RNi技術(shù)原理及應(yīng)用

什么是RNA干擾？RNA干擾(RNAinterference,RNAi)是指由與靶基因序列同源的雙鏈RNA(double-strandRNA，dsRNA)所誘導(dǎo)的mRNA特異性降解，從而使基因轉(zhuǎn)錄后沉默的一種現(xiàn)象(FireA,2002)。

2002年美國《科學(xué)》雜志將其評為全球年度十大科學(xué)進(jìn)展之首目前一頁\總數(shù)三十一頁\編于十六點(diǎn)1RNAi現(xiàn)象的發(fā)現(xiàn)及發(fā)展目前二頁\總數(shù)三十一頁\編于十六點(diǎn)RNAi的發(fā)現(xiàn)目前三頁\總數(shù)三十一頁\編于十六點(diǎn)轉(zhuǎn)錄水平轉(zhuǎn)錄后水平基因沉默DNA甲基化異染色質(zhì)形成DNA分子的消融siRNA介導(dǎo)miRNA介導(dǎo)2RNAi的作用機(jī)制目前四頁\總數(shù)三十一頁\編于十六點(diǎn)2.1轉(zhuǎn)錄水平的基因沉默RNA分子介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄水平的基因沉默（transicriptionalgenesilencing，TGS）是指基因信息從DNA到mRNA的轉(zhuǎn)錄過程尚未啟動時，siRNA分子通過修飾染色體DNA分子或與其結(jié)合的組蛋白分子阻礙轉(zhuǎn)錄的發(fā)生目前五頁\總數(shù)三十一頁\編于十六點(diǎn)2.2轉(zhuǎn)錄后水平的基因沉默RNA分子介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄后水平的基因沉默（posttranscriptionalgenesilencing，PTGS）PTGS是指基因信息從DNA到mRNA的轉(zhuǎn)錄過程啟動后，siRNA分子通過RNA干擾機(jī)制降解mRNA或抑制mRNA翻譯，也包括在轉(zhuǎn)錄啟動后siRNA介導(dǎo)的基因第一外顯子序列的DNA甲基化。目前六頁\總數(shù)三十一頁\編于十六點(diǎn)2.3RNAi的主要過程起始階段dsRNA(500nt左右最佳)被Dicer酶特異性識別，以一種ATP依賴的方式逐步切割成siRNASmallinterferingRNA(siRNA)長度：21-25ntDicer是一種ATP依賴性RNaseⅢ型核酸內(nèi)切酶，對單鏈RNA沒有活性，對200~500nt的dsRNA作用效果最好目前七頁\總數(shù)三十一頁\編于十六點(diǎn)siRNA的結(jié)構(gòu)目前八頁\總數(shù)三十一頁\編于十六點(diǎn)2.效應(yīng)階段siRNA誘導(dǎo)沉默復(fù)合體（RNA-inducedsilencingcomplex，RISC）的形成RISC中解旋酶可依靠ATP供能，解開siRNA雙鏈，激活RISC在siRNA反義鏈的指導(dǎo)下(靶序列的識別），RISC中核酸內(nèi)切酶特異性切割、降解靶mRNA，導(dǎo)致基因表達(dá)失活目前九頁\總數(shù)三十一頁\編于十六點(diǎn)3.siRNA擴(kuò)增階段RNA依賴性的RNA聚合酶

(RNAdependentRNAPolymerase,RdRp)siRNA可作為引物，以mRNA為模板，在RdRP作用下合成出mRNA的互補(bǔ)鏈，它在Dicer酶的作用下也被裂解成新生的siRNA。通過這個聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，細(xì)胞內(nèi)的siRNA大大增加，顯著增加了對基因表達(dá)的抑制。目前十頁\總數(shù)三十一頁\編于十六點(diǎn)dsRNA外源dsRNA病毒dsRNA其他dsRNADicer雙鏈siRNAP特異性蛋白結(jié)合形成RISCsiRNA解鏈靶序列識別RDRP以siRNA為引物，RDRP催化合成新的dsRNA核酸酶降解mRNAmRNAsiRNARNAi作用機(jī)制目前十一頁\總數(shù)三十一頁\編于十六點(diǎn)2.4miRNA介導(dǎo)的RNAiMicroRNAs(miRNAs)是一種大小約為21-25個堿基的非編碼單鏈小分子RNA，是具有發(fā)夾結(jié)構(gòu)的約70-90個堿基大小的單鏈RNA前體(pre-miRNA)經(jīng)過Dicer酶加工后生成(LeeY,2003)。miRNA的功能也是由RISC介導(dǎo)的，最終引起蛋白質(zhì)翻譯受抑或者同源mRNA降解（BartelDP.，2004）。目前十二頁\總數(shù)三十一頁\編于十六點(diǎn)Table1.miRNA和siRNA介導(dǎo)RNAi的區(qū)別名稱miRNAsiRNA來源內(nèi)源轉(zhuǎn)錄本轉(zhuǎn)基因病毒RNA前體莖環(huán)狀的pre-miRNA雙鏈結(jié)構(gòu)dsRNA催化酶Dicer或者類似于Dicer的酶復(fù)合物Dicer匹配方式不完全互補(bǔ)（動物）或完全互補(bǔ)（植物）完全互補(bǔ)作用目標(biāo)的專一性（特異性）相對較低高作用點(diǎn)蛋白質(zhì)合成水平轉(zhuǎn)錄后水平大小約22nt約22nt功能發(fā)育過程中調(diào)節(jié)內(nèi)源基因表達(dá)抑制轉(zhuǎn)錄活性，病毒感染，表現(xiàn)遺傳靶基因的命運(yùn)抑制轉(zhuǎn)錄或者被降解被降解目前十三頁\總數(shù)三十一頁\編于十六點(diǎn)確定目的基因

根據(jù)相對應(yīng)的核酸序列確定dsRNA模板區(qū)域

獲得dsRNA

用dsRNA轉(zhuǎn)染細(xì)胞

分析RNA干擾的效果3昆蟲RNAi技術(shù)的實(shí)驗(yàn)方法RNA干擾研究的一般流程目前十四頁\總數(shù)三十一頁\編于十六點(diǎn)RNAi實(shí)驗(yàn)對照設(shè)置對照組設(shè)置原理普通陰性對照

與目的基因的序列無同源性和目的靶細(xì)胞中其它基因同源性很低熒光標(biāo)記陰性對照

方便地在熒光顯微鏡下觀察轉(zhuǎn)染情況可用于優(yōu)化轉(zhuǎn)染條件和評價轉(zhuǎn)染效率陽性對照確認(rèn)RNAi實(shí)驗(yàn)中轉(zhuǎn)染、RNA提取和基因表達(dá)檢測方法是否可靠

LaminA/C、GFP22、

LuciferaseGL2、MAPK1、Beta-Actin、Vimentin、P53、GAPDH、CyclophilinB轉(zhuǎn)染試劑對照檢測轉(zhuǎn)染試劑對細(xì)胞的毒性、細(xì)胞的成活率等細(xì)胞轉(zhuǎn)染的各個因素影響避免Off-target對照針對同一個基因的不同區(qū)域的多個siRNA進(jìn)行實(shí)驗(yàn)Table2.RNAi實(shí)驗(yàn)對照設(shè)置目前十五頁\總數(shù)三十一頁\編于十六點(diǎn)1.dsRNA模板的選擇選擇的dsRNA模板區(qū)域不要針對5’和3’端的非編碼區(qū)通常選擇的模板長度約為500bp在合成dsRNA之前，應(yīng)該先進(jìn)行dsRNA和其他mRNA的同源性比對3.1dsRNA的獲得目前十六頁\總數(shù)三十一頁\編于十六點(diǎn)3.2dsRNA的合成方法1.體外轉(zhuǎn)錄法原理：采用5’-末端含有T7、Sp6或T3RNA多聚酶識別序列的寡核苷酸引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增目的片段，然后在T7、Sp6或T3RNA多聚酶的作用下轉(zhuǎn)錄成RNA，通過簡單的退火、核酸酶消化和離心等步驟后即可獲得dsRNA目前十七頁\總數(shù)三十一頁\編于十六點(diǎn)用于制備長度范圍在200bp-1000bp的dsRNA采用Ambion專利的體外轉(zhuǎn)錄技術(shù)，能合成達(dá)

50–80μg

的雙鏈RNA試劑盒包括dsRNA純化試劑dsRNA合成－MEGAscript?RNAiKit目前十八頁\總數(shù)三十一頁\編于十六點(diǎn)2.構(gòu)建RNAi表達(dá)載體制備dsRNA

表達(dá)載體可分為兩個類型：單啟動子載體，需要插入反向重復(fù)DNA（由正義鏈、間隔序列和反義鏈組成），在轉(zhuǎn)錄的過程中，反向重復(fù)序列可產(chǎn)生由內(nèi)部堿基互補(bǔ)而回折形成的發(fā)夾RNA分子，然后加工形成dsRNA；雙驅(qū)動子載體，將靶DNA置入克隆位點(diǎn)后，雙啟動子分別表達(dá)正義鏈和反義鏈，然后在胞內(nèi)結(jié)合形成dsRNA目前十九頁\總數(shù)三十一頁\編于十六點(diǎn)單啟動子載體目前二十頁\總數(shù)三十一頁\編于十六點(diǎn)雙驅(qū)動子載體——質(zhì)粒L4440DNA模板（Timmons和Fire，2001）目前二十一頁\總數(shù)三十一頁\編于十六點(diǎn)3.3昆蟲RNAi的導(dǎo)入方法dsRNA微量注射法InjectionAdultPupaEmbryoLarvalNanojectIIAuto-NanoliterInjector目前二十二頁\總數(shù)三十一頁\編于十六點(diǎn)Table3.昆蟲RNAi的導(dǎo)入方法注射法飼喂法組織培養(yǎng)法操作時期卵、幼蟲、蛹、成蟲幼蟲、成蟲培養(yǎng)細(xì)胞、胚胎部分幼蟲操作方法微量注射器dsRNA人工飼料菌液、轉(zhuǎn)基因dsRNA培養(yǎng)基優(yōu)點(diǎn)dsRNA迅速到達(dá)組織精確地導(dǎo)入dsRNA操作容易、省時、經(jīng)濟(jì)不造成機(jī)械損傷成活率高大量昆蟲同時連續(xù)攝取dsRNA適合用于害蟲控制適用于長期研究操作簡單適用于大規(guī)劃的基因功能篩選缺點(diǎn)操作難度大、耗時成活率較低難于用于大規(guī)模分析基因沉默效率可能較低不同昆蟲由于腸道環(huán)境不同導(dǎo)致dsRNA攝取效率差異較大昆蟲攝取的dsRNA量難于確定基因沉默效率較低需要較高濃度的dsRNA目前二十三頁\總數(shù)三十一頁\編于十六點(diǎn)4RNAi技術(shù)在昆蟲學(xué)研究中的應(yīng)用

特點(diǎn)：高效、特異性強(qiáng)、快速且經(jīng)濟(jì)RNAi技術(shù)基因功能研究的優(yōu)點(diǎn)：RNAi技術(shù)不破壞基因的完整性，可以先將特定基因的表達(dá)封閉，然后再激活可以同時封閉基因家族或具有高度相似性的一組基因，從而解決由于多個基因的功能沉余造成的難于檢測到單個基因突變表型的問題目前二十四頁\總數(shù)三十一頁\編于十六點(diǎn)Table4.RNAiresearchonfunctionalgenesininsectsInsectsGenesandReferencesMethodsEffectsSilkwormBombyxmori家蠶Circadianclockgeneper(Sandrellietal.,2007)

Transgenics

Disruptionofegg-atchingEcdysis-triggeringhormonegeneETH(Daietal.,2008)TransgenicsLethalatpharatesecond-instarlarvalstage

EgyptiancottonleafwormSpodopteralittoralisβ-actingene(Gvakhariaetal.,2003)InjectionDisruptionofspermreleaseCircadianclockgeneper(Kotwicaetal.,2009)InjectionDelayedspermreleaseLightbrownapplemothEpiphyasPostvittana蘋果淺褐卷蛾CarboxylesterasegeneEposCXE1andpheromonebindingproteingeneEposPBP1(Turneretal.,2006)FeedingInhibitionofgeneexpressionCottonbollwormHelicoverpaarmigeraCytochromeP450geneCYP6AE14(Maoetal.,2007)FeedingInhibitionoflarvalgrowthGlutathione-S-transferasegeneGST1(Maoetal.,2007)FeedingSuccessfulinhibitionofgeneexpression目前二十五頁\總數(shù)三十一頁\編于十六點(diǎn)InsectsGenesandReferencesMethodsEffectsBeetarmywormSpodopteraexiguaChitinsynthasegene(Chenetal.,2008)InjectionDisorderintheinsectcuticle,noexpansionofthelarvaltracheaepithelialwall,andotherlarvalabnormalitiesJapanesepinesawyerMonochamusAlternatus松墨天牛LaccasegeneMaLac2(Niuetal.,2008)InjectionPupalandadultcuticlesclerotisation,deathatahighdoseRedflourbeetleTriboliumcastaneumChitinsynthasegenesTcCHS1andTcCHS2(Arakaneetal.,2005)InjectionDisruptioninalltypesofmoulting(larva-larva,larva-pupa,andpupa-adult),cessationofingestion,decreaseinlarvalsize,andreductionofchitincontentinthemidgutChitinase-likeproteinsTcCHT5,TcCHT10,TcCHT7,andTcIDGF4(Zhuetal.,2008)InjectionEffectsonpupal-adultmoultingEffectsonegghatching,larvalmoulting,pupation,andadultmetamorphosis.Effectsonabdominalcontractionandwing/elytraextension.Effectsonadulteclosion續(xù)Table4.RNAiresearchonfunctionalgenesininsects目前二十六頁\總數(shù)三十一頁\編于十六點(diǎn)續(xù)Table4.RNAiresearchonfunctionalgenesininsectsInsectsGenesandReferencesMethodsEffectsWesterncornrootwormDiabroticavirgiferavirgiferaLeConte玉米根螢葉甲

VacuolarATPase(v-ATP)(Baumetal.,2007)FeedingDelayedlarvaldevelopmentandincreasedmortalityStripedfleabeetlePhyllotretastriolataArgininekinasegeneAK(Zhaoetal.,2008)FeedingDelayeddevelopment,increasedmortality,andreducedfertilityMediterraneanfieldcricketGryllusBimaculatus蟋蟀Circadianclockgeneper(Moriyamaetal.,2008)InjectionCompletelossofcircadiancontroloflocomotoractivityandelectricalactivityintheopticlobeNitricoxidesynthasegeneNOS(Takahashietal.,2009)InjectionDestructionoflong-termmemory目前二十七頁\總數(shù)三十一頁\編于十六點(diǎn)續(xù)Table4.RNAiresearchonfunctionalgenesininsectsInsectsGenesandReferencesMethodsEffectsGermancockroachBlattellaGermanica德國小蠊BgRXRgene(Martinetal.,2006)InjectionInhibitionofpupaleclosionPigment-dispersingfactorgenepdf(Leeetal.,2009)InjectionEffectsoninsectnightactivityAmericangrasshopperSchistocercaAmericana美洲沙蝗Eyecolourgenevermilion(DongandFriedrich,2005)InjectionSuppressionofommochromeformationandsystematicexpressionBrownplanthopperNilaparvataLugens褐飛虱Trehalosephosphatesynthase(TPS)(NlTPSmRNA)(Chenetal.,2010FeedingDisturbeddevelopmentthroughdisruptionintheTPSenzymaticactivity,reductionofinsectsurvivalrateTurnipsawflyAthaliarosaeArwhitegene(Sumitanietal.,2005)InjectionWhitephenocopyinembryoniceyepigmentation目前二十八頁\總數(shù)三十一頁\編于十六點(diǎn)續(xù)表Table4.RNAiresearchonfunctionalgenesininsectsInsectsGenesandReferencesMethodsEffectsEuropeanhoneybeeApismelliferaTranscriptionfactorgeneRelish(SchlünsandCrozier,2007)InjectionInhibitionofRelishgeneexpressionandreductionintheexpressionoftwootherimmunegenes,abaecinandhymenoptaecinTriatomidbugRhodniusprolixus長紅獵蝽Salivarynitrophorin2geneNP2(Araujoetal.,2006)InjectionandfeedingShortenedplasmacoagulationtimeSavannahtsetseflyGlossinamorsitansMorsitans刺舌蠅TsetseEPgeneandtransferringene2A192(Walsheetal.,2009)feedingInhibitionofTsetseEPgeneexpression,butnoinhibitionof2A192geneexpressionEasternsubterraneanTermiteReticulitermesFlavipes東方散白蟻CellulaseenzymegeneCell-1andcasteregulatoryhexamerinstorageproteingeneHex-2(Zhouetal.,2008)feedingReductioningroupfitnessandincreasedmortality目前二十九頁\總數(shù)三十一頁\編于十六點(diǎn)TitleTitleTitleInfeedingexperimentsmostsequencesrangebetween300and520bp，ButInthecaseofS2cells,itshouldbeminimally211bp.Thesequenceusedwilldeterminepossibleoff-targeteffectsinthetargetorganism,butalsoinotherin