RNA提取及PCR相關(guān)技術(shù)

RNA提取及PCR相關(guān)

實(shí)驗(yàn)技術(shù)目前一頁(yè)\總數(shù)五十二頁(yè)\編于十六點(diǎn)RNA提取逆轉(zhuǎn)錄實(shí)驗(yàn)步驟結(jié)果分析PCRqPCR內(nèi)容目前二頁(yè)\總數(shù)五十二頁(yè)\編于十六點(diǎn)從RNA提取到基因定性/定量流程收集并保存組織、血液、細(xì)胞等臨床樣本提取、純化RNA逆轉(zhuǎn)錄生成cDNAPCR/qPCR進(jìn)行定性/定量分析目前三頁(yè)\總數(shù)五十二頁(yè)\編于十六點(diǎn)樣本保存要求最好使用新鮮樣品組織：取樣離體后，立即分成1cm3左右的小塊，

每塊約30-100mg，放入凍存管或錫箔紙包好，

立即放置液氮罐中速凍1小時(shí)，-80℃冰箱保存。注意做好標(biāo)記，避免反復(fù)凍融第一部分RNA提取目前四頁(yè)\總數(shù)五十二頁(yè)\編于十六點(diǎn)RNA提取樣本保存要求細(xì)胞：不建議保存。

培養(yǎng)處理后立即提取RNA， 或收集后，于Trizol液中-80℃保存。血液：不建議長(zhǎng)期保存。

或立即分離白細(xì)胞后，于Trizol液中-80℃保存。目前五頁(yè)\總數(shù)五十二頁(yè)\編于十六點(diǎn)試劑耗材準(zhǔn)備工作目的：去除RNase，防止RNA降解?各種離心管、Tip頭、冷凍保存管等塑料器皿： 浸泡在0.1%的DEPC水中，過(guò)夜處理，次日烘干， 高壓滅菌后再次烘干。?錫箔紙、玻璃勻漿管、研缽、手術(shù)剪刀、鑷子、移液管等玻璃、金屬及陶瓷制品：用錫箔紙嚴(yán)密包裹后，150℃高溫烘烤4小時(shí)。目前六頁(yè)\總數(shù)五十二頁(yè)\編于十六點(diǎn)前期準(zhǔn)備工作?RNase-free水：0.1％DEPC處理去離子水過(guò)夜，次日高壓滅菌除去殘留DEPC，分裝1.5mlEppendorf管，4℃保存。?75％乙醇：用RNase-free水配制，分裝為50ml，4℃保存。?氯仿、異丙醇、無(wú)水乙醇：新包裝開(kāi)封后，分裝50ml，4℃保存。注意：DEPC有吸入毒性，需穿工作服，戴手套、口罩操作。目前七頁(yè)\總數(shù)五十二頁(yè)\編于十六點(diǎn)樣本準(zhǔn)備

組織

大鼠組織樣品量總RNA量（μg）腦10mg8肺10mg10腎臟10mg10心臟10mg20脾臟10mg35肝臟10mg4050－100mg組織對(duì)應(yīng)1mlTrizol目前八頁(yè)\總數(shù)五十二頁(yè)\編于十六點(diǎn)樣本準(zhǔn)備

細(xì)胞?懸浮細(xì)胞：生長(zhǎng)對(duì)數(shù)期誘導(dǎo)后，5000×g，5min離心去 除培養(yǎng)基，收集約5-10×106個(gè)細(xì)胞。

每5-10×106個(gè)細(xì)胞對(duì)應(yīng)1mlTrizol

?貼壁細(xì)胞：生長(zhǎng)對(duì)數(shù)期誘導(dǎo)后，收集約5-10×106個(gè)細(xì) 胞，倒掉培養(yǎng)基，加入預(yù)熱PBS洗一次，去 除PBS。每10cm2培養(yǎng)面積對(duì)應(yīng)1mlTrizol目前九頁(yè)\總數(shù)五十二頁(yè)\編于十六點(diǎn)RNA的提取注意佩戴口罩、勤更換手套

組織（1）液氮預(yù)冷研缽；（2）液氮研磨，至樣品呈粉末狀（需8-10min）；（3）向研缽內(nèi)加入1mlTrizol繼續(xù)研磨，至呈不黏稠液態(tài)；（4）將混合液轉(zhuǎn)移至玻璃勻漿器中，冰上勻漿3min；（5）將勻漿液轉(zhuǎn)移至1.5mlEppendorf管，室溫孵育5min；裂解目前十頁(yè)\總數(shù)五十二頁(yè)\編于十六點(diǎn)目前十一頁(yè)\總數(shù)五十二頁(yè)\編于十六點(diǎn)RNA的提取

細(xì)胞懸浮細(xì)胞：離心收集后，倒除培養(yǎng)液，加入1mlTrizol反復(fù)吹打細(xì)胞，至溶液不黏稠。

貼壁細(xì)胞：倒除培養(yǎng)液，PBS洗滌一次后，直接在培養(yǎng)瓶或培養(yǎng)板中加入1mlTrizol反復(fù)吹打細(xì)胞，直至溶液不黏稠。室溫孵育混合液10min后，轉(zhuǎn)移至1.5mlEppendorf管裂解目前十二頁(yè)\總數(shù)五十二頁(yè)\編于十六點(diǎn)目前十三頁(yè)\總數(shù)五十二頁(yè)\編于十六點(diǎn)Trizol勻漿孵育后－80℃保存加入0.2ml氯仿，劇烈搖動(dòng)15s;3minatRT,12,000gx15min,4℃分層取水相，0.5mL異丙醇，顛倒混勻，10minatRT4℃，12,000gx10min（片狀沉淀物為RNA）沉淀去上清，1ml75％乙醇洗滌，7,500gx5minat4℃，重復(fù)一次洗滌空氣干燥，加50ulRNase-free水，55℃孵育溶解干燥溶解目前十四頁(yè)\總數(shù)五十二頁(yè)\編于十六點(diǎn)RNA提取優(yōu)化步驟（1）對(duì)得率較低的樣本，可在異丙醇沉淀一步，選用-20

度過(guò)夜孵育，以增加得率。（2）對(duì)多糖含量較高的樣本，可在異丙醇沉淀一步，加入

高鹽溶液（0.8M檸檬酸鈉和1.2MNaCl），-20度過(guò)

夜共孵育，以去除多糖物質(zhì)的污染。注意：所有試劑均需無(wú)酶水配制。目前十五頁(yè)\總數(shù)五十二頁(yè)\編于十六點(diǎn)RNA鑒定及初定量

（1）測(cè)量OD值——得率及純度檢測(cè)

得率

總RNA濃度（ug/ml）＝OD260×稀釋倍數(shù)×40ug/ml

（通常OD260數(shù)值介于0.15-1.0之間才可靠）

純度

OD260/280檢測(cè)RNA純度值在1.8-2.1之間，RNA純度較好；值小于1.8，表明蛋白雜質(zhì)較多；值大于2.2，表明RNA已降解；目前十六頁(yè)\總數(shù)五十二頁(yè)\編于十六點(diǎn)RNA鑒定及初定量

（2）瓊脂糖凝膠電泳——RNA完整性鑒定

1－3ulRNA溶液上樣，1％膠，100V電泳10min。完整RNA呈現(xiàn)明顯兩條帶28S，18S，且28S帶約為18S帶亮度的兩倍；有時(shí)也可見(jiàn)5S帶目前十七頁(yè)\總數(shù)五十二頁(yè)\編于十六點(diǎn)RNA鑒定及初定量ElectrophoresisgeloftheRNAsample目前十八頁(yè)\總數(shù)五十二頁(yè)\編于十六點(diǎn)小結(jié)－RNA的保護(hù)1.提取前

1.1新鮮樣品及液氮速凍

1.2提取工作區(qū)RNase的清除

1.3實(shí)驗(yàn)用品RNase的清除

2.提取中

2.1組織破碎過(guò)程中的保護(hù)

2.2細(xì)胞裂解過(guò)程中的保護(hù)

2.3實(shí)驗(yàn)人員保護(hù)措施

2.4保存過(guò)程中3.在后續(xù)的逆轉(zhuǎn)錄過(guò)程中仍需保持無(wú)酶環(huán)境目前十九頁(yè)\總數(shù)五十二頁(yè)\編于十六點(diǎn)第二部分RT-PCR逆轉(zhuǎn)錄PCRreversetranscriptionAAAAAAAAAA-3’TTTTTTTTTT-5’mRNA(sense)Antisenseprimers:oligo(dT)orrandomhexamersorGSP1ststrandcDNAAAAAAAAAAA-3’TTTTTTTTTT-5’PCRusingGSP+GSP1GSP1GSPGSP1(sense)GSP(antisense)1ststrandcDNA目前二十頁(yè)\總數(shù)五十二頁(yè)\編于十六點(diǎn)RT-PCR逆轉(zhuǎn)錄?選擇方法：

兩步法（適用于多目的基因）

一步法（適用于單一目的基因）目前二十一頁(yè)\總數(shù)五十二頁(yè)\編于十六點(diǎn)RNA逆轉(zhuǎn)錄

?選擇逆轉(zhuǎn)錄引物：

隨機(jī)引物（適用于低豐度RNA）

Oligo(dT)引物（適用于具有PolyA尾的RNA）

特異性引物（適用于一步法）

目前二十二頁(yè)\總數(shù)五十二頁(yè)\編于十六點(diǎn)RNA逆轉(zhuǎn)錄步驟（1）取1-5ugRNA樣本，65℃熱變性10min；（2）配制反應(yīng)體系，共20ul（以AMV為例）

10×buffer 2ul Mgcl2(25mM) 4ul dNTPs(10mM) 2ul RNaseinhibitor(1U/ul)0.5ul reversetranscriptase15U reverseprimer0.5ug RNAsample1-5ug RNase-freeWater加至20ul 一、逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)目前二十三頁(yè)\總數(shù)五十二頁(yè)\編于十六點(diǎn)RNA逆轉(zhuǎn)錄步驟（3）反應(yīng)體系42℃孵育60min。如使用隨機(jī)引物，先室溫孵育

10min后，再升溫至42℃。（4）72℃，5min失活酶，置冰進(jìn)行后續(xù)反應(yīng)或-20℃保存。cDNA第一鏈已合成，可低溫保存或繼續(xù)后續(xù)實(shí)驗(yàn)?zāi)壳岸捻?yè)\總數(shù)五十二頁(yè)\編于十六點(diǎn)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PolymeraseChainReaction)以母鏈DNA為模板，以特定引物為延伸起點(diǎn)，以反應(yīng)底物脫氧核糖核苷三磷酸(dNTPs)在DNA聚合酶催化下，通過(guò)變性、退火、延伸等步驟，體外復(fù)制出與母鏈模板DNA互補(bǔ)的子鏈DNA的過(guò)程。PCR的原理和反應(yīng)過(guò)程目前二十五頁(yè)\總數(shù)五十二頁(yè)\編于十六點(diǎn)RT-PCR逆轉(zhuǎn)錄PCRPCR反應(yīng)準(zhǔn)備工作：

?目的基因擴(kuò)增引物設(shè)計(jì)：NCBI中查詢靶基因的mRNA序列，無(wú)特

殊要求可選擇CDS序列作為引物設(shè)計(jì)區(qū)域。目前二十六頁(yè)\總數(shù)五十二頁(yè)\編于十六點(diǎn)RT-PCR逆轉(zhuǎn)錄PCR?mRNA序列查找（以EGFR為例） 目前二十七頁(yè)\總數(shù)五十二頁(yè)\編于十六點(diǎn)RT-PCR逆轉(zhuǎn)錄PCR…………目前二十八頁(yè)\總數(shù)五十二頁(yè)\編于十六點(diǎn)……………………目前二十九頁(yè)\總數(shù)五十二頁(yè)\編于十六點(diǎn)以BLAST驗(yàn)證引物目前三十頁(yè)\總數(shù)五十二頁(yè)\編于十六點(diǎn)RT-PCR逆轉(zhuǎn)錄PCRPCR反應(yīng)準(zhǔn)備工作：?選擇內(nèi)參：1.受不同實(shí)驗(yàn)處理因素時(shí)，表達(dá)恒定；

2.在體內(nèi)各種組織中表達(dá)恒定；

3.除實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)處理因素之外，能夠與目的基因一起受同等程度的非設(shè)計(jì)其它因素影響。

常用內(nèi)參基因名稱：β-actin、GAPDH、16Sr、18Sr

（Human、Rat、Mouse）目前三十一頁(yè)\總數(shù)五十二頁(yè)\編于十六點(diǎn)RT-PCR逆轉(zhuǎn)錄步驟二、PCR擴(kuò)增（示例）cDNA第一鏈 2ul10×PCRbuffer(K+)5ul25mMMgCl23ul(1.5mM)10mMdNTPs1ul(各200uM)50μM引物正向/反向各0.5ul(0.1~0.5uM)Taq酶 0.5ul(1~5U)雙蒸水38.5ul總反應(yīng)體積：50ulPCRmix包含：buffer（Mg2+）dNTPsTaq酶目前三十二頁(yè)\總數(shù)五十二頁(yè)\編于十六點(diǎn)RT-PCR逆轉(zhuǎn)錄步驟PCR反應(yīng)條件

95℃ 2min 95℃ 30sec 40-65℃ 10-120sec 22-35cycle 72℃ 60-120sec 72℃ 10min 12℃ ∞

退火溫度：引物的退火溫度一般要比估計(jì)的相應(yīng)熔點(diǎn)溫度Tm低5℃左右。兩條引物的退火溫度相差不應(yīng)超過(guò)4-6℃。特異性的改進(jìn)：提高退火溫度（比建議退火溫度提高2-5℃）；減少退火時(shí)間。過(guò)長(zhǎng)的退火時(shí)間在正常情況下并不能提高產(chǎn)量，只會(huì)增加非特異性引物雜交的可能性。目前三十三頁(yè)\總數(shù)五十二頁(yè)\編于十六點(diǎn)注意事項(xiàng)（1）每次PCR設(shè)立對(duì)照組和陰性對(duì)照組。（2）科學(xué)做法是將內(nèi)參引物加入目的基因的PCR擴(kuò)增 反應(yīng)體系中，同時(shí)擴(kuò)增作為對(duì)照。（3）將反應(yīng)體系中的相同試劑預(yù)先混合，再分裝成各反應(yīng)管。（4）設(shè)定合適的循環(huán)次數(shù)，PCR不能進(jìn)入平臺(tái)期。（5）在一定范圍內(nèi)調(diào)整Mg2+濃度、引物濃度、退火溫度，消除非特異性擴(kuò)增。目前三十四頁(yè)\總數(shù)五十二頁(yè)\編于十六點(diǎn)結(jié)果鑒定

瓊脂糖凝膠電泳分析結(jié)果：

2％瓊脂糖凝膠，取4-8ul產(chǎn)物上樣，60V電泳40min，紫外燈下觀察結(jié)果。采用凝膠圖像分析系統(tǒng)，對(duì)電泳條帶進(jìn)行密度掃描，測(cè)定灰度值。注意：灰度掃描時(shí)，選擇合適的膠空白區(qū)域作為扣除的背景灰度值。目前三十五頁(yè)\總數(shù)五十二頁(yè)\編于十六點(diǎn)基因表達(dá)的差異分析－相對(duì)定量各反應(yīng)體系以內(nèi)參基因?yàn)閰⒄?，?jì)算待測(cè)基因產(chǎn)物與其灰度比值，作為待測(cè)基因的表達(dá)值。即

待測(cè)基因產(chǎn)物電泳帶灰度值 內(nèi)參基因產(chǎn)物電泳帶灰度值

雙標(biāo)準(zhǔn)曲線法： 待測(cè)樣本基因相對(duì)表達(dá)量 參照樣本基因相對(duì)表達(dá)量＝待測(cè)基因相對(duì)表達(dá)量目前三十六頁(yè)\總數(shù)五十二頁(yè)\編于十六點(diǎn)結(jié)果示例

目前三十七頁(yè)\總數(shù)五十二頁(yè)\編于十六點(diǎn)結(jié)果示例目前三十八頁(yè)\總數(shù)五十二頁(yè)\編于十六點(diǎn)熒光定量PCR(Real-timePCR,qPCR)PCR+熒光探針/熒光染料①應(yīng)用廣泛：可用于DNA和RNA的PCR產(chǎn)物定量、基因表達(dá)研究、病原體檢測(cè)及PCR條件的優(yōu)化等。②可定量原理：經(jīng)激光激發(fā)后熒光量隨PCR循環(huán)而累積，從而達(dá)到定量目的。③無(wú)須凝膠電泳：只須反應(yīng)管內(nèi)直接檢測(cè)。④減少污染環(huán)節(jié)：全封閉反應(yīng)管。⑤結(jié)果重現(xiàn)性好：定量動(dòng)態(tài)范圍高達(dá)五個(gè)數(shù)量級(jí)。目前三十九頁(yè)\總數(shù)五十二頁(yè)\編于十六點(diǎn)Log[DNA]循環(huán)數(shù)線性增長(zhǎng)期Linear平臺(tái)期Plateauy=x(1+e)n指數(shù)增長(zhǎng)期Geometric目前四十頁(yè)\總數(shù)五十二頁(yè)\編于十六點(diǎn)Real-timePCR相同模板進(jìn)行96次擴(kuò)增的擴(kuò)增曲線圖起始拷貝數(shù)越高，Ct值越??；起始拷貝數(shù)越低，Ct值越大目前四十一頁(yè)\總數(shù)五十二頁(yè)\編于十六點(diǎn)與DNA結(jié)合時(shí)發(fā)光游離時(shí)不發(fā)光

一種DNA小溝結(jié)合染料1．SYBRGreenI熒光染料目前四十二頁(yè)\總數(shù)五十二頁(yè)\編于十六點(diǎn)

在PCR過(guò)程中染料與DNA結(jié)合發(fā)光聚合完成聚合開(kāi)始SYBRGreenI目前四十三頁(yè)\總數(shù)五十二頁(yè)\編于十六點(diǎn)每形成一個(gè)DNA雙鏈，就有一定數(shù)量的染料結(jié)合上去染料一結(jié)合，就產(chǎn)生熒光信號(hào)信號(hào)強(qiáng)度與DNA分子總數(shù)目成正比數(shù)量關(guān)系目前四十四頁(yè)\總數(shù)五十二頁(yè)\編于十六點(diǎn)一條探針，兩條引物引物位于探針的兩邊一條探針，兩個(gè)基團(tuán)前邊是報(bào)告基團(tuán)，后邊是淬滅基團(tuán)

3'5'RQ3'3'5'5'3'5'5'２．TaqMan探針/水解探針目前四十五頁(yè)\總數(shù)五十二頁(yè)\編于十六點(diǎn)每產(chǎn)生一條DNA鏈，就切斷一條探針每切斷一條探針，就產(chǎn)生一個(gè)單位信號(hào)信號(hào)強(qiáng)度與結(jié)合探針的DNA分子數(shù)成正比數(shù)量關(guān)系5’TaqMan探針上游引物3’3’5’下游引物RQ3’5’3’5’QR目前四十六頁(yè)\總數(shù)五十二頁(yè)\編于十六點(diǎn)Real-timePCR反應(yīng)體系cDNA第一鏈 2ul10μM引物正向/反向各1ul(0.1~0.5uM)2×SYBRGreenqPCRMix10ul雙蒸水7ul

總體積20ulSYBRGreenqPCRMix包含：SYBRGreen、buffer（Mg2+）、

dNTPs、Taq酶目前四十七頁(yè)\總數(shù)五十二頁(yè)\編于十六點(diǎn)Real-timePCR的定量方式絕對(duì)定量：通過(guò)定量標(biāo)準(zhǔn)曲線來(lái)確定起始模板的拷貝數(shù)；相對(duì)定量：用來(lái)確定經(jīng)過(guò)不同處理的樣品目標(biāo)轉(zhuǎn)錄本之間的表達(dá)差異或是目標(biāo)轉(zhuǎn)錄本在不同時(shí)相的表達(dá)差異。結(jié)果分析△△Ct法：目的基因與管家基因（內(nèi)參）擴(kuò)增效率相同或接近一致時(shí)，采用此法。目前四十八頁(yè)\總數(shù)五十二頁(yè)\編于十六點(diǎn)△△Ct法舉例：測(cè)定X基因在某因子作用前后的表達(dá)變化內(nèi)參基因：GAPDH;實(shí)驗(yàn)分實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組X基因Ct值（平均值）GAPDHCt值（平均值）△Ct△△Ct2－△△Ct對(duì)照組27.3516.9810.3701實(shí)驗(yàn)組127.5216.8610.660