m第十四章 基因工程

基因重組和基因工程

第十四章目錄目前一頁\總數(shù)九十六頁\編于十五點第一節(jié)

DNA的重組

DNARecombination

目前二頁\總數(shù)九十六頁\編于十五點DNA重組細菌的基因轉(zhuǎn)移與重組接合作用、轉(zhuǎn)化作用、轉(zhuǎn)導作用轉(zhuǎn)座重組同源重組特異位點的重組目前三頁\總數(shù)九十六頁\編于十五點發(fā)生在同源序列間的重組稱為同源重組，又稱基本重組。是最基本的DNA重組方式，通過鏈的斷裂和再連接，在兩個DNA分子同源序列間進行單鏈或雙鏈片段的交換。以E.coli的同源重組為例，了解同源重組機制的Holliday模型。一、同源重組目前四頁\總數(shù)九十六頁\編于十五點Holliday模型中，同源重組主要4個關鍵步驟①兩個同源染色體DNA排列整齊②一個DNA的一條鏈斷裂、并與另一個DNA對應的鏈連接，形成Holliday中間體③通過分支移動產(chǎn)生異源雙鏈DNA④Holliday中間體切開并修復，形成兩個雙鏈重組體DNA，分別為：片段重組體拼接重組體目前五頁\總數(shù)九十六頁\編于十五點

內(nèi)切酶(recBCD)DNA侵擾(recA)分支遷移(recA)

內(nèi)切酶(recBCD)

DNA連接酶5′3′5′3′5′3′5′3′5′3′5′3′5′3′5′3′5′3′5′3′5′3′5′3′5′3′5′3′3′3′5′3′5′3′3′5′5′3′5′3′5′3′Holiday中間體5′3′5′3′5′3′5′3′目錄目前六頁\總數(shù)九十六頁\編于十五點片段重組體：切開的鏈與原來斷裂的是同一條鏈，重組體含有一段異源雙鏈區(qū)，其兩側(cè)來自同一親本DNA。拼接重組體：切開的鏈并非原來斷裂的鏈，重組體異源雙鏈區(qū)的兩側(cè)來自不同親本DNA。目前七頁\總數(shù)九十六頁\編于十五點Holiday中間體5′3′5′3′5′3′5′3′5′3′5′5′5′3′3′3′5′5′5′5′3′3′3′3′5′5′5′5′3′3′3′3′5′5′5′5′3′3′3′3′5′5′5′5′3′3′3′3′內(nèi)切酶(ruvC)內(nèi)切酶(ruvC)DNA連接酶DNA連接酶片段重組體拼接重組體目錄目前八頁\總數(shù)九十六頁\編于十五點二、細菌的基因轉(zhuǎn)移與重組接合作用轉(zhuǎn)化作用轉(zhuǎn)導作用細胞融合目前九頁\總數(shù)九十六頁\編于十五點（一）接合作用當細胞或細菌通過菌毛相互接觸時，質(zhì)粒DNA從一個細胞（細菌）轉(zhuǎn)移至另一細胞（細菌），這種DNA轉(zhuǎn)移稱為接合作用。質(zhì)?！毦旧w外的小型環(huán)狀雙鏈DNA分子目前十頁\總數(shù)九十六頁\編于十五點可接合質(zhì)粒如F因子(Ffactor)目前十一頁\總數(shù)九十六頁\編于十五點（二）轉(zhuǎn)化作用通過自動獲取或人為地供給外源DNA，使細胞或培養(yǎng)的受體細胞獲得新的遺傳表型，稱為轉(zhuǎn)化作用

。

目前十二頁\總數(shù)九十六頁\編于十五點例：溶菌時，裂解的DNA片段被另一細菌攝取。目前十三頁\總數(shù)九十六頁\編于十五點目錄目前十四頁\總數(shù)九十六頁\編于十五點（三）轉(zhuǎn)導作用當病毒從被感染的細胞（供體）釋放出來、再次感染另一細胞（受體）時，發(fā)生在供體細胞與受體細胞之間的DNA轉(zhuǎn)移及基因重組即為轉(zhuǎn)導作用。目前十五頁\總數(shù)九十六頁\編于十五點λ噬菌體的生活史溶菌生長途徑溶源菌生長途徑例目錄目前十六頁\總數(shù)九十六頁\編于十五點目錄目前十七頁\總數(shù)九十六頁\編于十五點三、位點特異重組位點特異重組是由整合酶催化，在兩個DNA序列的特異位點間發(fā)生的整合。目前十八頁\總數(shù)九十六頁\編于十五點例（一）λ噬菌體DNA的整合λ噬菌體的整合酶識別噬菌體和宿主染色體的特異靶位點發(fā)生選擇性整合；反轉(zhuǎn)錄病毒整合酶可特異地識別、整合反轉(zhuǎn)錄病毒cDNA的長末端重復序列(LTR)。

目前十九頁\總數(shù)九十六頁\編于十五點例（二）細菌的特異位點重組鼠傷寒沙門桿菌H片段倒位決定鞭毛相轉(zhuǎn)變目前二十頁\總數(shù)九十六頁\編于十五點hix為反向重復序列，它們之間的H片段可在Hin控制下進行特異位點重組(倒位)。H片段上有兩個啟動子P，其一驅(qū)動hin基因表達，另一正向時驅(qū)動H2和rH1基因表達，反向(倒位)時H2和rH1不表達。rH1為H1的阻遏蛋白基因。目前二十一頁\總數(shù)九十六頁\編于十五點H2鞭毛素阻遏蛋白Hin重組酶轉(zhuǎn)位片段H1鞭毛素沙門氏菌H片段倒位決定鞭毛相轉(zhuǎn)變hinH2IDNA啟動序列H1啟動序列hinH2IH1目前二十二頁\總數(shù)九十六頁\編于十五點例（三）免疫球蛋白基因的重排免疫球蛋白(Ig)，由兩條輕鏈(L鏈)和兩條重鏈(H鏈)組成，分別由三個獨立的基因族編碼，其中兩個編碼輕鏈(和)，一個編碼重鏈。

輕鏈的基因片段：重鏈的基因片段：LVJCLVDJC目前二十三頁\總數(shù)九十六頁\編于十五點重鏈(IgH)基因的V-D-J重排和輕鏈(IgL)基因的V-J重排均發(fā)生在特異位點上。在V片段的下游，J片段的上游以及D片段的兩側(cè)均存在保守的重組信號序列(recombinationsignalsequence,RSS)。此重排的重組酶基因rag(recombinationactivatinggene)共有兩個，分別產(chǎn)生蛋白質(zhì)RAG1和RAG2。

CACAGTG(12/23)ACAAAAACCGTGTCCACTGTTTTTGG重組信號序列基因片段目前二十四頁\總數(shù)九十六頁\編于十五點V片段J片段RSSRSS間插DNAOHOHVJ單鏈切開RAG1RAG2分子內(nèi)轉(zhuǎn)酯反應單鏈切開轉(zhuǎn)移核苷酸修復、連接免疫球蛋白基因重排過程目錄目前二十五頁\總數(shù)九十六頁\編于十五點四、轉(zhuǎn)座重組由插入序列和轉(zhuǎn)座子介導的基因移位或重排稱為轉(zhuǎn)座(transposition)。目前二十六頁\總數(shù)九十六頁\編于十五點典型的插入序列(IS)組成：二個分離的反向重復(IR)序列一個轉(zhuǎn)座酶（transposase)編碼基因特有的正向重復序列

IRTransposaseGeneIR發(fā)生形式：保守性轉(zhuǎn)座復制性轉(zhuǎn)座（一）插入序列轉(zhuǎn)座目前二十七頁\總數(shù)九十六頁\編于十五點插入序列的復制性轉(zhuǎn)座目錄目前二十八頁\總數(shù)九十六頁\編于十五點轉(zhuǎn)座子(transposons)——可從一個染色體位點轉(zhuǎn)移到另一位點的分散重復序列。

轉(zhuǎn)座子組成：反向重復序列轉(zhuǎn)座酶編碼基因抗生素抗性等有用的基因IRIRTransposaseGene有用基因（二）轉(zhuǎn)座子轉(zhuǎn)座目前二十九頁\總數(shù)九十六頁\編于十五點目前三十頁\總數(shù)九十六頁\編于十五點由轉(zhuǎn)座子介導的轉(zhuǎn)座目錄目前三十一頁\總數(shù)九十六頁\編于十五點第二節(jié)

重組DNA技術DNARecombinationTechnique目前三十二頁\總數(shù)九十六頁\編于十五點重組DNA技術的發(fā)展史年G.J.Mendel的豌豆雜交試驗1944年O.T.Avery的肺炎球菌轉(zhuǎn)化實驗1973年美國斯坦福大學的科學家構(gòu)建第一個重組DNA分子1977年美國南舊金山由博耶和斯旺森建立世界上第一家遺傳工程公司，專門應用重組DNA技術制造醫(yī)學上重要的藥物。1980年開始建造第一家應用重組DNA技術生產(chǎn)胰島素的工廠1997年英國羅林研究所成功的克隆了多莉目前三十三頁\總數(shù)九十六頁\編于十五點相關概念DNA克隆工具酶目的基因基因載體基本原理重組DNA技術與醫(yī)學的關系本節(jié)主要內(nèi)容目前三十四頁\總數(shù)九十六頁\編于十五點一、重組DNA技術相關概念克隆(clone)來自同一始祖的相同副本或拷貝的集合。獲取同一拷貝的過程稱為克隆化(cloning)，即無性繁殖。（一）DNA克隆目前三十五頁\總數(shù)九十六頁\編于十五點技術水平：分子克隆即DNA克隆

細胞克隆個體克隆（動物或植物）目前三十六頁\總數(shù)九十六頁\編于十五點DNA克隆應用酶學的方法，在體外將各種來源的遺傳物質(zhì)（同源的或異源的、原核的或真核的、天然的或人工的DNA）與載體DNA接合成一具有自我復制能力的DNA分子——復制子，繼而通過轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染宿主細胞，篩選出含有目的基因的轉(zhuǎn)化子細胞，再進行擴增提取獲得大量同一DNA分子。也稱基因克隆或重組DNA。目前三十七頁\總數(shù)九十六頁\編于十五點生物技術工程:

基因工程、蛋白質(zhì)工程、酶工程、細胞工程等目的①分離獲得某一感興趣的基因或DNA②獲得感興趣基因的表達產(chǎn)物（蛋白質(zhì)）基因工程(geneticengineering)

——實現(xiàn)基因克隆所用的方法及相關的工作稱基因工程，又稱重組DNA工藝學。目前三十八頁\總數(shù)九十六頁\編于十五點（二）工具酶限制性核酸內(nèi)切酶DNA聚合酶Ⅰ逆轉(zhuǎn)錄酶T4DNA連接酶堿性磷酸酶末端轉(zhuǎn)移酶

TaqDNA聚合酶目前三十九頁\總數(shù)九十六頁\編于十五點重組DNA技術中常用的工具酶工具酶功能限制性核酸內(nèi)切酶識別特異序列，切割DNADNA連接酶催化DNA中相鄰的5′磷酸基和3′羥基末端之間形成磷酸二酯鍵，使DNA切口封合或使兩個DNA分子或片段連接DNA聚合酶Ⅰ合成雙鏈cDNA分子或片段連接缺口平移制作高比活探針DNA序列分析填補3′末端Klenow片段又名DNA聚合酶I大片段，具有完整DNA聚合酶I的53聚合、35外切活性，而無53外切活性。常用于cDNA第二鏈合成，雙鏈DNA3末端標記等反轉(zhuǎn)錄酶合成cDNA替代DNA聚合酶I進行填補，標記或DNA序列分析多聚核苷酸激酶催化多聚核苷酸5′羥基末端磷酸化，或標記探針末端轉(zhuǎn)移酶在3′羥基末端進行同質(zhì)多聚物加尾堿性磷酸酶切除末端磷酸基目前四十頁\總數(shù)九十六頁\編于十五點限制性核酸內(nèi)切酶定義限制性核酸內(nèi)切酶(RE)是識別DNA的特異序列,并在識別位點或其周圍切割雙鏈DNA的一類內(nèi)切酶。GGATCCCCTAGGGCCTAGGATCCG+BamHⅠ目前四十一頁\總數(shù)九十六頁\編于十五點作用與甲基化酶共同構(gòu)成細菌的限制-修飾系統(tǒng)，限制外源DNA，保護自身DNA。分類Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ（基因工程技術中常用Ⅱ型）目前四十二頁\總數(shù)九十六頁\編于十五點第一個字母取自產(chǎn)生該酶的細菌屬名，用大寫；第二、第三個字母是該細菌的種名，用小寫；第四個字母代表株；用羅馬數(shù)字表示發(fā)現(xiàn)的先后次序。命名HindⅢ屬

系

株序Haemophilusinfluenzaed株流感嗜血桿菌d株的第三種酶目前四十三頁\總數(shù)九十六頁\編于十五點Ⅱ類酶識別序列特點——

回文結(jié)構(gòu)(palindrome)

切口：平端切口、粘端切口GGATCCCCTAGG目前四十四頁\總數(shù)九十六頁\編于十五點BamHⅠGTCCAGGCCTAGGATCCG+GGATCCCCTAGGHindⅡGTCGACCAGCTGGACCTG+平端切口粘端切口目前四十五頁\總數(shù)九十六頁\編于十五點同功異源酶來源不同的限制酶，但能識別和切割同一位點，這些酶稱同功異源酶。GGATCCCCTAGGGCCTAGGATCCG+BamHⅠGGATCCCCTAGGGCCTAGGATCCG+BstⅠ目前四十六頁\總數(shù)九十六頁\編于十五點同尾酶有些限制性內(nèi)切酶雖然識別序列不完全相同，但切割DNA后，產(chǎn)生相同的粘性末端，稱為同尾酶。這兩個相同的粘性末端稱為配伍未端。BamHⅠBglⅡGGATCCCCTAGGAGATCTTCTAGAGCCTAGGATCCG++ATCTAG

GATCTA目前四十七頁\總數(shù)九十六頁\編于十五點（三）目的基因

cDNA基因組DNA目的基因①分離獲得某一感興趣的基因或DNA②獲得感興趣基因的表達產(chǎn)物（蛋白質(zhì)）目前四十八頁\總數(shù)九十六頁\編于十五點（四）基因載體定義為攜帶目的基因，實現(xiàn)其無性繁殖或表達有意義的蛋白質(zhì)所采用的一些DNA分子。常用載體質(zhì)粒DNA噬菌體DNA病毒DNA目前四十九頁\總數(shù)九十六頁\編于十五點克隆載體(cloningvector)為使插入的外源DNA序列被擴增而特意設計的載體稱為克隆載體。表達載體(expressionvector)為使插入的外源DNA序列可轉(zhuǎn)錄翻譯成多肽鏈而特意設計的載體稱為表達載體。目前五十頁\總數(shù)九十六頁\編于十五點載體的選擇標準能自主復制；具有兩個以上的遺傳標記物，便于重組體的篩選和鑒定；有克隆位點（外源DNA插入點），常具有多個單一酶切位點，稱為多克隆位點；分子量小，以容納較大的外源DNA。目前五十一頁\總數(shù)九十六頁\編于十五點1.質(zhì)粒

(plasmid)特點能在宿主細胞內(nèi)獨立自主復制；帶有某些遺傳信息,會賦予宿主細胞一些遺傳性狀。目前五十二頁\總數(shù)九十六頁\編于十五點目錄目前五十三頁\總數(shù)九十六頁\編于十五點λ噬菌體DNA改造系統(tǒng)λgt系列（插入型，適用cDNA克隆）EMBL系列（置換型，適用基因組克?。?.噬菌體(phage)

M13噬菌體DNA改造系統(tǒng)（含lacZ基因）M13mp系列pUC系列目前五十四頁\總數(shù)九十六頁\編于十五點M13噬菌體pUC系列的物理圖譜目前五十五頁\總數(shù)九十六頁\編于十五點3.粘性質(zhì)粒(cosmid)目前五十六頁\總數(shù)九十六頁\編于十五點酵母人工染色體(yeastartificialchromosome,YAC)細菌人工染色體(bacterialartificialchromosome,BAC)動物病毒DNA改造的載體（如腺病毒，腺病毒相關病毒，逆轉(zhuǎn)錄病毒）其他目前五十七頁\總數(shù)九十六頁\編于十五點二、重組DNA技術基本原理克隆基本過程目的基因的獲取DNA導入受體菌外源基因與載體的連接克隆載體的選擇和構(gòu)建重組體的篩選克隆基因的表達

目前五十八頁\總數(shù)九十六頁\編于十五點以質(zhì)粒為載體的DNA克隆過程目錄目前五十九頁\總數(shù)九十六頁\編于十五點（一）目的基因的獲取1.化學合成法要求：已知目的基因的核苷酸序列或其產(chǎn)物的氨基酸序列。2.基因組DNA文庫(genomicDNAlibrary)3.cDNA文庫(cDNAlibrary)4.聚合酶鏈反應(polymerasechainreaction,PCR)（見第22章）目前六十頁\總數(shù)九十六頁\編于十五點*1、化學合成法獲取目的基因由已知氨基酸序列推測可能的DNA序列目前六十一頁\總數(shù)九十六頁\編于十五點組織或細胞染色體DNA基因片斷克隆載體重組DNA分子含重組分子的轉(zhuǎn)化菌限制性內(nèi)切酶受體菌基因組DNA文庫存在于轉(zhuǎn)化細胞內(nèi)由克隆載體所攜帶的所有基因組DNA的集合*2、從基因組DNA文庫獲取目的基因目錄目前六十二頁\總數(shù)九十六頁\編于十五點目前六十三頁\總數(shù)九十六頁\編于十五點目前六十四頁\總數(shù)九十六頁\編于十五點（二）克隆載體的選擇和構(gòu)建目前六十五頁\總數(shù)九十六頁\編于十五點（三）外源基因與載體的連接1.粘性末端連接方式：(1)同一限制酶切位點連接(2)不同限制酶切位點連接配伍末端連接非配伍末端連接目前六十六頁\總數(shù)九十六頁\編于十五點BamHⅠ切割反應

GGATCCCCTAGGT4

DNA連接酶15oCGATCCGGCCTAG+目的基因用BamHⅠ切割載體DNA用BamHⅠ切割重組體載體自連目的基因自連同一限制酶切位點連接目錄目前六十七頁\總數(shù)九十六頁\編于十五點BamHⅠBglⅡGGATCCCCTAGGAGATCTTCTAGAGCCTAGGATCCG++ATCTAG

GATCTA不同限制酶切位點（配伍末端）的連接配伍末端的連接情況和同一限制酶切位點連接相似。目前六十八頁\總數(shù)九十六頁\編于十五點不同限制酶切位點（非配伍末端）的連接EcoRⅠ切割位點BglⅡ切割位點+EcoRⅠ+BglⅡ雙酶切EcoRⅠ+BglⅡ雙酶切T4

DNA連接酶15oC重組體目錄目前六十九頁\總數(shù)九十六頁\編于十五點2.平端連接適用于：限制性內(nèi)切酶切割產(chǎn)生的平端粘端補齊或切平形成的平端目前七十頁\總數(shù)九十六頁\編于十五點目的基因載體限制性內(nèi)切酶限制性內(nèi)切酶T4DNA連接酶15oC重組體載體自連目的基因自連目錄目前七十一頁\總數(shù)九十六頁\編于十五點3.同聚物加尾連接在末端轉(zhuǎn)移酶(terminaltransferase)的作用下，在DNA片段末端加上同聚物序列、制造出粘性末端，再進行粘端連接。目前七十二頁\總數(shù)九十六頁\編于十五點5′3′3′5′載體DNA5′3′3′5′目的基因限制酶或機械剪切限制酶5′3′3′5′5′3′T(T)nT

T(T)nT3′5′5′

3′3′5′5′3′A(A)nA

A(A)nA3′5′λ-核酸外切酶λ-核酸外切酶末端轉(zhuǎn)移酶+dATP末端轉(zhuǎn)移酶+dTTPT(T)nTA(A)nAA(A)nAT(T)nTT4

DNA連接酶15oC重組體目錄目前七十三頁\總數(shù)九十六頁\編于十五點4.人工接頭(linker)連接由平端加上新的酶切位點，再用限制酶切除產(chǎn)生粘性末端，而進行粘端連接。

目前七十四頁\總數(shù)九十六頁\編于十五點人工接頭及其應用CCGAATTCGGGCTTAAGC5′-3′-EcoRⅠEcoRⅠEcoRⅠEcoRⅠ目錄目前七十五頁\總數(shù)九十六頁\編于十五點受體菌條件安全宿主菌（從大腸桿菌K-12改造）限制酶和重組酶缺陷處于感受態(tài)導入方式轉(zhuǎn)化轉(zhuǎn)染感染（四）重組DNA導入受體菌目前七十六頁\總數(shù)九十六頁\編于十五點（五）重組體的篩選

1.直接選擇法(1)

抗藥性標記選擇(2)標志補救(markerrescue)(3)分子雜交法原位雜交Southern印跡2.免疫學方法如免疫化學方法及酶免檢測分析等目前七十七頁\總數(shù)九十六頁\編于十五點(插入失活法)抗藥性標記選擇目錄目前七十八頁\總數(shù)九十六頁\編于十五點目前七十九頁\總數(shù)九十六頁\編于十五點α互補目錄目前八十頁\總數(shù)九十六頁\編于十五點α互補的檢測目錄目前八十一頁\總數(shù)九十六頁\編于十五點原位雜交目錄目前八十二頁\總數(shù)九十六頁\編于十五點Southern印跡目錄目前八十三頁\總數(shù)九十六頁\編于十五點雞的β肌球蛋白的克隆和檢出目錄目前八十四頁\總數(shù)九十六頁\編于十五點重組DNA技術操作過程可形象歸納為小結(jié)分分離目的基因切限制酶切目的基因與載體接拼接重組體轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)入受體菌篩篩選重組體目前八十五頁\總數(shù)九十六頁\編于十五點重組DNA技術操作的主要步驟載體質(zhì)粒噬菌體病毒目的基因（外源基因）基因組DNAcDNA人工合成PCR產(chǎn)物限制酶消化開環(huán)載體DNA目的基因連接酶重組體轉(zhuǎn)化體外包裝，轉(zhuǎn)染帶重組體的宿主篩選表型篩選酶切電泳鑒定菌落原位雜交目錄目前八十六頁\總數(shù)九十六頁\編于十五點表達體系的建立表達載體的構(gòu)建受體細胞的建立表達產(chǎn)物的分離純化（六）克隆基因的表達目前八十七頁\總數(shù)九十六頁\編于十