析結(jié)果圖（2）圖17亞細(xì)胞定位分析結(jié)果圖（3）通過分析結(jié)果，我們得出亞細(xì)胞定位分析蛋白質(zhì)位于細(xì)胞膜上。4．氨基酸序列三級(jí)結(jié)構(gòu)的分析結(jié)果及分析圖18三級(jí)結(jié)構(gòu)模型以上是蛋白質(zhì)三級(jí)結(jié)構(gòu)的模型圖，有α螺旋和很多的無規(guī)卷曲，其余為延伸鏈。5．系統(tǒng)進(jìn)化樹的構(gòu)建及其進(jìn)化分析圖19絕對(duì)保守區(qū)（局部）圖19N-J法構(gòu)建的刺痛發(fā)生樹圖20M-P法構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)生樹通過以上的分析結(jié)果顯示，兩種方法構(gòu)建的系統(tǒng)樹，本文所研究的序列和其他物種同源序列之間的關(guān)系基本一致。預(yù)測(cè)蛋白與火雞最接近，所以預(yù)測(cè)它們?cè)诮Y(jié)構(gòu)和功能方面處于同一進(jìn)化地位。（四）結(jié)果討論（一）核酸序列的基本分析通過對(duì)本條序列以上幾方面的分析，我們可以得出：該條序列是一條全長648bp的mDNA，含有多種酶的酶切性位點(diǎn)，通過得出的酶切位點(diǎn)的信息，我們可以對(duì)本條核酸序列酶切及體外擴(kuò)增，用于分子實(shí)驗(yàn)。通過堿基的同源性分析，與其他雞形目CD8a序列比較相似，相對(duì)保守。（二）氨基酸序列的基本分析通過氨基酸序列的分析，我們發(fā)現(xiàn)此序列編碼的蛋白質(zhì)有較強(qiáng)的保守性。有9個(gè)絲氨酸（Ser）,2個(gè)蘇氨酸（Thr），1個(gè)酪氨酸（Tyr）可能被磷酸化，氨基酸序列的親疏水性決定了蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)，從輸出結(jié)果來看，氨基酸大部分序列的值小于0，疏水性不強(qiáng)，屬于親水性氨基酸。本條氨基酸序列有一個(gè)跨膜區(qū)，沒有信號(hào)肽區(qū)域，懷疑此序列結(jié)構(gòu)和功能域不完全，需要再進(jìn)行進(jìn)一步分析。（三）蛋白質(zhì)高級(jí)結(jié)構(gòu)分析及功能預(yù)測(cè)蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)主要是α螺旋，占22.69%；延伸鏈，占15.74%；無規(guī)卷曲，占61.57%，并且分布不連續(xù)。本條序列的功能域是由第23個(gè)氨基酸到第133個(gè)氨基酸編碼的IG結(jié)構(gòu)域。E值是1.63e-03.經(jīng)過亞細(xì)胞定位分析，蛋白質(zhì)位于線粒體。通過M-P法構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)生樹可以預(yù)測(cè)蛋白與火雞最接近，所以預(yù)測(cè)它們?cè)诮Y(jié)構(gòu)和功能方面處于同一進(jìn)化地位。（四）結(jié)論CD8分子是T淋巴細(xì)胞表面的I型跨膜蛋白ADDINKyMedRef2008REF:REF[11,14]，也是T淋巴細(xì)胞表面重要的標(biāo)志性分子ADDINEN.CITE<EndNote><Cite><Author>Zelinskyy</Author><RecNum>48</RecNum><record><rec-number>48</rec-number><foreign-keys><keyapp="EN"db-id="zdxed0p5hs9zroeapxd5zfd89zzz9twvpx5v">48</key></foreign-keys><ref-typename="JournalArticle">17</ref-type><contributors><authors><author>Zelinskyy,G.</author><author>Werner,T.</author><author>Dittmer,U.</author></authors></contributors><titles><title>NaturalregulatoryTcellsinhibitproductionofcytotoxicmoleculesinCD8+Tcellsduringlow-levelFriendretrovirusinfection</title><secondary-title>Retrovirology</secondary-title></titles><periodical><full-title>Retrovirology</full-title></periodical><pages>109</pages><volume>10</volume><number>1</number><edition>2013/10/26</edition><dates><pub-dates><date>Oct24</date></pub-dates></dates><isbn>1742-4690(Electronic) 1742-4690(Linking)</isbn><accession-num>24156479</accession-num><urls><related-urls><url>/entrez/query.fcgi?cmd=Retrieve&db=PubMed&dopt=Citation&list_uids=24156479</url></related-urls></urls><electronic-resource-num>1742-4690-10-109[pii] 10.1186/1742-4690-10-109</electronic-resource-num><language>Eng</language></record></Cite></EndNote>[9]。CD8分子是二聚體，并有CD8aa同型二聚體和CD8aβ異型二聚體兩種表達(dá)形式ADDINKyMedRef2008REF:REF[15]。其中，CD8a是一個(gè)功能類似而且較為保守的跨膜蛋白，約由230個(gè)氨基酸組成，包含一個(gè)規(guī)范的信號(hào)肽，一個(gè)Ig高變區(qū)，Ig高變區(qū)暴露于同源的免疫球蛋白的CDR1、2、3的鉤環(huán)區(qū)；緊接著Ig高變區(qū)的是富含脯氨酸的鉸鏈區(qū)，之后是由二十個(gè)氨基酸構(gòu)成的跨膜區(qū)。本文預(yù)測(cè)的蛋白質(zhì)含216個(gè)氨基酸，從結(jié)果來看，沒有信號(hào)肽，無法實(shí)行穿膜功能，但是有跨膜區(qū)，至于其是怎樣完成穿膜，需要我們進(jìn)一步分析。通過以上分析結(jié)果，推測(cè)該蛋白質(zhì)可能是與其他同源基因編碼的a鏈和β鏈結(jié)合共同完成免疫功能?，F(xiàn)今普遍認(rèn)為，CD8分子是參與TCR信號(hào)傳導(dǎo)的輔受體。作為輔受體，CD8在信號(hào)傳導(dǎo)中起重要作用，通過p56lck和CD3鏈間的酪氨酸磷酸化途徑激活TCRADDINEN.CITE<EndNote><Cite><Author>Gonzalez-Serna</Author><RecNum>15</RecNum><record><rec-number>15</rec-number><foreign-keys><keyapp="EN"db-id="zdxed0p5hs9zroeapxd5zfd89zzz9twvpx5v">15</key></foreign-keys><ref-typename="JournalArticle">17</ref-type><contributors><authors><author>Gonzalez-Serna,A.</author><author>Abad-Fernandez,M.</author><author>Soriano-Sarabia,N.</author><author>Leal,M.</author><author>Vallejo,A.</author></authors></contributors><auth-address>LaboratoryofImmunovirology,DepartmentofInfectiousDiseases,HospitalVirgendelRocio,IBIS,Seville41013,Spain.</auth-address><titles><title>CD8TCRbetachainrepertoireexpansionsanddeletionsarerelatedwithimmunologicmarkersinHIV-1-infectedpatientsduringtreatmentinterruption</title><secondary-title>JClinVirol</secondary-title></titles><periodical><full-title>JClinVirol</full-title></periodical><edition>2013/11/12</edition><dates><pub-dates><date>Oct24</date></pub-dates></dates><isbn>1873-5967(Electronic) 1386-6532(Linking)</isbn><accession-num>24210957</accession-num><urls><related-urls><url>/entrez/query.fcgi?cmd=Retrieve&db=PubMed&dopt=Citation&list_uids=24210957</url></related-urls></urls><electronic-resource-num>S1386-6532(13)00465-4[pii] 10.1016/j.jcv.2013.10.017</electronic-resource-num><language>Eng</language></record></Cite></EndNote>[10]。最近的數(shù)據(jù)表明，CD8具有一系列重要免疫學(xué)功能的跨膜分子。五、參考文獻(xiàn)ADDINEN.REFLIST1. 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