食品毒理學實驗基礎

關于食品毒理學實驗基礎第1頁，課件共80頁，創(chuàng)作于2023年2月主要內(nèi)容第一節(jié)食品毒理學實驗的原則和局限性

第二節(jié)毒理學毒性評價試驗的基本目的

第三節(jié)實驗動物的選擇和處理

第四節(jié)食品毒理學試驗設計要點

第五節(jié)實驗動物的染毒和處置

第六節(jié)體外試驗在毒理學中的應用第2頁，課件共80頁，創(chuàng)作于2023年2月食品毒理學作為一門實驗科學，以動物實驗為中心。食品毒理學研究的主要手段是動物實驗。食品毒理學動物實驗的設計、實施、結(jié)果觀察和評價是毒理學研究的基本方法。第3頁，課件共80頁，創(chuàng)作于2023年2月食品毒理學研究的主要手段是動物、實驗。

體內(nèi)試驗是以實驗動物為模型，最終目的是通過外源化學物對實驗動物的毒性反應，向人(原型)外推，以期評估外源化學物對人的危害及危險性。體外實驗主要用于篩選和預測急性毒性和機制研究。第4頁，課件共80頁，創(chuàng)作于2023年2月以科學研究為目的而進行科學飼養(yǎng)繁殖的動物稱為實驗動物。★實驗動物種類：常見包括：大鼠、小鼠、豚鼠、家兔、狗、貓、猴、小型豬、雞、青蛙、蟾蜍、魚類等。第5頁，課件共80頁，創(chuàng)作于2023年2月豚鼠：特點是毛短而光滑，生長快，抗病力強，繁殖性能好。廣泛用于藥物學、傳染病學、免疫學、營養(yǎng)學、耳科學等各項醫(yī)學及生物學的研究中。

第6頁，課件共80頁，創(chuàng)作于2023年2月SD大鼠：白色，產(chǎn)仔多，生長發(fā)育較Wistar大鼠為快，對疾病的抵抗力尤以呼吸道疾病的抵抗力強。自發(fā)腫瘤發(fā)生率較低，對性激素感受性高。第7頁，課件共80頁，創(chuàng)作于2023年2月BALB/c小鼠：對致癌因子敏感，對放射性照射極為敏感。生產(chǎn)性能良好，繁殖期長，廣泛應用于腫瘤學、生理學、免疫學、核醫(yī)學和單克隆抗體等研究。第8頁，課件共80頁，創(chuàng)作于2023年2月第9頁，課件共80頁，創(chuàng)作于2023年2月意義:實驗動物是生命科學（生物、醫(yī)學、食品等）研究的重要基礎和支撐條件，在科研、教學、生產(chǎn)、檢定、安全評價和成果評定中都離不開實驗動物，被稱為“活的儀器、活試劑”。英國一位科學家曾這樣比喻：“在生命科學研究中使用實驗動物就象在分析化學中使用分析天平一樣重要”。第10頁，課件共80頁，創(chuàng)作于2023年2月

落戶武漢大學實驗動物中心的慰靈碑，旨在紀念在抗非典疫苗和藥物實驗中為人類健康獻身的38只恒河猴第11頁，課件共80頁，創(chuàng)作于2023年2月第一節(jié)食品毒理學實驗的原則和局限性

食品毒理學實驗的原則化學物在實驗動物產(chǎn)生的作用，可以外推于人實驗動物必須暴露于高劑量成年的健康實驗動物(雄性和雌性未孕)和人可能的暴露途徑是基本的選擇代表性、可重復性第12頁，課件共80頁，創(chuàng)作于2023年2月化學物在實驗動物產(chǎn)生的作用，可以外推于人①人是最敏感的動物物種；②人和實驗動物的生物學過程包括化學物的代謝，與體重(或體表面積)相關。這兩個假設也是全部實驗生物學和醫(yī)學的前提。以單位體表面積計算在人產(chǎn)生毒作用的劑量和實驗動物通常相近似。而以體重計算則人通常比實驗動物敏感，差別可能達10倍。因此可以利用安全系數(shù)來計算人的相對安全劑量。第13頁，課件共80頁，創(chuàng)作于2023年2月第二個原則是實驗動物必須暴露于高劑量，這是發(fā)現(xiàn)對人潛在危害的必需的和可靠的方法。毒理學試驗中，一般要設3個或3個以上劑量組，以觀察劑量-反應(效應)關系，確定受試化學物引起毒效應及其毒性參數(shù)。引起毒效應的最低劑量(LOAEL)與人的暴露劑量接近時，說明該化學物不安全。當該劑量與人的暴露劑量有很大的距離(幾十倍，幾百倍或以上)，才認為具有一定安全性，此距離越大，安全性越可靠。第14頁，課件共80頁，創(chuàng)作于2023年2月第三個原則，成年的健康(雄性和雌性未孕)實驗動物和人可能的暴露途徑是基本的選擇。不能重復的實驗結(jié)果是沒有任何科學價值的。選用成年的健康(雄性和雌性未孕)實驗動物是為了使實驗結(jié)果具有代表性和可重復性。以成年的健康(雄性和雌性未孕)實驗動物作為一般人群的代表性實驗模型，而將幼年和老年動物、妊娠的雌性動物、疾病狀態(tài)作為特殊情況另作研究。這樣可降低實驗對象的多樣性，減少實驗誤差。第15頁，課件共80頁，創(chuàng)作于2023年2月

食品毒理學實驗的局限性用實驗動物的毒理學實驗資料外推到人群接觸的安全性時，會有很大的不確定性實驗動物和人對外源化學物的反應敏感性不同，有時甚至存在著質(zhì)的差別高劑量向低劑量外推的不確定性小數(shù)量實驗動物到大量人群外推的不確定性成年健康動物與不同的人種、種族，而且包括年老體弱及患病的個體之間的易感性不同第16頁，課件共80頁，創(chuàng)作于2023年2月首先，實驗動物和人對外源化學物的反應敏感性不同，有時甚至存在著質(zhì)的差別。雖然在毒理學實驗中通過用兩種或兩種以上的動物，并盡可能選擇與人對毒物反應相似的動物，但要完全避免物種差異是不可能的。而且在動物實驗中，可觀察到體征(sign)，而沒有癥狀(symptom)。實驗動物不能述說涉及主觀感覺的毒效應，如疼痛、腹脹、疲乏、頭暈、眼花、耳鳴等，這些毒效應就難以或不可能發(fā)現(xiàn)。第17頁，課件共80頁，創(chuàng)作于2023年2月第二，高劑量向低劑量外推的不確定性

在毒理學實驗中，為了尋求毒作用的靶器官，并能在相對少量的動物上就能得到劑量-反應或劑量-效應關系，往往選用較大的染毒劑量，這一劑量通常要比人實際接觸的劑量大得多。有些化學物在高劑量和低劑量的毒性作用規(guī)律并不一定一致，如大劑量下出現(xiàn)的反應有可能是由于化學物在體內(nèi)超過了機體的代謝能力，這就存在高劑量向低劑量外推的不確定性。第18頁，課件共80頁，創(chuàng)作于2023年2月第三，毒理學實驗所用動物數(shù)量有限，那些發(fā)生率很低的毒性反應，在少量動物中難以發(fā)現(xiàn)。而化學物一旦進入市場，接觸人群往往會很大。這就存在小數(shù)量實驗動物到大量人群外推的不確定性。第19頁，課件共80頁，創(chuàng)作于2023年2月四，實驗動物一般都是實驗室培育的品系，一般選用成年健康動物，反應較單一，而接觸人群可以是不同的人種、種族，而且包括年老體弱及患病的個體，在對外源化學物毒性反應的易感性上存在很大差異。第20頁，課件共80頁，創(chuàng)作于2023年2月第二節(jié)毒理學毒性評價試驗的基本目的

包括以下幾點：受試物毒作用的表現(xiàn)和性質(zhì)劑量-反應(效應)研究，可以得到該受試物的多種毒性參數(shù)確定毒作用的靶器官確定損害的可逆性第21頁，課件共80頁，創(chuàng)作于2023年2月

1.受試物毒作用的表現(xiàn)和性質(zhì)。在急性和慢性毒性試驗中，觀察受試物對機體的有害作用，對有害作用的觀察應該是對每個實驗動物進行全面的逐項的觀察和記錄。發(fā)現(xiàn)有害作用是進行劑量-反應(效應)研究的前提。第22頁，課件共80頁，創(chuàng)作于2023年2月

2.劑量-反應(效應)研究。劑量-反應(效應)研究是毒性評價和安全性評價的基礎。在急性(致死性)毒性試驗中，應該得到LD50（半數(shù)致死劑量/濃度），也可以得到LD01（最小致死劑量或濃度）和MTD（最大耐受劑量或濃度）。在急性非致死性毒性試驗中，可應該得到急性可觀察到有害作用的最低劑量(LOAEL)和未觀察到有害作用的劑量(NOAEL)。在亞急性、亞慢性及慢性毒性試驗中，可得到相應的LOAEL和NOAEL。在致突變、致癌和致畸等特殊毒性試驗中，劑量-反應(效應)研究將為確定受試物是否具有這些特殊毒性提供依據(jù)。在致畸試驗也可得到LOAEL和NOAEL；在致突變、致癌試驗中，盡管認為是無閾值的，但也可得到表觀的LOAEL和NOAEL。第23頁，課件共80頁，創(chuàng)作于2023年2月

3.確定毒作用的靶器官。確定受試物有害作用的靶器官，是毒理學研究的重要目的，以闡明受試物毒作用的特點，并為進一步的機制研究和毒性防治提供線索。第24頁，課件共80頁，創(chuàng)作于2023年2月4.確定損害的可逆性。一旦確認有害作用存在，就應研究停止接觸后該損害是否可逆和消失，器官和組織功能是否能恢復，還是像化學致癌作用那樣停止接觸后損害繼續(xù)發(fā)展？毒性的可逆性關系到對人的危害評價，如果受損的器官組織能夠修復并恢復正常功能，則可能接受較高危險性的接觸水平。第25頁，課件共80頁，創(chuàng)作于2023年2月描述性動物毒性實驗1、急性致死性毒性實驗2、皮膚和眼刺激試驗3、致敏試驗4、亞急性（重復劑量）毒性試驗5、亞慢性毒性試驗6、慢性毒性試驗7、發(fā)育和生殖毒性試驗8、致突變試驗第26頁，課件共80頁，創(chuàng)作于2023年2月急性致死性毒性實驗 對新化合物首先進行的第一個試驗，是使用一種或一種以上的動物，通過一種或一種以上的途徑（其中一種途徑為經(jīng)口途徑，或其他有意攝入的途徑）測定LD50和其他毒效應的試驗。最常使用的動物是小鼠和大鼠，但有時也用家兔和狗。受試動物包括雌雄兩性成年動物，染毒前往往隔夜禁食。記錄一次染毒后14天內(nèi)動物死亡的數(shù)目。除死亡和體重改變外，每天還要觀察受試動物的中毒癥狀、活動狀況、行為改變、患病情況、食物利用率等。第27頁，課件共80頁，創(chuàng)作于2023年2月亞慢性毒性試驗 染毒期限有時不同，最常采納的實驗期限是90天。最主要目的是確定“無可觀察到作用劑量（NOAEL）”，并進一步確認重復染毒情況下，受試物毒作用的特異靶器官。除受試物種的NOAEL外，還可獲得“觀察到有害作用的最小劑量（LOAEL）”。 亞慢性毒性試驗一般選擇2種動物（大鼠和狗），采用與預定實際接觸相一致的染毒途徑（常為經(jīng)口途徑）。第28頁，課件共80頁，創(chuàng)作于2023年2月慢性毒性試驗 除了實驗期限超過3個月以外，長期或慢性毒性試驗的進行在其他方面都類似于亞慢性實驗。慢性毒性試驗染毒期間對嚙齒類一般為6個月至2年的時間，對非嚙齒類通常為1年甚至更長。染毒持續(xù)時間在某種程度上取決于人類實際接觸時間。 目的是評價化學物的蓄積毒性。第29頁，課件共80頁，創(chuàng)作于2023年2月致突變試驗致突變作用是化學物引起細胞核遺傳物質(zhì)發(fā)生改變的能力。這種改變是可以通過細胞分裂傳遞給下一代細胞的。突變可以發(fā)生于兩種類型的細胞，產(chǎn)生本質(zhì)上不同的后果。生殖細胞突變：引起精細胞和卵細胞的DNA損傷，并可通過減數(shù)分裂將突變遺傳到子代細胞。體細胞突變是指發(fā)生在精、卵細胞以外所有其他種類細胞的突變。體細胞突變是不遺傳的，但可以通過有絲分裂將遺傳缺陷傳遞給同一組織的其他細胞，也可能引起細胞死亡。第30頁，課件共80頁，創(chuàng)作于2023年2月第三節(jié)實驗動物的選擇和處理

1、實驗動物物種的選擇基本原則

選擇對受試物在代謝、生物化學和毒理學特征與人最接近的物種自然壽命不太長的物種易于飼養(yǎng)和實驗操作的物種經(jīng)濟并易于獲得的物種第31頁，課件共80頁，創(chuàng)作于2023年2月

目前常規(guī)選擇物種的方式是利用兩個物種，一種是嚙齒類，另一種是非嚙齒類。系統(tǒng)毒性研究最常用的嚙齒類是大鼠和小鼠，非嚙齒類是狗。豚鼠常用于皮膚刺激試驗和致敏試驗。兔常用于皮膚刺激試驗和眼刺激試驗。遺傳毒理學試驗多用小鼠，致癌試驗常用大鼠和小鼠，致畸試驗常用大鼠、小鼠和兔。遲發(fā)性神經(jīng)毒性試驗常用母雞。第32頁，課件共80頁，創(chuàng)作于2023年2月常用實驗動物生物學和生理學參數(shù)第33頁，課件共80頁，創(chuàng)作于2023年2月第34頁，課件共80頁，創(chuàng)作于2023年2月2、實驗動物品系的選擇品系(strain)指用計劃交配的方法，獲得起源于共同祖先的一群動物。

實驗動物按遺傳學控制分類可分為：①近交系：指全同胞兄妹或親子之間連續(xù)交配20代以上而培育的純品系動物。如小鼠有津白I、津白Ⅱ、615，DBA／1和DBA／2，BALB/C，C3H，C57B／6J，A和A／He等。②雜交群動物(雜交1代，F(xiàn)1)，指兩個不同的近交系之間有目的進行交配，所產(chǎn)生的第一代動物。③封閉群：一個種群在五年以上不從外部引進新血緣，僅由同一品系的動物在固定場所隨機交配繁殖的動物群。如昆明種小鼠、NIH小鼠、LACA小鼠、F344大鼠、Wistar大鼠、SD(Sprague-Dauley)大鼠等。

第35頁，課件共80頁，創(chuàng)作于2023年2月根據(jù)實驗動物遺傳的均一性排序，近交系最高、雜交群次之、封閉群較低。不同品系實驗動物對外源化學物毒性反應有差別，所以毒理學研究要選擇適宜的品系，對某種外源化學物毒理學系列研究中應固定使用同一品系動物，以求研究結(jié)果的穩(wěn)定性。第36頁，課件共80頁，創(chuàng)作于2023年2月對于毒性試驗及毒理學研究應盡可能使用二級(或二級以上)的動物。第37頁，課件共80頁，創(chuàng)作于2023年2月I級：CV(conventionalanimal)開放系統(tǒng)，普通飼養(yǎng)，大批生產(chǎn)，成本低，是最低級別的實驗動物。CV廣泛應用于教學、預試驗及一些要求不嚴的短期試驗，生物制品生產(chǎn)。嚴格意義上講，CV不適合于科學研究。盡管如此，CV祖先來自于無特定病原體動物(SPF)，剖腹產(chǎn)后普通化，即開放飼養(yǎng)。CV在飼料配方，飲水，室內(nèi)溫、濕度、光照、噪聲仍應符合國家標準。市售和來歷不明的動物為“無證動物”，試驗結(jié)果不予承認。第38頁，課件共80頁，創(chuàng)作于2023年2月II級：CL（Cleananimal）親代是SPF或GF，屏障系統(tǒng)飼養(yǎng)。質(zhì)量控制要求介于CV與SPF之間。國外無此級別，國外一般均采用SPF或GF。國內(nèi)由于發(fā)展水平條件所限，作為一種過渡，暫可作為標準實驗動物用于一般的科學研究。屏障系統(tǒng)：空氣經(jīng)過一定的過濾凈化，飼養(yǎng)環(huán)境保持正壓，進入系統(tǒng)的一切物品：飼料、飲水、用具等均需經(jīng)嚴格滅菌處理。工作人員進出消毒，衣、帽、手套、口罩均需消毒。飲水除高壓消毒外，還應酸化和過濾凈化。第39頁，課件共80頁，創(chuàng)作于2023年2月III級：SPF(specificpathogenfreeanimal)屬健康無病動物，動物質(zhì)量高，適合長期慢性實驗，并能取得可靠實驗結(jié)果。廣泛應用于藥學、毒理學、腫瘤學、免疫學、傳染病學、多種診斷和疫苗生產(chǎn)，以及生物制品鑒定中。第40頁，課件共80頁，創(chuàng)作于2023年2月IV級：GF(germfreeanimal)GF:

無菌剖腹產(chǎn)，在絕對隔離器中養(yǎng)育。（塑料薄膜無菌隔離器）應用：①在實驗動物領域應用；②在免疫學方面應用：是研究免疫發(fā)生機理與生產(chǎn)高效優(yōu)質(zhì)疫苗的最理想動物。③用于微生物學研究：研究微生態(tài)學的最理想的動物模型。④腫瘤學研究：是研究致癌機理，防癌、抗癌藥物篩選的理想動物。第41頁，課件共80頁，創(chuàng)作于2023年2月⑤營養(yǎng)學研究：是研究營養(yǎng)學的良好模型。GF動物不僅用來觀察腸道內(nèi)細菌對代謝的影響，還用于研究限制采食，對壽命，免疫力的影響，無菌動物對諸多營養(yǎng)機理的分析將起到更重要的作用。⑥毒理與藥理學研究：最適合于進行慢性毒性實驗，適合于新藥毒性及安全性評估。在微生態(tài)制劑、生物制品、抗菌素試驗研究方面具有明顯優(yōu)勢。⑦老年醫(yī)學：無菌動物是最理想的衰老模型，無菌動物壽命明顯延長。⑧其次：在放射醫(yī)學、口腔醫(yī)學、軍事、航天、環(huán)境醫(yī)學等方面都有廣泛應用。第42頁，課件共80頁，創(chuàng)作于2023年2月4、個體選擇性別

如果已知不同性別的動物對受試物敏感性不同，應選擇敏感的性別。如對性別差異不清楚，則應選用雌雄兩種性別。如實驗中發(fā)現(xiàn)存在性別差異，則應將不同性別動物的實驗結(jié)果分別統(tǒng)計分析。年齡和體重在幼年期和老年期，對外源化學物的生物轉(zhuǎn)運和生物轉(zhuǎn)化，靶器官和受體的敏感性均與成年期不同。毒理學試驗選用實驗動物的年齡取決于試驗的類型。第43頁，課件共80頁，創(chuàng)作于2023年2月生理狀態(tài)妊娠影響體重及其他指標的檢測結(jié)果，且性激素對外源化學物代謝轉(zhuǎn)化有影響，應選用未產(chǎn)未孕的雌性動物。健康狀況應選用健康動物：發(fā)育正常、體形健壯，無外觀畸形，被毛濃密、有光澤、順貼而不蓬亂，行動靈活、反應敏捷，眼睛明亮有神，表皮無潰瘍和結(jié)癡，天然孔道干凈無分泌物等。 為確保選擇健康動物，一般在實驗前觀察5～7天。對于大鼠和狗的亞慢性和慢性試驗，可在實驗前采血進行血液學和血液生化學檢查，異常的動物應剔除；對狗應常規(guī)驅(qū)除腸道寄生蟲。第44頁，課件共80頁，創(chuàng)作于2023年2月五、實驗動物喂養(yǎng)環(huán)境實驗動物喂養(yǎng)室室溫應控制在（22±3）℃，家兔可控制在（20±3）℃，相對濕度30%~70%，無對流風。人工晝夜周期，即使動物處于人工調(diào)控的12小時白晝(早6點至晚6點)及12小時黑夜(晚6點至次日早6點)，以穩(wěn)定其生物時間節(jié)律。第45頁，課件共80頁，創(chuàng)作于2023年2月第四節(jié)食品毒理學試驗設計要點一、體內(nèi)毒理學試驗設計

1.劑量分組一般至少要設3個劑量組(即高劑量組、中劑量組、低劑量組)。高劑量組應出現(xiàn)明確的有害作用，低劑量組應不出現(xiàn)任何可觀察到的有害作用(即相當于NOAEL)，但低劑量組劑量應當高于人可能的接觸劑量，至少等于人可能的接觸劑量。中劑量組的劑量介于高劑量組和低劑量組之間，應出現(xiàn)輕微的毒性效應(即相當于LOAEL)。第46頁，課件共80頁，創(chuàng)作于2023年2月1）急性毒性實驗

查閱文獻，找出與受試化合物化學結(jié)構與理化性質(zhì)近似的化合物的毒性資料，并以其LD50(LC50)值作為受試化合物的預其毒性中值；但應注意，一定是相同動物種系和相同接觸途徑。以此預期毒性中值為待測化合物的中間劑量組，再上下各推一到兩個劑量組做預試驗。每個劑量組間的組距可以大些，有利于找出受試化合物的致死劑量范圍。初起組距可用劑量間的4倍差，即以log4(log4＝0.6)來劃分各組劑量。一般設置57個劑量組即可，它即符合統(tǒng)計計算要求又可節(jié)省人力和財力。每個劑量組的動物數(shù)，小鼠不少于10只、大鼠68只、家兔46只，若設計采用霍恩氏法計算LD50時，動物數(shù)可減少。每組動物應雌雄各半；如化合物毒性有性別差異，則應分別求雌、雄性動物各自的LD50(LC50)。第47頁，課件共80頁，創(chuàng)作于2023年2月2）亞慢性毒性實驗亞慢性試驗的上限劑量，需控制在實驗動物接觸受試化合物的整個過程中，不發(fā)生死亡或僅有個別動物死亡，但有明顯的中毒效應，或靶器官出現(xiàn)典型的損傷。此劑量的確定可參考兩個數(shù)值，一是以急性毒性的閾劑量為亞慢性試驗的最高劑量；一是以此化合物LD50的1/201/5為最高劑量?；衔飦喡远拘栽囼瀾蟪銎鋭┝浚磻P系，為此，亞慢性試驗至少應設計三個染毒劑量組及一個正常動物對照組，必要時再加一個受試化合物的溶劑對照組。最低劑量組的劑量應相當于亞慢性的閾劑量水平或未觀察到作用水平，中間劑量組動物以出現(xiàn)輕微中毒效應為度。第48頁，課件共80頁，創(chuàng)作于2023年2月3）慢性毒性實驗

為制定外來化合物衛(wèi)生標準而進行慢性毒性試驗時，一般設3個染毒劑量組和1個對照組，必要時另設一個溶劑對照組，即無作用劑量組、閾劑量組、發(fā)生比較輕微毒性效應的劑量組(此為最高劑量組)。以求出明確的劑量－反應關系。染毒組劑量的選擇可參考三組數(shù)據(jù)。一是以亞慢性閾劑量為出發(fā)點，即以亞慢性閾劑量或其1/51/2劑量為慢性毒性試驗的最高劑量，以這一閾劑量的1/501/10為慢性毒性試驗的預計閾劑量組，并以其1/100為預計的慢性無作用劑量組；一是以急性毒性的LD50劑量為出發(fā)點，即以LD50的1/10劑量為慢性試驗的最高劑量。以LD50的1/100為預計慢性閾劑量，以LD50的1/1000為預計的無作用劑量組。各染毒劑量組之間的劑量間距應當大些，有利于求出劑量-反應關系，也有助于排除實驗動物個體敏感性差異。組間劑量差一般以510倍為宜，最低不小于兩倍。第49頁，課件共80頁，創(chuàng)作于2023年2月毒理學試驗常用的對照有4種：

未處理對照組不施加任何處理因素。陰性(溶劑／賦形劑)對照不給處理因素但給以必須的實驗因素(溶劑／賦形劑)，以排除此實驗因素(溶劑／賦形劑)的影響，陽性對照用已知的陽性物(如致突變物)檢測試驗體系的有效性。陽性對照組最好與受試物用相同的溶劑、染毒途徑及采樣時間。歷史性對照由本實驗室過去多次實驗的對照組數(shù)據(jù)組成，上述三種對照都可構成相應的歷史對照。

第50頁，課件共80頁，創(chuàng)作于2023年2月各組動物數(shù)應考慮到統(tǒng)計學的要求。試驗期限某些試驗(如致畸試驗和多代生殖試驗)的試驗期限是由受試實驗動物物種或品系而決定的。而其他毒性試驗的期限在某種程度上由定義所決定。第51頁，課件共80頁，創(chuàng)作于2023年2月急性毒性是一次或1天內(nèi)多次染毒觀察14天。一般要求計算兩周內(nèi)的總死亡數(shù)。對于一些速死性化合物求其LD50(LC50)也可僅計算24小時的死亡率，有些速殺性化合物的24小時LD50與兩周LD50值往往沒有差別。但應注明是多少時間的LD50值，以便于在進行毒性比較時有共同的基礎。第52頁，課件共80頁，創(chuàng)作于2023年2月亞慢性毒性試驗規(guī)定為染毒持續(xù)至實驗動物壽命的10％，對大鼠和小鼠為90天，對狗應為1年。一般認為在環(huán)境毒理學與食品毒理學中所要求的連續(xù)接觸為3～6個月，而在工業(yè)毒理學中認為1～3月即可。慢性毒性試驗／致癌試驗一般規(guī)定為持續(xù)至實驗動物壽命的大部分。又可分為兩類，即規(guī)定試驗期限的試驗，或直到最敏感的組死亡率達到某一水平(通常為80％)的試驗。一般認為工業(yè)毒理學慢性試驗動物染毒6個月或更長時間；而環(huán)境毒理學與食品毒理學則要求實驗動物染毒1年以上或2年。也有學者主張動物終生接觸外來化合物才能全面反映外來化合物的慢性毒性效應，以及求出閾劑量或無作用劑量。第53頁，課件共80頁，創(chuàng)作于2023年2月二、體外毒理學試驗設計測定受試物溶解性試驗最高劑量的推薦大多數(shù)情況下，可溶性受試物的試驗上限應該是：(1)對哺乳動物細胞為10mmol/L或5mg/ml。(2)對細菌試驗為5mg/平板。

代謝活化常規(guī)使用Aroclor1254（多氯聯(lián)苯1254）預處理的雄性成年大鼠肝勻漿90000g離心上清液(S9)，及相應的輔因子(NADPH再生系統(tǒng))。

陽性對照陽性對照的劑量應選擇其劑量-反應的直線部分。重復可疑結(jié)果則應重復實驗，最好改變劑量范圍／劑量間隔、改變S9濃度或改變實驗方法進行重復。

第54頁，課件共80頁，創(chuàng)作于2023年2月第五節(jié)實驗動物的染毒和處置

一、動物實驗前的準備購進之后，應雌雄分開飼養(yǎng)進行5～7天的檢疫實驗動物的標記嚙齒動物染色法苦味酸(黃色)、品紅(紅色)的酒精飽和溶液在動物被毛上染色嚙齒動物剪耳法

狗等大動物掛牌法

分組按性別、體重順序編號，隨機分組

第55頁，課件共80頁，創(chuàng)作于2023年2月二、受試物和樣品的準備了解受試物的純度、雜質(zhì)成分、化學結(jié)構和理化性質(zhì)檢索相似化合物的毒性資料，以作參考受試物應一次備齊全部實驗的用量所需受試物總量＝(A×B×C×D)×1.2式中：A為每組動物數(shù)；B為各處理組的劑量之和(如0.1+0.3+1.0mg/kg＝1.4mg/kg)；C為染毒次數(shù)(通常為天)；D為動物的平均體重；1.2為安全因子，防止損耗。第56頁，課件共80頁，創(chuàng)作于2023年2月將受試物制備成一定的劑型常制備成水溶液、油溶液或混懸液。溶劑或助溶劑應該是無毒的，與受試物不起反應，受試物在溶液中應穩(wěn)定。水溶性受試物水、等滲鹽水水不溶性受試物溶于或懸浮于適當?shù)挠袡C溶劑中各種染毒途徑的最大容積，以受試的實驗動物物種或制劑來確定。一般規(guī)定，染毒最大容積為：①經(jīng)口20ml/kg(對空腹動物)；②經(jīng)皮2ml/kg(根據(jù)體表面積計算，限于染毒的準確性)；③靜脈1ml/kg(5分鐘以上)；④肌肉注射0.5ml/kg(一個部位)；⑤每眼0.01ml；⑥直腸0.5ml/kg；⑦陰道：大鼠0.2m1，兔1ml；⑧吸入2mg/L；⑨鼻：猴或狗每鼻孔0.1ml。

第57頁，課件共80頁，創(chuàng)作于2023年2月三、染毒途徑最常用的染毒途徑為經(jīng)口、經(jīng)呼吸道、經(jīng)皮及注射途徑。經(jīng)口(胃腸道)染毒

常用有灌胃、喂飼和吞咽膠囊等方式。

灌胃：將受試物配制成溶液或混懸液，以注射器經(jīng)導管注入胃內(nèi)。吞咽膠囊：將一定劑量的受試物裝入膠囊中，放至狗的舌后部，迫使動物咽下。喂飼：將受試物摻入動物飼料或飲水中供實驗動物自行攝入。第58頁，課件共80頁，創(chuàng)作于2023年2月

經(jīng)呼吸道染毒

經(jīng)呼吸道染毒可分為吸入染毒和氣管內(nèi)注入。

靜式吸入染毒：將一定數(shù)量的嚙齒類動物放在密閉的染毒柜中，加入易揮發(fā)的液態(tài)受試物或氣態(tài)受試物使成一定濃度。動式吸入染毒：由染毒柜、機械通風系統(tǒng)和配氣系統(tǒng)三部分構成。又分為整體接觸和口鼻接觸兩種。氣管內(nèi)注入：實驗動物在麻醉后，將受試物注入氣管，使之分布至兩肺。第59頁，課件共80頁，創(chuàng)作于2023年2月經(jīng)皮膚染毒

經(jīng)皮染毒毒性試驗皮膚刺激和致敏試驗試驗前用機械法(剃毛)或化學法(硫化鈉或硫化鋇)脫毛。不應損傷脫毛區(qū)的表皮，脫毛區(qū)面積不大于動物體表面積的10％～15％。第60頁，課件共80頁，創(chuàng)作于2023年2月注射染毒

注射用藥品，應以注射途徑染毒，對大小鼠可用靜脈注射，對非嚙齒類可模擬臨床用藥途徑。應調(diào)整受試物的pH及滲透壓，pH應5～8，最好是等滲溶液。靜脈注射應控制速度。第61頁，課件共80頁，創(chuàng)作于2023年2月四、癥狀觀察急性毒性試驗應詳細地觀察動物的中毒癥狀、發(fā)生和發(fā)展過程及規(guī)律，死亡前癥狀特點、死亡時間等等。

化合物經(jīng)口急性毒性分級標準第62頁，課件共80頁，創(chuàng)作于2023年2月工業(yè)毒物急性毒性分級標準第63頁，課件共80頁，創(chuàng)作于2023年2月亞慢性試驗觀察指標1、一般性指標1）.一般綜合性觀察指標①動物體重②食物利用率③癥狀④臟器系數(shù)2）.一般化驗指標主要指血象和肝、腎功能的檢測，在亞慢性試驗中研究外來化合物對實驗動物的毒性作用。2、病理學檢查慢性試驗其中包括體重、食物攝取、臨床癥狀、行為、血象和血液化學、尿的性狀及生化成分以及重點觀察在亞慢性毒性試驗中已經(jīng)顯現(xiàn)的陽性指標。第64頁，課件共80頁，創(chuàng)作于2023年2月五、實驗動物處死及生物標本采集實驗動物處死方法

大小鼠可用頸椎脫臼法，然后股動脈放血。兔、豚鼠、狗等一般用股動脈放血處死。血液采集不影響動物生理功能的最大取血量為其總血量(50ml/kg體重)的10％。尿液采集

大小鼠可用代謝籠，下部有糞尿分離器。狗可用接尿法或?qū)蚍ā５?5頁，課件共80頁，創(chuàng)作于2023年2月病理解剖和標本留取

毒性病理學檢查是毒理學試驗重要的組成部分，病理學研究有助于確定有害作用和靶器官。大體解剖：在實驗動物處死后半小時內(nèi)進行。觀察有關臟器的外形和表面情況、顏色、邊界和大小、質(zhì)地、切面。對指定的臟器稱重，并計算臟器系數(shù)。

組織病理學檢查：對指定的器官或組織用鋒利的刀剪取材，應統(tǒng)一取材部位。組織塊一般在10倍體積的10％福爾馬林中固定，此后常規(guī)制片(組織石蠟包埋、切片、HE染色)。應詳細記錄顯微鏡下觀察到的病變，并做出病理診斷。第66頁，課件共80頁，創(chuàng)作于2023年2月第67頁，課件共80頁，創(chuàng)作于2023年2月第六節(jié)體外試驗在毒理學中的應用

體外試驗模型(invitrotest)在判斷外源化學物及其制品和混合物等對人類健康是否具有損害作用過程中也起著重要的作用。原因：量大全世界每年約有千種以上的新化合物作為商品進入人類的環(huán)境。而且在現(xiàn)有的化合物中，還有相當數(shù)量沒有進行必要的毒理學評價。節(jié)省時間和經(jīng)費動物保護主義運動的興起生物技術為毒性試驗和研究提供的新方法和工具

第68頁，課件共80頁，創(chuàng)作于2023年2月一、概述

(一)分類依據(jù)體外試驗在決策過程中所起的作用將其分為3類：①篩選試驗僅提供決策過程的最初的資料②附加試驗為協(xié)作部門或法律部門的最終決策過程提供有用的資料③替代試驗在大量實驗的基礎上，使體外毒性試驗能替代整體動物試驗第69頁，課件共80頁，創(chuàng)作于2023年2月(二)基本原理體外試驗的基本原理是——所觀察到的毒理學效應均是毒物和／或反應活性代謝產(chǎn)物在敏感性細胞上或敏感細胞內(nèi)某一分子靶部位作用的結(jié)果?；谏鲜鲈恚w外試驗模型取材范圍很寬。第70頁，課件共80頁，創(chuàng)作于2023年2月(三)體外試驗的優(yōu)缺點體外毒性試驗系統(tǒng)的優(yōu)點能控制環(huán)境因素可排除相互作用的系統(tǒng)如免疫系統(tǒng)、神經(jīng)內(nèi)分泌系統(tǒng)的影響每一劑量水平可利用大量的生物樣品，如細胞，細胞器等試驗間的誤差較少可同時和／或反復多次取樣可做成復雜的互相作用的試驗系統(tǒng)，如復合細胞培養(yǎng)等較為快速和經(jīng)濟需要較小量的受試化合物產(chǎn)生較小量的有毒廢物可以利用人體細胞減少整體動物的使用

第71頁，課件共80頁，創(chuàng)作于2023年2月其中特別值得一提的優(yōu)點是體外試驗的簡便和易于利用人體細胞。體外毒性試驗結(jié)果可迅速得出，將減少了解新化學物毒理學資料所需的時間，最終可以縮短從新化學物的合成到產(chǎn)品進人市場的時間過程。此外，對鑒定毒理學資料有問題的新化學物，可及時終止開發(fā)，減少由資源到產(chǎn)品的投入。在毒理學整體試驗中禁止直接進行人體試驗。目前主要是將動物試驗結(jié)果外推至人類，物種間差異為其不確定因素之一。在體外試驗中，利用人體細胞組織進行試驗，可較好地解決物種差異的問題。

第72頁，課件共80頁，創(chuàng)作于2023年2月不足之處：①體外到體內(nèi)外推的問題體外試驗是依據(jù)毒性作用的始發(fā)階段及繼續(xù)發(fā)生