【高中生物】基因工程的基本操作程序（第二課時(shí)） 高二生物（人教版2019選擇性必修3）

第3章第2節(jié)人教版選擇性必修3第二步：基因表達(dá)載體的構(gòu)建二/第一步：目的基因的篩選與獲取一/目錄CONTENTS第三步：將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞三/第四步：目的基因的檢測(cè)與鑒定四/DNA片段的擴(kuò)增及電泳鑒定五/第二步：基因表達(dá)載體的構(gòu)建二/第一步：目的基因的篩選與獲取一/目錄CONTENTS第三步：將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞三/第四步：目的基因的檢測(cè)與鑒定四/DNA片段的擴(kuò)增及電泳鑒定五/02第二步：基因表達(dá)載體的構(gòu)建二第二步：基因表達(dá)載體的構(gòu)建cDNA文庫(kù)5‘3‘3‘5‘Bt基因（目的基因）PCR（設(shè)計(jì)引物加上酶切位點(diǎn)）Bt基因EcoRⅠ酶切位點(diǎn)EcoRⅠ酶切位點(diǎn)二第二步：基因表達(dá)載體的構(gòu)建cDNA文庫(kù)5‘3‘3‘5‘Bt基因（目的基因）PCR（設(shè)計(jì)引物）Bt基因EcoRⅠ酶切位點(diǎn)EcoRⅠ酶切位點(diǎn)質(zhì)粒EcoRⅠ酶切位點(diǎn)二第二步：基因表達(dá)載體的構(gòu)建cDNA文庫(kù)5‘3‘3‘5‘Bt基因（目的基因）PCR（設(shè)計(jì)引物）Bt基因！EcoRⅠ酶切位點(diǎn)EcoRⅠ酶切位點(diǎn)質(zhì)粒EcoRⅠ酶切位點(diǎn)（目的基因）Bt基因二第二步：基因表達(dá)載體的構(gòu)建Bt基因！EcoRⅠ酶切位點(diǎn)EcoRⅠ酶切位點(diǎn)質(zhì)粒EcoRⅠ酶切位點(diǎn)（目的基因）Bt基因二第二步：基因表達(dá)載體的構(gòu)建Bt基因！EcoRⅠ酶切位點(diǎn)EcoRⅠ酶切位點(diǎn)質(zhì)粒EcoRⅠ酶切位點(diǎn)Bt基因（目的基因）重組DNA分子剛才模擬的是什么過(guò)程？二第二步：基因表達(dá)載體的構(gòu)建基因表達(dá)載體構(gòu)建的過(guò)程：質(zhì)粒載體限制酶目的基因限制酶切割位點(diǎn)限制酶切割位點(diǎn)限制酶在構(gòu)建抗蟲(chóng)棉的基因表達(dá)載體時(shí)，首先會(huì)用一定的限制酶切割載體，使它出現(xiàn)一個(gè)切口用同種限制酶或能產(chǎn)生相同末端的限制酶切割含有目的基因的DNA片段DNA連接酶重組DNA分子基因表達(dá)載體（核心工作）二第二步：基因表達(dá)載體的構(gòu)建基因表達(dá)載體構(gòu)建的過(guò)程：質(zhì)粒載體限制酶目的基因限制酶切割位點(diǎn)限制酶切割位點(diǎn)限制酶在構(gòu)建抗蟲(chóng)棉的基因表達(dá)載體時(shí)，首先會(huì)用一定的限制酶切割載體，使它出現(xiàn)一個(gè)切口用同種限制酶或能產(chǎn)生相同末端的限制酶切割含有目的基因的DNA片段DNA連接酶重組DNA分子基因表達(dá)載體目的基因（核心工作）為什么要構(gòu)建基因表達(dá)載體？使目的基因在受體細(xì)胞中穩(wěn)定存在，并且可以遺傳給下一代，同時(shí)使目的基因能夠表達(dá)和發(fā)揮作用?；虮磉_(dá)載體應(yīng)該具備什么結(jié)構(gòu)才能到達(dá)以上目的？二第二步：基因表達(dá)載體的構(gòu)建Bt基因！EcoRⅠ酶切位點(diǎn)EcoRⅠ酶切位點(diǎn)質(zhì)粒EcoRⅠ酶切位點(diǎn)Bt基因（目的基因）基因表達(dá)載體如果目的基因需要復(fù)制需要什么結(jié)構(gòu)？復(fù)制原點(diǎn)如果目的基因需要表達(dá)需要什么條件？需要啟動(dòng)子和終止子啟動(dòng)子和終止子應(yīng)該加在哪？啟動(dòng)子終止子位于基因首端的一段特殊的DNA片斷，它是RNA聚合酶識(shí)別和結(jié)合的部位，有了它才能驅(qū)動(dòng)基因轉(zhuǎn)錄出mRNA。二第二步：基因表達(dá)載體的構(gòu)建Bt基因（目的基因）基因表達(dá)載體如果目的基因需要復(fù)制需要什么結(jié)構(gòu)？復(fù)制原點(diǎn)如果目的基因需要表達(dá)需要什么條件？需要啟動(dòng)子和終止子啟動(dòng)子和終止子應(yīng)該加在哪？啟動(dòng)子終止子位于基因首端的一段特殊的DNA片斷，它是RNA聚合酶識(shí)別和結(jié)合的部位，有了它才能驅(qū)動(dòng)基因轉(zhuǎn)錄出mRNA。啟動(dòng)子類(lèi)型：誘導(dǎo)型啟動(dòng)子組成型啟動(dòng)子組織特異性啟動(dòng)子二第二步：基因表達(dá)載體的構(gòu)建Bt基因（目的基因）基因表達(dá)載體如果目的基因需要復(fù)制需要什么結(jié)構(gòu)？復(fù)制原點(diǎn)如果目的基因需要表達(dá)需要什么條件？需要啟動(dòng)子和終止子啟動(dòng)子和終止子應(yīng)該加在哪？啟動(dòng)子終止子位于基因首端的一段特殊的DNA片斷，它是RNA聚合酶識(shí)別和結(jié)合的部位，有了它才能驅(qū)動(dòng)基因轉(zhuǎn)錄出mRNA。啟動(dòng)子類(lèi)型：誘導(dǎo)型啟動(dòng)子組成型啟動(dòng)子組織特異性啟動(dòng)子即在某些特定的物理或化學(xué)信號(hào)刺激后，基因轉(zhuǎn)錄水平在該類(lèi)啟動(dòng)子的調(diào)控下大幅度地提升或降低。誘導(dǎo)物作用誘導(dǎo)型啟動(dòng)子激活或抑制目的基因表達(dá)如：光誘導(dǎo)表達(dá)基因啟動(dòng)子、熱誘導(dǎo)表達(dá)基因啟動(dòng)子、創(chuàng)傷誘導(dǎo)表達(dá)基因啟動(dòng)子、真菌誘導(dǎo)表達(dá)基因啟動(dòng)子和共生細(xì)菌誘導(dǎo)表達(dá)基因啟動(dòng)子等。二第二步：基因表達(dá)載體的構(gòu)建Bt基因（目的基因）基因表達(dá)載體如果目的基因需要復(fù)制需要什么結(jié)構(gòu)？復(fù)制原點(diǎn)如果目的基因需要表達(dá)需要什么條件？需要啟動(dòng)子和終止子啟動(dòng)子和終止子應(yīng)該加在哪？啟動(dòng)子終止子位于基因首端的一段特殊的DNA片斷，它是RNA聚合酶識(shí)別和結(jié)合的部位，有了它才能驅(qū)動(dòng)基因轉(zhuǎn)錄出mRNA。啟動(dòng)子類(lèi)型：組成型啟動(dòng)子誘導(dǎo)型啟動(dòng)子組織特異性啟動(dòng)子能夠調(diào)控基因表達(dá)，使其基本恒定在一定程度上，從而使基因在不同部位或組織中的表達(dá)水平不存在明顯差異。這類(lèi)啟動(dòng)子一般來(lái)自于管家基因，可連續(xù)不斷地啟動(dòng)基因的表達(dá)。如：使Bt基因表達(dá)的啟動(dòng)子可能存在問(wèn)題：如外源基因在整株植物中表達(dá)，產(chǎn)生大量異源蛋白質(zhì)或代謝產(chǎn)物在植物體內(nèi)積累，打破了植物原有的代謝平衡，有些產(chǎn)物對(duì)植物并非必需甚至有毒，因而阻礙了植物的正常生長(zhǎng)，甚至導(dǎo)致死亡；二第二步：基因表達(dá)載體的構(gòu)建Bt基因（目的基因）基因表達(dá)載體如果目的基因需要復(fù)制需要什么結(jié)構(gòu)？復(fù)制原點(diǎn)如果目的基因需要表達(dá)需要什么條件？需要啟動(dòng)子和終止子啟動(dòng)子和終止子應(yīng)該加在哪？啟動(dòng)子終止子位于基因首端的一段特殊的DNA片斷，它是RNA聚合酶識(shí)別和結(jié)合的部位，有了它才能驅(qū)動(dòng)基因轉(zhuǎn)錄出mRNA。啟動(dòng)子類(lèi)型：組織特異性啟動(dòng)子誘導(dǎo)型啟動(dòng)子組成型啟動(dòng)子其調(diào)控作用使得基因往往只在某些特定器官或組織中表達(dá)，且表現(xiàn)出發(fā)育調(diào)節(jié)的特性。優(yōu)點(diǎn)：?jiǎn)?dòng)的外源基因在受體中僅在需要的部位特異表達(dá)，克服了組成型啟動(dòng)子啟動(dòng)的外源基因在受體植物中非特異、持續(xù)、高效表達(dá)所造成的浪費(fèi)，增加轉(zhuǎn)基因的效果。P54P90二第二步：基因表達(dá)載體的構(gòu)建Bt基因（目的基因）基因表達(dá)載體如果目的基因需要復(fù)制需要什么結(jié)構(gòu)？復(fù)制原點(diǎn)如果目的基因需要表達(dá)需要什么條件？需要啟動(dòng)子和終止子啟動(dòng)子和終止子應(yīng)該加在哪？啟動(dòng)子終止子位于基因首端的一段特殊的DNA片斷，它是RNA聚合酶識(shí)別和結(jié)合的部位，有了它才能驅(qū)動(dòng)基因轉(zhuǎn)錄出mRNA。啟動(dòng)子類(lèi)型：組織特異性啟動(dòng)子誘導(dǎo)型啟動(dòng)子組成型啟動(dòng)子二第二步：基因表達(dá)載體的構(gòu)建Bt基因（目的基因）基因表達(dá)載體如果目的基因需要復(fù)制需要什么結(jié)構(gòu)？復(fù)制原點(diǎn)如果目的基因需要表達(dá)需要什么條件？需要啟動(dòng)子和終止子基因表達(dá)載體還應(yīng)具有什么結(jié)構(gòu)？啟動(dòng)子終止子位于基因首端的一段特殊的DNA片斷，它是RNA聚合酶識(shí)別和結(jié)合的部位，有了它才能驅(qū)動(dòng)基因轉(zhuǎn)錄出mRNA。啟動(dòng)子類(lèi)型：組織特異性啟動(dòng)子誘導(dǎo)型啟動(dòng)子組成型啟動(dòng)子終止子相當(dāng)于一盞紅色信號(hào)燈，使轉(zhuǎn)錄在所需要的地方停下來(lái)，它位于基因的下游，也是一段有特殊序列結(jié)構(gòu)的DNA片段。標(biāo)記基因二第二步：基因表達(dá)載體的構(gòu)建Bt基因（目的基因）基因表達(dá)載體如果目的基因需要復(fù)制需要什么結(jié)構(gòu)？復(fù)制原點(diǎn)如果目的基因需要表達(dá)需要什么條件？需要啟動(dòng)子和終止子基因表達(dá)載體還應(yīng)具有什么結(jié)構(gòu)？啟動(dòng)子終止子位于基因首端的一段特殊的DNA片斷，它是RNA聚合酶識(shí)別和結(jié)合的部位，有了它才能驅(qū)動(dòng)基因轉(zhuǎn)錄出mRNA。啟動(dòng)子類(lèi)型：組織特異性啟動(dòng)子誘導(dǎo)型啟動(dòng)子組成型啟動(dòng)子終止子相當(dāng)于一盞紅色信號(hào)燈，使轉(zhuǎn)錄在所需要的地方停下來(lái)，它位于基因的下游，也是一段有特殊序列結(jié)構(gòu)的DNA片段。標(biāo)記基因?yàn)榱髓b別受體細(xì)胞中是否含有目的基因，從而將有目的基因的重組DNA分子細(xì)胞篩選出來(lái)。抗生素抗性基因、熒光蛋白基因等。標(biāo)記基因作用：標(biāo)記基因常見(jiàn)類(lèi)型：為什么構(gòu)建的基因表達(dá)載體要篩選？如何篩選？左右右左目的基因自身環(huán)化質(zhì)粒自連單個(gè)片段兩個(gè)片段之間會(huì)出現(xiàn)什么問(wèn)題？左右右左目的基因自身環(huán)化質(zhì)粒自連單個(gè)片段兩個(gè)片段之間會(huì)出現(xiàn)什么問(wèn)題？正向連接正向連接正向連接正向連接正向連接反向連接正向連接反向連接轉(zhuǎn)錄方向轉(zhuǎn)錄方向模板鏈模板鏈正向連接反向連接正向連接反向連接轉(zhuǎn)錄方向轉(zhuǎn)錄方向模板鏈模板鏈轉(zhuǎn)錄CCA……UCCCUAAmRNA1轉(zhuǎn)錄UUAGGGA……UGGmRNA2反向連接將導(dǎo)致最終表達(dá)產(chǎn)物不相同！正向連接反向連接正向連接反向連接轉(zhuǎn)錄方向轉(zhuǎn)錄方向模板鏈模板鏈轉(zhuǎn)錄CCA……UCCCUAAmRNA1轉(zhuǎn)錄UUAGGGA……UGGmRNA2反向連接將導(dǎo)致最終表達(dá)產(chǎn)物不相同！兩種片段連接還有其他情況嗎？+目的基因與目的基因連接+質(zhì)粒與質(zhì)粒連接正向連接反向連接兩種片段連接還有其他情況嗎？+目的基因與目的基因連接+質(zhì)粒與質(zhì)粒連接左右右左目的基因自身環(huán)化質(zhì)粒自連單個(gè)片段正向連接反向連接兩種片段連接還有其他情況嗎？+目的基因與目的基因連接+質(zhì)粒與質(zhì)粒連接左右右左目的基因自身環(huán)化質(zhì)粒自連單個(gè)片段兩種片段連接還有其他情況嗎？?jī)煞N片段連接還有其他情況嗎？如何避免此類(lèi)問(wèn)題？使用雙酶切法分別對(duì)目的基因兩側(cè)和質(zhì)粒進(jìn)行切割，使之產(chǎn)生不同的黏性末端！+不能環(huán)化?、倏梢苑乐官|(zhì)粒、目的基因的自身環(huán)化連接；②還可以防止目的基因與載體的反向連接。雙酶切法作用：如何使用標(biāo)記基因篩選？請(qǐng)結(jié)合下圖，回答問(wèn)題：（1）構(gòu)建基因表達(dá)載體時(shí)，能否用SmaⅠ限制酶切割質(zhì)粒？為什么？不能因?yàn)镾maⅠ切割會(huì)破壞質(zhì)粒的抗生素抗性基因。質(zhì)粒上的抗性基因是標(biāo)記基因，便于重組DNA分子的篩選，若被破壞，無(wú)法進(jìn)一步篩選。二第二步：基因表達(dá)載體的構(gòu)建-GGGCCC--CCCGGG-（2）只使用EcoRⅠ分別切割質(zhì)粒和外源DNA，能否構(gòu)建基因表達(dá)載體？如果能有何弊端？能①質(zhì)粒、目的基因發(fā)生自身環(huán)化；②質(zhì)粒與目的基因會(huì)發(fā)生反向連接。二第二步：基因表達(dá)載體的構(gòu)建-GGGCCC--CCCGGG-（3）與只使用EcoRⅠ相比較，使用BamHⅠ和HindⅢ兩種限制酶同時(shí)處理質(zhì)粒、外源DNA的優(yōu)點(diǎn)是什么？①可以防止質(zhì)粒、目的基因的自身環(huán)化連接；②還可以防止目的基因與載體的反向連接。二第二步：基因表達(dá)載體的構(gòu)建-GGGCCC--CCCGGG-科學(xué)家利用基因工程生產(chǎn)人胰島素過(guò)程中所使用的質(zhì)粒和目的基因的部分結(jié)構(gòu)如下圖所示。請(qǐng)回答下列問(wèn)題：經(jīng)典題(1)基因工程的核心是基因表達(dá)載體的構(gòu)建，圖中質(zhì)粒上的____________可作為標(biāo)記基因?qū)⒑心康幕虻募?xì)胞篩選出來(lái)。LacZ（β-半乳糖苷酶基因）和AmpR（氨芐青霉素抗性基因）經(jīng)典題(2)科學(xué)家從胰島B細(xì)胞中獲取總RNA，為得到大量的人胰島素基因，需要用到____________酶，獲得的人胰島素基因序列中___________（填“含有”或“不含有”）啟動(dòng)子。逆轉(zhuǎn)錄酶和耐高溫的DNA聚合酶不含有經(jīng)典題(3)為了使人胰島素基因和質(zhì)粒正確連接，應(yīng)選擇___________（填限制酶）切割質(zhì)粒，在通過(guò)PCR技術(shù)擴(kuò)增人胰島素基因時(shí)，可在引物1和引物2的5'端分別添加___________和____________（填限制酶）的識(shí)別序列，以使目的基因和質(zhì)粒具有相同的黏性末端。氨芐青霉素和X-galXhoIEcoRⅠ經(jīng)典題(4)β-半乳糖苷酶可分解無(wú)色的X-gal并產(chǎn)生藍(lán)色的產(chǎn)物，使菌落呈現(xiàn)藍(lán)色，否則菌落為白色。將大腸桿菌與基因表達(dá)載體混合培養(yǎng)一段時(shí)間后，將大腸桿菌接種到添加___________的培養(yǎng)基上培養(yǎng)，待長(zhǎng)出菌落后，應(yīng)挑選___________的菌落作為工程菌生產(chǎn)人胰島素。氨芐青霉素和X-gal白色二第二步：基因表達(dá)載體的構(gòu)建Bt基因（目的基因）基因表達(dá)載體如果目的基因需要復(fù)制需要什么結(jié)構(gòu)？復(fù)制原點(diǎn)如果目的基因需要表達(dá)需要什么條件？需要啟動(dòng)子和終止子基因表達(dá)載體還應(yīng)具有什么結(jié)構(gòu)？啟動(dòng)子終止子位于基因首端的一段特殊的DNA片斷，它是RNA聚合酶識(shí)別和結(jié)合的部位，有了它才能驅(qū)動(dòng)基因轉(zhuǎn)錄出mRNA。啟動(dòng)子類(lèi)型：組織特異性啟動(dòng)子誘導(dǎo)型啟動(dòng)子組成型啟動(dòng)子終止子相當(dāng)于一盞紅色信號(hào)燈，使轉(zhuǎn)錄在所需要的地方停下來(lái)，它位于基因的下游，也是一段有特殊序列結(jié)構(gòu)的DNA片段。標(biāo)記基因?yàn)榱髓b別受體細(xì)胞中是否含有目的基因，從而將有目的基因的重組DNA分子細(xì)胞篩選出來(lái)。抗生素抗性基因、熒光蛋白基因等。標(biāo)記基因作用：標(biāo)記基因常見(jiàn)類(lèi)型：03第三步：將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞三第三步：將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞受體細(xì)胞類(lèi)型植物細(xì)胞動(dòng)物細(xì)胞微生物細(xì)胞農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法花粉管通道法我國(guó)科學(xué)家獨(dú)創(chuàng)常用顯微注射法Ca2+處理法三第三步：將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞植物細(xì)胞花粉管通道法方法一：用微量注射器將含目的基因的DNA溶液直接注入子房中含目的基因的DNA溶液（我國(guó)科學(xué)家獨(dú)創(chuàng)）（我國(guó)科學(xué)家獨(dú)創(chuàng)）三第三步：將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞植物細(xì)胞花粉管通道法方法二：在植物受粉后的一定時(shí)間內(nèi)，剪去柱頭，將DNA溶液滴加在花柱切面上，使目的基因借助花粉管通道進(jìn)入胚囊。三第三步：將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞植物細(xì)胞花粉管通道法農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法轉(zhuǎn)化：目的基因進(jìn)入受體細(xì)胞內(nèi)，并且在受體細(xì)胞內(nèi)維持穩(wěn)定和表達(dá)的過(guò)程。實(shí)質(zhì)是基因重組。農(nóng)桿菌農(nóng)桿菌是一種在土壤中生活的微生物，能在自然條件下侵染雙子葉植物和裸子植物，而對(duì)大多數(shù)單子葉植物沒(méi)有侵染能力。三第三步：將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞植物細(xì)胞花粉管通道法農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法轉(zhuǎn)化：目的基因進(jìn)入受體細(xì)胞內(nèi)，并且在受體細(xì)胞內(nèi)維持穩(wěn)定和表達(dá)的過(guò)程。實(shí)質(zhì)是基因重組。農(nóng)桿菌農(nóng)桿菌是一種在土壤中生活的微生物，能在自然條件下侵染雙子葉植物和裸子植物，而對(duì)大多數(shù)單子葉植物沒(méi)有侵染能力。Ti質(zhì)粒T-DNA（可轉(zhuǎn)移的DNA）三第三步：將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法農(nóng)桿菌Ti質(zhì)粒T-DNA（可轉(zhuǎn)移的DNA）目的基因構(gòu)建表達(dá)載體含目的基因的重組Ti質(zhì)粒轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌含重組Ti質(zhì)粒的農(nóng)桿菌三第三步：將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法農(nóng)桿菌Ti質(zhì)粒T-DNA（可轉(zhuǎn)移的DNA）目的基因構(gòu)建表達(dá)載體含目的基因的重組Ti質(zhì)粒轉(zhuǎn)入農(nóng)桿