重組導(dǎo)入受體細(xì)胞

關(guān)于重組導(dǎo)入受體細(xì)胞第1頁(yè)，課件共26頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月1.DNA導(dǎo)入細(xì)菌的方法2.DNA導(dǎo)入酵母的方法3.DNA導(dǎo)入植物細(xì)胞的方法4.DNA導(dǎo)入動(dòng)物細(xì)胞的方法第2頁(yè)，課件共26頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月轉(zhuǎn)化轉(zhuǎn)染轉(zhuǎn)導(dǎo)接合轉(zhuǎn)移1.重組體導(dǎo)入細(xì)菌細(xì)胞（1）大腸桿菌重組質(zhì)粒DNA分子進(jìn)入受體細(xì)胞，并在受體細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)定維持和表達(dá)的過程稱之為轉(zhuǎn)化（transformation)。轉(zhuǎn)化不僅適合于大腸桿菌受體細(xì)胞，而且適合于枯草桿菌和藍(lán)藻等其他原核生物以及酵母等低等真核生物受體細(xì)胞。

化學(xué)誘導(dǎo)感受態(tài)法電轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞（competencecell）是指處于能吸收周圍環(huán)境中DNA分子的生理狀態(tài)的細(xì)胞?！铩锏?頁(yè)，課件共26頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月I.化學(xué)誘導(dǎo)感受態(tài)法

原理：E.coli細(xì)胞處于0℃，CaCl2的低滲溶液中，細(xì)胞膨脹成球形，細(xì)胞膜形成液晶結(jié)構(gòu)，轉(zhuǎn)化混合物中的DNA形成抗DNase的羥基-鈣磷酸復(fù)合物粘附于細(xì)胞表面，經(jīng)42℃短時(shí)間熱沖擊處理，液晶結(jié)構(gòu)被擾動(dòng)而使細(xì)胞膜出現(xiàn)間隙，促使DNA復(fù)合物進(jìn)入細(xì)胞，在豐富培養(yǎng)基上生長(zhǎng)數(shù)小時(shí)后，球狀細(xì)胞復(fù)原并分裂增殖，被轉(zhuǎn)化的細(xì)菌中，重組子中基因得到表達(dá)，在選擇性培養(yǎng)基平板上，可選出所需的轉(zhuǎn)化子。第4頁(yè)，課件共26頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月Ca2+處理的感受態(tài)細(xì)胞，其轉(zhuǎn)化率一般能達(dá)到106～108轉(zhuǎn)化子/gDNA?；瘜W(xué)法簡(jiǎn)單、快速、穩(wěn)定、重復(fù)性好，感受態(tài)細(xì)菌可以在-70℃保存，但轉(zhuǎn)化DNA大小有限制，不同物種需要不同的誘導(dǎo)方法。轉(zhuǎn)化過程所用的受體細(xì)胞一般是限制修飾系統(tǒng)缺陷的變異株，即不含限制性內(nèi)切酶和甲基化酶的突變體(Rˉ,Mˉ),它可以容忍外源DNA分子進(jìn)入體內(nèi)并穩(wěn)定地遺傳給后代。第5頁(yè)，課件共26頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月培養(yǎng)大腸桿菌OD600至0.3-0.4Onice5-10min4℃離心收集菌用冰冷的60mMCaCl2重懸4℃離心收集菌4℃離心收集菌分裝、-70℃凍存用冰冷的60mMCaCl2重懸Onice30min用冰冷的60mMCaCl2重懸感受態(tài)細(xì)胞制備

制備感受態(tài)菌必須使用對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的菌，且必須在冰冷的條件下制備。CaCl2處理充分，使細(xì)菌細(xì)胞膜失去一些蛋白。

儲(chǔ)存感受態(tài)菌要在-70℃以下，使用感受態(tài)菌時(shí)必須迅速融化，融化后一般不能再次凍存使用第6頁(yè)，課件共26頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月10ng質(zhì)粒DNA100L感受態(tài)菌冰上混合，靜置10分鐘42oC1分鐘冰浴2min，加入1mLLB培養(yǎng)基37℃搖1小時(shí)10-100L轉(zhuǎn)化液涂含抗菌素的平板吸附DNA攝入DNA轉(zhuǎn)化過程第7頁(yè)，課件共26頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月II.電轉(zhuǎn)化

可以轉(zhuǎn)化大分子DNA（>50Kb)，胞壁較厚的物種需要制備原生質(zhì)體后電轉(zhuǎn)化電穿孔轉(zhuǎn)化法最早用于將DNA導(dǎo)入真核細(xì)胞，1988年，Dower等人成功地應(yīng)用該法進(jìn)行了大腸桿菌的轉(zhuǎn)化。原理:利用高壓電脈沖作用，在大腸桿菌細(xì)胞膜上進(jìn)行電穿孔(electroporation),形成可逆的瞬間通道，從而促進(jìn)外源DNA的有效吸收。電穿孔轉(zhuǎn)化法的效率受電場(chǎng)強(qiáng)度、電脈沖時(shí)間和外源DNA濃度等參數(shù)的影響，通過優(yōu)化這些參數(shù)，每微克DNA可以得到109～1010轉(zhuǎn)化子。電壓增高或電脈沖時(shí)間延長(zhǎng)時(shí)，轉(zhuǎn)化效率將會(huì)提高，但受體細(xì)胞存活率會(huì)降低。研究表明，當(dāng)電場(chǎng)強(qiáng)度和脈沖時(shí)間的組合方式導(dǎo)致50%～70%細(xì)菌死亡時(shí)，轉(zhuǎn)化效率達(dá)到最高。★第8頁(yè)，課件共26頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月LB培養(yǎng)受體菌至OD600=0.5-0.6冰浴15分鐘，4℃離心集菌冰冷的水重懸菌體4℃離心集菌冰冷的水重懸菌體4℃離心收集菌體少量冰冷的水重懸細(xì)胞分裝成50L電轉(zhuǎn)儀調(diào)為2.5kV,25F脈沖控制器200-4000.5g質(zhì)粒DNA混合、冰浴加入1mLSOC培養(yǎng)液37°C中速震蕩60分鐘涂布轉(zhuǎn)化細(xì)胞制備：電轉(zhuǎn)化：第9頁(yè)，課件共26頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月用于電穿孔轉(zhuǎn)化法的細(xì)胞處理要比感受態(tài)細(xì)胞的制備要容易，當(dāng)細(xì)菌生長(zhǎng)到對(duì)數(shù)中期后予以冷卻、離心，然后用低鹽緩沖液充分清洗降低細(xì)胞懸浮液的離子強(qiáng)度，并用10%甘油重懸細(xì)胞，使其細(xì)胞濃度為3×1010個(gè)／ml，分裝，在干冰上速凍后置于-70℃貯存。每小份細(xì)胞融解后即可用于轉(zhuǎn)化，有效期達(dá)6個(gè)月以上一般電穿孔轉(zhuǎn)化須在低溫下（0～4℃）進(jìn)行，轉(zhuǎn)化效率要比在室溫下操作提高約100倍。由于細(xì)菌細(xì)胞相對(duì)較小，因此與DNA導(dǎo)入真核細(xì)胞時(shí)相比，大腸桿菌的電轉(zhuǎn)化要求有更高的場(chǎng)強(qiáng)，而反應(yīng)體積則相對(duì)要小，以20～40μl為宜。第10頁(yè)，課件共26頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月磷酸鈣-DNA共沉淀法：簡(jiǎn)稱磷酸沉淀法，屬于轉(zhuǎn)染法，能把外源基因與λ噬菌體DNA的重組子導(dǎo)入大腸桿菌和哺乳動(dòng)物細(xì)胞，但轉(zhuǎn)染效率遠(yuǎn)遠(yuǎn)不如體外包裝法（轉(zhuǎn)導(dǎo)）。

HEPES緩沖鹽水與含有氯化鈣和DNA的溶液緩慢混合，會(huì)形成含磷酸鈣和DNA的沉淀。細(xì)胞具有攝取磷酸鈣沉淀的雙鏈DNA的能力，幾乎所有的雙鏈DNA都可以通過這種方法導(dǎo)入細(xì)胞。

對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)菌和重組λ噬菌體磷酸鈣-DNA沉淀混合，先置0℃冰浴30～60分鐘，再放45℃中水浴5分鐘，使細(xì)菌迅速發(fā)生熱休克，以利外源DNA的進(jìn)入。隨后涂布瓊脂平皿，培養(yǎng)后觀察并選取含有重組DNA的細(xì)菌。

轉(zhuǎn)染——磷酸鈣-DNA共沉淀法HEPES:4-羥乙基哌嗪乙磺酸;N-(2-羥乙基)哌嗪-N'-2-乙烷磺酸★第11頁(yè)，課件共26頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月第12頁(yè)，課件共26頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月（2）枯草芽孢桿菌Spizzen感受態(tài)轉(zhuǎn)化原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化電轉(zhuǎn)化枯草芽孢桿菌可以形成自然感受態(tài)，在對(duì)數(shù)生長(zhǎng)后期由信息素激發(fā)一種二元信號(hào)傳導(dǎo)系統(tǒng)的調(diào)節(jié)，激活一系列感受態(tài)相關(guān)基因的表達(dá)。Spizzen在1958年發(fā)現(xiàn)這一現(xiàn)象并發(fā)展了感受態(tài)轉(zhuǎn)化的方法.基本步驟：細(xì)胞在較為豐富的培養(yǎng)基中培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)后期，然后轉(zhuǎn)接到營(yíng)養(yǎng)貧瘠的培養(yǎng)基中，可使其形成感受態(tài)（一般非常短暫）I.Spizzen感受態(tài)轉(zhuǎn)化★第13頁(yè)，課件共26頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月在枯草芽孢桿菌中，轉(zhuǎn)化的過程包括外源DNA的吸附、斷裂、吸收降解和重組（或形成獨(dú)立的復(fù)制單元，如質(zhì)粒）幾個(gè)階段：吸附：這一過程發(fā)生在感受態(tài)細(xì)胞的表面，是一個(gè)非共價(jià)結(jié)合的過程。在枯草芽孢桿菌的感受態(tài)細(xì)胞表面平均約有50個(gè)DNA吸附位點(diǎn)，這些位點(diǎn)對(duì)雙鏈DNA有非常大的親和力雙鏈DNA的斷裂：在吸附發(fā)生后的30秒內(nèi)，DNA被核酸酶隨機(jī)斷裂，其平均長(zhǎng)度約為7kb。DNA的降解和吸收：在斷裂發(fā)生之后，雙鏈DNA的一條鏈被完全降解，另一條鏈穿過細(xì)胞壁和細(xì)胞膜后進(jìn)入胞內(nèi)。合成雙鏈并環(huán)化：變成雙鏈后依靠同源區(qū)環(huán)化。自身無(wú)同源區(qū)段（重復(fù)序列）的DNA，轉(zhuǎn)化效率極低。對(duì)于質(zhì)粒單體，需要體外酶切、連接成質(zhì)粒多聚體才能高效轉(zhuǎn)化。103~105個(gè)/gDNA缺點(diǎn)：對(duì)于生長(zhǎng)差別較大的菌株需要重新確定轉(zhuǎn)接培養(yǎng)時(shí)間；酶切后質(zhì)粒無(wú)法轉(zhuǎn)化。由于需要借助同源重組來重新環(huán)化質(zhì)粒，對(duì)于recA缺陷菌株轉(zhuǎn)化效率非常低★第14頁(yè)，課件共26頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月

原理：用溶菌酶等處理消化部分細(xì)胞壁，制備原生質(zhì)體，在PEP(聚乙二醇）等促溶劑作用下使細(xì)胞膜形成小孔，胞外DNA通過小孔進(jìn)入胞內(nèi),然后在再生培養(yǎng)基上篩選轉(zhuǎn)化子。II.原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化

優(yōu)點(diǎn)：不需要質(zhì)粒有自身同源區(qū)，因此對(duì)于單體質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化效率也很高（106個(gè)/微克DNA

）缺點(diǎn)：轉(zhuǎn)化效率隨質(zhì)粒分子量變大而減小；部分抗生素在再生培養(yǎng)基失去篩選作用（例如卡那霉素在DM3培養(yǎng)基中無(wú)效）不適用于革蘭氏陰性菌III.電轉(zhuǎn)化

原理、步驟和大腸桿菌電轉(zhuǎn)化一樣，但轉(zhuǎn)化效率很低(<106個(gè)/微克DNA)

★第15頁(yè)，課件共26頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月2.酵母菌的轉(zhuǎn)化方法（1）原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化法早期酵母菌的轉(zhuǎn)化都采用在等滲緩沖液中穩(wěn)定的原生質(zhì)球轉(zhuǎn)化法。在Ca2+和PEG的存在下，轉(zhuǎn)化細(xì)胞可達(dá)存活的原生質(zhì)球總數(shù)的1%-5%。但是操作周期長(zhǎng)（再生需4~6天），而且轉(zhuǎn)化效率受到原生質(zhì)再生率的嚴(yán)重制約。酵母原生質(zhì)轉(zhuǎn)化法一個(gè)顯著特點(diǎn)是，一個(gè)受體細(xì)胞可同時(shí)接納多個(gè)質(zhì)粒分子，而且這種共轉(zhuǎn)化的原生質(zhì)占轉(zhuǎn)化子總數(shù)的25%-33%。

酵母原生質(zhì)體感受態(tài)酶去壁CaCl2、PEG插入外源基因的酵母載體PEG（聚乙二醇）CaCl2使細(xì)胞壁具有通透性，允許DNA進(jìn)入。轉(zhuǎn)化★第16頁(yè)，課件共26頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月（2）堿金屬離子介導(dǎo)的酵母菌轉(zhuǎn)化釀酒酵母經(jīng)堿金屬離子（如Li+等）、PEG熱休克處理后，也可高效吸收質(zhì)粒DNA，而且具有以下特性：吸收線性DNA的能力明顯大于環(huán)狀DNA，二者相差80倍,共轉(zhuǎn)化現(xiàn)象較為罕見。（3）電轉(zhuǎn)化法酵母菌原生質(zhì)體和完整細(xì)胞均可在電擊條件下吸收質(zhì)粒DNA，但在此過程中應(yīng)避免使用PEG，它對(duì)受電擊的細(xì)胞具有較大的負(fù)作用。其優(yōu)勢(shì)在于不依賴于受體細(xì)胞的遺傳特征及培養(yǎng)條件適用范圍廣，而且轉(zhuǎn)化率高達(dá)105轉(zhuǎn)化子/μgDNA。

酵母0.1mol/LLiCl處理插入外源基因的酵母載體感受態(tài)40%PEG4000★★第17頁(yè)，課件共26頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月其他導(dǎo)入技術(shù)：接合轉(zhuǎn)移在質(zhì)粒轉(zhuǎn)移過程中，利用供體細(xì)胞可與受體細(xì)胞發(fā)生接合作用而將質(zhì)粒導(dǎo)入受體細(xì)胞的方法，供體細(xì)胞和受體細(xì)胞可以為不同微生物：例如大腸桿菌和鏈霉菌供體細(xì)胞含有輔助質(zhì)粒，輔助質(zhì)粒為可轉(zhuǎn)移的接合型質(zhì)粒，含有與接合轉(zhuǎn)移有關(guān)的基因（tra），這類質(zhì)粒一般也是廣宿主質(zhì)粒。而重組質(zhì)粒一般不含tra基因，但有bom基因，可以被誘動(dòng)轉(zhuǎn)移；一般是穿梭載體，保證在供體菌（E.coli）和受體菌（例如根瘤菌或鏈霉菌）中均能復(fù)制。將含輔助質(zhì)粒的細(xì)胞、含重組質(zhì)粒的供體細(xì)胞與受體細(xì)胞三者共同培養(yǎng)，便可實(shí)現(xiàn)重組質(zhì)粒導(dǎo)入受體細(xì)胞，稱為三親雜交接合轉(zhuǎn)移★第18頁(yè)，課件共26頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月三親雜交接合轉(zhuǎn)移重組質(zhì)粒從大腸桿菌轉(zhuǎn)移到土壤農(nóng)桿菌★第19頁(yè)，課件共26頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月葉盤消毒切取土壤農(nóng)桿菌浸泡看護(hù)培養(yǎng)基愈傷組織分化幼苗3.導(dǎo)入植物細(xì)胞（1）葉盤法（leafdisk)★第20頁(yè)，課件共26頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月植物細(xì)胞原生質(zhì)體纖維素酶和果膠酶DNA混合入電擊緩沖液1-2kV,3-25F電擊愈傷組織幼苗分化（2）.電擊法（electroporation)☆第21頁(yè)，課件共26頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月又稱高速微型子彈射擊法（High-velocitymicroprojectiles)以冷壓縮氣體為動(dòng)力將吸附DNA的金屬微粒打入細(xì)胞內(nèi)，完成基因轉(zhuǎn)移，適合各種細(xì)胞（微生物、動(dòng)植物）?？焖?、簡(jiǎn)便、安全、高效。還可以導(dǎo)入細(xì)胞（如內(nèi)生菌）、蛋白、細(xì)胞器、細(xì)胞核等。DNA1.2m鎢彈頭吸附特制手槍射擊植物裝入（3）.基因槍法（genegun）☆第22頁(yè)，課件共26頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月原理（略）4.導(dǎo)入動(dòng)物細(xì)胞（1）.磷酸鈣沉淀法在磷酸鈣-DNA沉淀物種，兩種物理上毫無(wú)聯(lián)系的DNA分子混合物往往能侵染同一個(gè)細(xì)胞該方法經(jīng)常用于兩種DNA同時(shí)轉(zhuǎn)化一個(gè)宿主細(xì)胞的過程(也稱為共轉(zhuǎn)化）。在基因工程實(shí)驗(yàn)中,時(shí)常需要用沒有選擇表型的質(zhì)粒作轉(zhuǎn)化,然后在宿主菌中篩選出這種質(zhì)粒。這時(shí)可采用有選擇標(biāo)記的另一質(zhì)粒與之共轉(zhuǎn)化,通過后者進(jìn)行篩選。這項(xiàng)技術(shù)常用于哺乳類細(xì)胞的實(shí)驗(yàn)，效率高達(dá)15%。★第23頁(yè)，課件共26頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月脂質(zhì)體有商業(yè)試劑盒（如LifeTechnologies）。（2）.脂