衛(wèi)健委臨檢中心 儲(chǔ)迅濤-感染性疾病的確認(rèn)試驗(yàn)

感染性疾病血清學(xué)檢驗(yàn)的確認(rèn)試驗(yàn)儲(chǔ)迅濤

博士為什么要做確認(rèn)試驗(yàn)免疫測(cè)定結(jié)果可能出現(xiàn)假陽(yáng)性在感染性疾病血清學(xué)檢驗(yàn)常用的定性ELISA試驗(yàn)中，測(cè)定樣本的A值≥Cut-off（反應(yīng)性），但樣本中可能并不存在病原體的特異性抗體或抗原通過(guò)確認(rèn)試驗(yàn)證實(shí)樣本中存在病原體的特異性抗體或抗原，才可報(bào)告結(jié)果為陽(yáng)性導(dǎo)致假陽(yáng)性的因素陽(yáng)性判斷值（Cut-off）的設(shè)定內(nèi)源性干擾外源性干擾試劑質(zhì)量和實(shí)驗(yàn)操作的不精密度灰區(qū)（GREYZONE）在免疫測(cè)定中，按Cut-off確定結(jié)果為陽(yáng)性或陰性時(shí)，有一個(gè)可能出現(xiàn)假陽(yáng)性或假陰性的范圍。這個(gè)范圍與試劑的質(zhì)量有關(guān)，應(yīng)由試劑生產(chǎn)單位在確定Cut-off值時(shí)確定，需要時(shí)在說(shuō)明書(shū)中注出。灰區(qū)的確定陰性Cut-off和陽(yáng)性Cut-off之間的區(qū)域陰性標(biāo)本5000份均值0.06

標(biāo)準(zhǔn)差0.019Cut-off0.11(99.5%可信限陽(yáng)性標(biāo)本2000份均值1.50

標(biāo)準(zhǔn)差0.628Cut-off0.08(99.5%可信限ELISA測(cè)定的“灰區(qū)確定”內(nèi)源性因素補(bǔ)體高濃度的非特異性免疫球蛋白嗜異性抗體某些自身抗體外源性因素標(biāo)本溶血：血紅素基團(tuán)有類(lèi)似過(guò)氧化物的活性標(biāo)本污染：細(xì)菌的內(nèi)源性酶會(huì)產(chǎn)生非特異性干擾標(biāo)本貯存時(shí)間過(guò)長(zhǎng)：標(biāo)本在2~8℃下保存時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，IgG可聚合成多聚體，在間接法ELISA測(cè)定中會(huì)導(dǎo)致本底過(guò)深，甚至造成假陽(yáng)性標(biāo)本凝固不全：血液通常30分鐘開(kāi)始凝固，18~24小時(shí)完全凝固，日常檢驗(yàn)時(shí)血液還沒(méi)有完全凝固就分離血清，此時(shí)分離出的血清中殘留部分纖維蛋白原，檢測(cè)結(jié)果易造成假陽(yáng)性試劑盒原材料的純度、組合、來(lái)源等也會(huì)造成結(jié)果的假陽(yáng)性或假陰性其它因素測(cè)定方法的不精密度實(shí)驗(yàn)操作、樣本采集、樣本前處理、試劑質(zhì)量等諸多因素人類(lèi)免疫缺陷病毒(HIV)抗體的確認(rèn)常用的HIV抗體篩查方法酶免疫測(cè)定（ELISA）明膠顆粒凝集試驗(yàn)（PA）金(硒)標(biāo)記快速免疫測(cè)定化學(xué)發(fā)光免疫測(cè)定HIV抗體篩查方法存在的問(wèn)題在窗口期抗-HIV不能被檢測(cè)到

(1-3月)在窗口期有“假陰性”結(jié)果假陽(yáng)性有66種可能:肝病、輸血制品等錯(cuò)誤的實(shí)驗(yàn)室操作試劑質(zhì)量的問(wèn)題HIV抗體的確認(rèn)方法蛋白印跡試驗(yàn)（WB）免疫熒光抗體測(cè)定（IFA）免疫熒光抗體測(cè)定（IFA）在包被了HIV抗原的玻片上加上血清孵育后，沖洗玻片，移去剩余血清在玻片上加上抗人熒光抗體孵育后,在顯微鏡下觀查熒光反應(yīng)當(dāng)抗人熒光結(jié)合物加入后，HIV感染細(xì)胞可顯示HIV熒光抗原優(yōu)點(diǎn)：沒(méi)有不確定的結(jié)果，在室內(nèi)90分鐘內(nèi)可完成HIV檢測(cè)蛋白印跡試驗(yàn)（WB）最常用的HIV抗體確認(rèn)方法ELISA陽(yáng)性僅提示HIV抗體存在的可能性蛋白印跡試驗(yàn)通過(guò)在膜上的抗原直接識(shí)別HIV抗體缺陷：?

工作強(qiáng)度高,需運(yùn)行較長(zhǎng)時(shí)間?

判斷標(biāo)準(zhǔn)沒(méi)有標(biāo)準(zhǔn)化?

與ELISA相比蛋白印跡法特異性高但敏感性低?

因窗口期、晚期或抗體交叉反應(yīng)等原因，可造成蛋白印跡法的判斷不確定蛋白印跡試劑的制備HIV病毒裂解及蛋白抗原的純化SDS垂直凝膠電泳轉(zhuǎn)移

(凝膠到硝酸纖維素膜)加樣切割蛋白印跡試驗(yàn)的原理洗洗加酶結(jié)合物(Ab-HRP)加樣加底物MP公司HIVBLOT2.2的特點(diǎn)HIV-1病毒裂解蛋白：可檢測(cè)所有HIV-1亞型，提供完整的HIV免疫指紋，可用于不同疾病階段

(早期、發(fā)展期、晚期)的檢測(cè)HIV-2多肽條帶：提示有感染HIV-2的可能，需要進(jìn)行HIV-2檢測(cè)內(nèi)對(duì)照：易區(qū)分實(shí)驗(yàn)操作錯(cuò)誤可選快速或過(guò)夜檢測(cè)方法：可選適用于實(shí)驗(yàn)室計(jì)劃的試驗(yàn)方法保存期長(zhǎng)：結(jié)果可用于存檔可與AutoBlotSystem20配合使用，實(shí)現(xiàn)自動(dòng)化操作HIVBLOT2.2結(jié)果的判斷GAGENVPOLGAG抗體前體-p55：p24+p17+LMW(9kd+5kd)片段：

p39+p42；p32聚合物：分子量p100至

p170p24–核心相關(guān)蛋白：?

常是第一個(gè)被檢測(cè)到的標(biāo)志?

特異性不高?

在疾病進(jìn)程中抗體水平會(huì)降低p17–基質(zhì)相關(guān)蛋白：?

診斷價(jià)值非常低?

特異性非常低包膜（ENVelope)抗體gp160-gp41的四聚體:?

比單體濃度更高,與gp41的比例為

4:1?

常是第一個(gè)被檢測(cè)到的標(biāo)志?

整個(gè)疾病過(guò)程都可被檢測(cè)到?

與HIV-2有些交叉反應(yīng)gp120–外膜蛋白+gp41的三聚體

：?

比gp160濃度低?

如伴有g(shù)p160陽(yáng)性非常有意義?

如缺乏gp160則不能判斷為gp120gp41–穿膜蛋白：?

最不敏感的ENV標(biāo)志?

整個(gè)疾病過(guò)程都可被檢測(cè)到?

與HIV-2無(wú)交叉反應(yīng),但常與HIV-1的O亞型族有反應(yīng)?

p40帶可在此區(qū)域呈現(xiàn)（非HIV條帶）聚合酶（POLymerase)抗體逆轉(zhuǎn)錄酶

-p66和

p51：?

一般認(rèn)為p66比p51有更多的免疫活性?

通常在檢測(cè)到ENV和GAG30天到60天后可檢測(cè)到p66?

p66與HIV-2有高交叉反應(yīng)?

在疾病的進(jìn)程中p66抗體水平會(huì)減少?

p51抗體標(biāo)志很少有或無(wú)診斷價(jià)值內(nèi)源性核酸酶

-p31：?

當(dāng)p66抗體陽(yáng)性時(shí)，p31常被檢測(cè)到?

在疾病的進(jìn)程中p31抗體水平會(huì)減少?

會(huì)與GAG片段p32混淆蛋白印跡試驗(yàn)陽(yáng)性的判斷標(biāo)準(zhǔn)CDC/ASTPHLD或

或:

gp41

gp120/gp160

p24二條帶US廠商(

FDA)p24和p31和gp41或gp120/gp160之一SFTS法國(guó)二條ENV

(gp160

and

gp120)伴有GAG或POL(Unequivocal

POS)(Probably

POS)(Probably

POS)WH

OEnv

(gp160)

GAG(

p24)和二條

ENV帶僅為(gp160和gp120)二條

ENV帶有或無(wú)GAG

POL或CRSS一條

p24或p31帶和一條

帶ENV泛美健康組織美國(guó)紅十字(

USA)

GAG和POL和ENV各一條帶Paul

Ehrlich

Institut

(德

二條帶其中一條必須是

ENV國(guó))蛋白印跡試驗(yàn)陰性的判斷標(biāo)準(zhǔn)CDC/

ASTPHLD無(wú)條帶無(wú)條帶US廠商

(

FDA)p17伴有或無(wú)p39,

p42,

p55檢測(cè)到非病毒特異條帶無(wú)條帶SFTS法國(guó)任何非不確定或非陽(yáng)性的條帶僅

p17WH

O無(wú)條帶CRSS

/

PAHO無(wú)條帶美國(guó)紅十字無(wú)條帶Paul

Ehrlich

Institut無(wú)

HIV-1特異條帶蛋白印跡試驗(yàn)結(jié)果為不確定的情況出現(xiàn)HIV-1特異性條帶但帶型不足以確認(rèn)陽(yáng)性的情況，可判為“不確定”每三個(gè)月隨訪一次，共兩次，仍屬可疑，可判為陰性HIV抗體的確認(rèn)程序免疫印跡法(HIV1/2混合型)出現(xiàn)HIV-2指帶HIV-1陽(yáng)性反應(yīng)可疑反應(yīng)陰性反應(yīng)陰性報(bào)告免疫印跡法（HIV-2）HIV-1陽(yáng)性報(bào)告陽(yáng)性反應(yīng)陰性反應(yīng)可疑反應(yīng)報(bào)告HIV-2血清學(xué)陽(yáng)性反應(yīng)報(bào)告必要時(shí)測(cè)核酸陰性報(bào)告每3個(gè)月隨訪一次，共2次，仍屬可疑，則作陰性報(bào)告，如隨訪期間出現(xiàn)陽(yáng)性反應(yīng)，則報(bào)告陽(yáng)性丙型肝炎病毒(HCV)抗體的確認(rèn)常用的HCV抗體篩查方法酶免疫測(cè)定（ELISA）凝集試驗(yàn)金(硒)標(biāo)記快速免疫測(cè)定化學(xué)發(fā)光免疫測(cè)定HCV抗體篩查方法存在的問(wèn)題在窗口期抗-HCV

不能被檢測(cè)到

(平均70多天)在窗口期有“假陰性”結(jié)果假陽(yáng)性:Ortho試劑在S/CO值≥3.8時(shí)才有95%以上的真陽(yáng)性率，S/CO＜3.8者則有較高的假陽(yáng)性。國(guó)產(chǎn)試劑假陽(yáng)性的情況更為嚴(yán)重錯(cuò)誤的實(shí)驗(yàn)室操作試劑質(zhì)量的問(wèn)題HCV抗體的確認(rèn)方法重組免疫印跡試驗(yàn)（RIBA）：直接利用基因重組技術(shù)和包被技術(shù)將HCV的不同重組抗原片斷分條加在固相膜上蛋白印跡試驗(yàn)（WB）：將HCV的重組蛋白抗原通過(guò)電泳分離后再轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上免疫斑點(diǎn)試驗(yàn)：封閉系統(tǒng)（雅培公司的Matrix）MP公司HCVBLOT3.0的特點(diǎn)抗原：5種源于HCV主要免疫優(yōu)勢(shì)區(qū)的重組抗原，包括核抗原(Core)、NS3-1、NS3-2、NS4和NS5樣本需要量少：

檢測(cè)只需20μl樣本簡(jiǎn)便快速：每個(gè)樣本的檢測(cè)時(shí)間為3小時(shí)結(jié)果分析簡(jiǎn)單：

1+和3+質(zhì)控帶降低了分析錯(cuò)誤的可能性GST質(zhì)控帶：

HCV抗原的表達(dá)系統(tǒng)為谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)錄酶(GST)。GST質(zhì)控出現(xiàn)表示樣本與GST反應(yīng)，從而排除因此造成的假陽(yáng)性1+/3+質(zhì)控帶：加樣本/試劑及操作的質(zhì)控，同時(shí)又是判斷反應(yīng)強(qiáng)度的參照可與AutoBlotSystem20配合使用，實(shí)現(xiàn)自動(dòng)化操作HCVBLOT3.0結(jié)果的判斷確定1+和3+質(zhì)控帶的位置3+質(zhì)控帶

(血清加樣)核抗原帶將任何顯現(xiàn)的條帶與這二條質(zhì)控帶做強(qiáng)度（反應(yīng)度）對(duì)照NS3-1NS3-2NS4給每條條帶的反應(yīng)度作判讀NS5GST質(zhì)控帶1+質(zhì)控帶(試劑加樣)最后作結(jié)果分析HCVBLOT3.0條帶反應(yīng)度判讀反應(yīng)度1.無(wú)反應(yīng)度呈現(xiàn)判讀-2.反應(yīng)度

<1+質(zhì)控帶3.反應(yīng)度

=1+質(zhì)控帶4.反應(yīng)度

>1+但<3+質(zhì)控帶5.反應(yīng)度

=3+質(zhì)控帶6.反應(yīng)度

>3+質(zhì)控帶+/-1+2+3+4+HCVBLOT3.0結(jié)果分析膜條呈現(xiàn)結(jié)果分析陰性所有條帶出現(xiàn)<1+反應(yīng)度2條或更多HCV條帶呈>1+反應(yīng)度，或核抗原帶呈>2+反應(yīng)度陽(yáng)性僅一條HCV條帶呈1+以上反應(yīng)度，或僅核抗原條帶呈1+以上，但2+以下反不確定應(yīng)度*僅有GST帶反應(yīng)可判為陰性GST質(zhì)控帶反應(yīng)度為1+或以上，加上1條或更多HCV條帶呈1+反應(yīng)度可讀成不確定。HCVBLOT3.0的靈敏度（一）樣本組成（共計(jì)360份參比品，購(gòu)自BBI）:?

330個(gè)HCV陽(yáng)性樣本?

3個(gè)HCVRNA1型樣本?

1個(gè)HCVRNA2型樣本?

3個(gè)HCVRNA3型樣本?

1套

HCV基因型測(cè)試參比品–含源于世界不同區(qū)域的9個(gè)基因型?

1套含源于世界不同區(qū)域的HCV陽(yáng)性樣本參比品TrueHCVstatus+-HCV

+Blot3580敏感度>99.7%3.0-11這是個(gè)稀釋HCV樣本,其他兩種同類(lèi)產(chǎn)品也一樣和它沒(méi)產(chǎn)生反應(yīng)。HCVBLOT3.0的靈敏度（二）PanelNameKit

withEarliestdetectionof

“Positive”S/N1st2nd3rd123456789PHV901PHV908PHV911PHV918PHV919PHV920PHV906PHV907PHV910All

thesame11組包括HCV基因型1a,1b和2b的血清轉(zhuǎn)換型參比品，購(gòu)自于美國(guó)BBIOrtho1WellcozymeWellcozymeWellcozymeWellcozymeOrtho1MPBMPB

&Ortho1Ortho1MPBMPB

&Ortho1WellcozymeOrtho1MPBMPBOrtho13組

HCV血清轉(zhuǎn)換型參比品，購(gòu)自于美國(guó)SerologicalsInc.WellcozymeWellcozymeMPBWellcozymeMPBMPD

&Ortho110

PHV91411

PHV91712

#481213

#4813OrthoWellcozymeAll

thesameAll

thesame(Ortho2)Ortho2MPB

&

WellcozymeMPB

&

Wellcozyme14

#4814N.A.12OrthoRIBA3.0OrthoRIBA2.0

(data

sheet

notavailable,resultsfrom

internalcompilation)HCVBLOT3.0的靈敏度（三）BBIPHV103低滴度參比品(含14個(gè)陽(yáng)性和1個(gè)陰性樣本)：與OrthoRiba3.0的靈敏度不分上下BBIPHV105低滴度參比品(含14個(gè)陽(yáng)性和1個(gè)陰性樣本)：靈敏度優(yōu)于OrthoRiba3.0,多檢出5個(gè)陽(yáng)性樣本HCVBLOT3.0的特異性200份正常獻(xiàn)血員的血漿220份臨床樣本

(孕婦、住院病人、門(mén)診、不同疾病)60份具干擾性的樣本(高血脂、黃疸、溶血癥等)核抗原帶與肝素有交叉反應(yīng)，應(yīng)避免使用肝素作為抗凝劑特異性

>99.9%HCV抗體檢測(cè)與結(jié)果報(bào)告流程圖（美國(guó)CDC）報(bào)告陰性抗-HCV篩查檢測(cè)陰性根據(jù)S/CO比值分組的陽(yáng)性或所有陽(yáng)性高S/CO比值低S/CO比值或報(bào)告陽(yáng)性抗-HCVRIBA確證試驗(yàn)HCVRNA核酸擴(kuò)增試驗(yàn)陰性陽(yáng)性陽(yáng)性報(bào)告陽(yáng)性陰性報(bào)告陰性可疑報(bào)告可疑報(bào)告陽(yáng)性抗-HCVRIBA確證試驗(yàn)陽(yáng)性報(bào)告陽(yáng)性陰性報(bào)告陰性可疑報(bào)告可疑梅毒抗體的確認(rèn)梅毒的免疫性感染梅毒后，首先產(chǎn)生IgM型抗梅毒螺旋體抗體，感染2周后即可測(cè)出，早期梅毒抗梅治療3～9個(gè)月后或晚期梅毒治療2年后，大部分病人IgM可轉(zhuǎn)陰性，再感染時(shí)又出現(xiàn)陽(yáng)性，故IgM型抗體的存在是活動(dòng)性梅毒的表現(xiàn)感染梅毒4周左右產(chǎn)生IgG型抗梅毒螺旋體抗體，即使經(jīng)足量抗梅治療，梅毒螺旋體抗原消失后很長(zhǎng)時(shí)間，IgG抗體仍可通過(guò)記憶細(xì)胞的作用繼續(xù)產(chǎn)生，甚至終生在血清中可測(cè)出另一種具有抗體性質(zhì)的物質(zhì)叫反應(yīng)素（reagin），是梅毒螺旋體破壞人體組織過(guò)程中釋放出的一種抗原性心磷脂刺激機(jī)體所產(chǎn)生的抗體。反應(yīng)素一般在感染后5～7周（或下疳出現(xiàn)后2～3周）產(chǎn)生。經(jīng)正規(guī)治療后可逐漸消失篩查方法

——

非特異性梅毒血清學(xué)試驗(yàn)是以心磷脂、卵磷脂及膽固醇作為抗原檢查血清中的反應(yīng)素，用于初篩試驗(yàn)及療效觀察?？梢苑譃橐韵滤姆N試驗(yàn)：性病研究實(shí)驗(yàn)室玻片試驗(yàn)(VDRL)：試劑需現(xiàn)配現(xiàn)用，且要在顯微鏡下觀察結(jié)果，故國(guó)內(nèi)實(shí)驗(yàn)室很少采用。但VDRL是診斷神經(jīng)性梅毒最特異的血清學(xué)方法不加熱血清反應(yīng)素試驗(yàn)(USR)：試劑無(wú)需現(xiàn)配現(xiàn)用，但仍要在顯微鏡下觀察結(jié)果，現(xiàn)已很少使用快速血漿反應(yīng)素環(huán)狀卡片試驗(yàn)

(RPR)：在特制的紙片上進(jìn)行，加入一定量特制的炭粉，可使抗原抗體出現(xiàn)凝集，用肉眼可觀察結(jié)果甲苯胺紅不加熱血清試驗(yàn)(TRUST)：在試劑中以紅色的甲苯胺紅顆粒代替黑色的炭粉顆粒，使結(jié)果更易于觀察非特異性梅毒血清學(xué)試驗(yàn)的缺陷特異性：在多種疾病，如急性病毒性感染、自身免疫性疾病、結(jié)締組織病、腫瘤、靜脈吸毒者、老年人以及懷孕婦女中均可出現(xiàn)反應(yīng)素，所以此類(lèi)試驗(yàn)有時(shí)會(huì)出現(xiàn)假陽(yáng)性反應(yīng)敏感性：感染梅毒后反應(yīng)素的出現(xiàn)時(shí)間晚于特異性梅毒螺旋體抗體，因此非梅毒螺旋體抗原血清試驗(yàn)對(duì)一期梅毒的漏檢率較高。RPR或TRUST有時(shí)出現(xiàn)弱陽(yáng)性或陰性結(jié)果，而臨床上又像二期梅毒，此時(shí)應(yīng)將此血清稀釋后做定量試驗(yàn)，如出現(xiàn)陽(yáng)性結(jié)果，則為抗體過(guò)量引起的“鉤狀效應(yīng)”，1~2％的二期梅毒病人可出現(xiàn)此現(xiàn)象而發(fā)生假陰性反應(yīng)。此外，晚期梅毒反應(yīng)素轉(zhuǎn)陰率高，再加上這類(lèi)試驗(yàn)對(duì)隱性梅毒也不太敏感，因此用此類(lèi)試驗(yàn)進(jìn)行梅毒篩查時(shí)，存在著相當(dāng)數(shù)量的漏檢篩查方法

——

特異性梅毒血清學(xué)試驗(yàn)用梅毒螺旋體作為抗原檢測(cè)血清中的抗螺旋體IgM和/或IgG抗體，其敏感性和特異性均高于非梅毒螺旋體抗原血清試驗(yàn)，但由于測(cè)定的多為總抗體，故不能用作療效觀察的指標(biāo)。常用的有以下方法：熒光抗體吸收試驗(yàn)(FTA-ABS)：特異性抗體檢測(cè)的“金標(biāo)準(zhǔn)”方法，但對(duì)人員、設(shè)備的要求高，且標(biāo)準(zhǔn)化困難，難以在臨床實(shí)驗(yàn)室常規(guī)使用血球凝集試驗(yàn)(TPHA)：該方法比FTA-ABS易操作且穩(wěn)定性好，對(duì)大樣本進(jìn)行批量檢測(cè)時(shí)，TPHA也比FTA-ABS易操作。但由于紅細(xì)胞具有生物活性，可能產(chǎn)生非特異性凝集，且保存時(shí)間較短，批間差較大，實(shí)際使用中也存在一些問(wèn)題明膠顆粒凝集試驗(yàn)(TPPA)：用人工合成的明膠顆粒代替紅細(xì)胞作為載體，克服了TPHA由于使用天然紅細(xì)胞而產(chǎn)生的問(wèn)題。其特異性較高，常被用作梅毒抗體的確認(rèn)方法酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)：適合于對(duì)大量樣品的篩查且可實(shí)現(xiàn)操作的自動(dòng)化、客觀化。但ELISA試劑盒品牌眾多，各家采用的抗原和工藝不同，使敏感性和特異性產(chǎn)生較大的差異快速診斷試驗(yàn)(TP-RT)：敏感性和特異性稍遜，可用于緊急場(chǎng)合確認(rèn)方法

——

免疫印跡試驗(yàn)梅毒的免疫印跡試驗(yàn)（Westernblot）與作為HIV抗體確認(rèn)的免疫印跡試驗(yàn)采用相同的原理和技術(shù)既可檢測(cè)IgG抗體，也可檢測(cè)IgM抗體檢測(cè)特異性的梅毒抗體條帶，其分子量分別為15.5、17、45.5和47kd梅毒免疫印跡試驗(yàn)的敏感性和特異性均可達(dá)到與TPPA或FTA-ABS媲美的水平已有商品化的試劑盒供應(yīng)，但價(jià)格高昂，作為一種確認(rèn)方法并未在臨床上被廣泛采用，目前仍主要用于科研領(lǐng)域梅毒螺旋體抗體免疫印跡試驗(yàn)（IgG）梅毒血清學(xué)試驗(yàn)檢測(cè)程序的探討（一）先以非梅毒螺旋體抗原血清試驗(yàn)（RPR、TRUST等）進(jìn)行初篩，再以梅毒螺旋體抗原血清試驗(yàn)（TPPA、TPHA、ELISA等）進(jìn)行確認(rèn)優(yōu)點(diǎn)：非梅毒螺旋體抗原血清試驗(yàn)價(jià)格低廉，使梅毒檢測(cè)的成本可以保持在低水平缺點(diǎn)：非梅毒螺旋體抗原血清試驗(yàn)的敏感性較差，導(dǎo)致臨床上易出現(xiàn)漏檢的情況同時(shí)進(jìn)行梅毒螺旋體抗原血清試驗(yàn)和非梅毒螺旋體抗原血清試驗(yàn)優(yōu)點(diǎn)：這是從技術(shù)上而言的最佳方案缺點(diǎn)：人力和試劑成本較高先進(jìn)行梅毒螺旋體抗原血清試驗(yàn)，陽(yáng)性時(shí)再進(jìn)行非梅毒螺旋體抗原血清試驗(yàn)梅毒血清學(xué)試驗(yàn)檢測(cè)程序的探討（二）特異性梅毒血清學(xué)試驗(yàn)（TPPA等）（+）（-）非特異性梅毒血清學(xué)試驗(yàn)（RPR等）陰性報(bào)告（+）（-）現(xiàn)癥梅毒詢問(wèn)梅毒既往感染和治療史（有）（無(wú)）抗梅治療，療效觀察既往感染隨訪或抗梅治療乙型肝炎病毒表面抗原（HBsAg）的確認(rèn)常用的HBsAg篩查方法酶免疫測(cè)定（ELISA）放射免疫測(cè)定熒光免疫測(cè)定化學(xué)發(fā)光免疫測(cè)定金標(biāo)記快速免疫測(cè)定HBsAg測(cè)定中的問(wèn)題敏感性：據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，到目前為止在獻(xiàn)血員中所發(fā)現(xiàn)的HBsAg

攜帶者最低含量為0.2

ng/ml。

國(guó)產(chǎn)ELISA試劑的敏感性水平多為0.5ng/ml左右，對(duì)極低含量的HBsAg攜帶者可能出現(xiàn)漏檢或“灰區(qū)現(xiàn)象”鉤狀效應(yīng)：血液中HBsAg含量最高可達(dá)2000000ng/ml，而HBsAg

各

種

檢

測(cè)

方

法

的

線

性

檢

測(cè)

范

圍

上

限

均

不

超

過(guò)50ng/ml，測(cè)定中有可能出現(xiàn)鉤狀效應(yīng)（前帶現(xiàn)象）定量測(cè)定：HBsAg在乙肝患者血循環(huán)中以三種形式存在，即圓形顆粒、管形顆粒和Dane顆粒。其中只有Dane顆粒中存在乙肝病毒，但其僅占所有HBsAg的0.2%，其它絕大部分為空的圓形顆粒和管形顆粒，所以HBsAg和乙肝病毒之間缺乏正相關(guān)。HBsAg的定量測(cè)定沒(méi)有臨床意義特異性：目前的各種檢測(cè)方法均有出現(xiàn)假陽(yáng)性結(jié)果的可能性，這種情況在弱反應(yīng)性的標(biāo)本中更為常見(jiàn)。因此，有必要對(duì)HBsAg測(cè)定呈現(xiàn)有反應(yīng)性（特別是弱反應(yīng)性）的標(biāo)本進(jìn)一步進(jìn)行確認(rèn)試驗(yàn)HBsAg測(cè)定結(jié)果的解釋?zhuān)▏?guó)外試劑盒）AbbottMurex(ELISA)樣本A值

＜Cut-off(陽(yáng)性判斷值)非反應(yīng)性

(non-reactive)陰性結(jié)果

(negativeresult)樣本A值

≥

Cut-off(陽(yáng)性判斷值)(初檢)反應(yīng)性

(reactive)雙份復(fù)檢結(jié)果:雙份復(fù)檢1.

反應(yīng)性反應(yīng)性重復(fù)反應(yīng)性確認(rèn)試驗(yàn)2.

非反應(yīng)性

反應(yīng)性3.

非反應(yīng)性

非反應(yīng)性重復(fù)非反應(yīng)性(陰性結(jié)果)HBsAg測(cè)定結(jié)果的解釋?zhuān)▏?guó)外試劑盒）BeckmannCoulterAccess(化學(xué)發(fā)光免疫測(cè)定)結(jié)果報(bào)告

S/CO=Cut-off比率S/CO≤1.0

非反應(yīng)性

(陰性結(jié)果)S/CO＞1.0

反應(yīng)性雙份復(fù)檢S/CO0.9~1.0

灰區(qū)雙份復(fù)檢結(jié)果:1.

反應(yīng)性

反應(yīng)性2.

非反應(yīng)性

反應(yīng)性3.

非反應(yīng)性

非反應(yīng)性重復(fù)反應(yīng)性確認(rèn)試驗(yàn)重復(fù)非反應(yīng)性(陰性結(jié)果)注:如果復(fù)檢時(shí)的結(jié)果為灰區(qū),視作非反應(yīng)性HBsAg測(cè)定結(jié)果的解釋?zhuān)▏?guó)產(chǎn)試劑盒）國(guó)產(chǎn)ELISA試劑Cut-off：陰性對(duì)照A值×0.21樣本A值

≥

Cut-off

HBsAg陽(yáng)性樣本A值

＜

Cut-off

HBsAg陰性在說(shuō)明書(shū)中沒(méi)有說(shuō)明有灰區(qū)，沒(méi)有說(shuō)明需復(fù)檢，也沒(méi)有說(shuō)明需確認(rèn)國(guó)產(chǎn)試劑測(cè)定HBsAg結(jié)果的“臨界范圍”國(guó)產(chǎn)HBsAgELISA試劑通過(guò)批批檢的精密度要求為CV＜15%。但由于運(yùn)輸和保存條件及測(cè)定操作等因素，實(shí)驗(yàn)室HBsAg測(cè)定結(jié)果的批間CV一般為25%左右。因此出現(xiàn)假陽(yáng)性或假陰性的范圍比試劑的“灰區(qū)”更大，稱(chēng)之謂“臨界范圍”上海地區(qū)提出臨界范圍為：0.7×Cut-off＜

樣本A值＜

2.1×Cut-off建議結(jié)果在臨界范圍內(nèi)的樣本進(jìn)行復(fù)檢為什么國(guó)內(nèi)不做HBsAg確認(rèn)試驗(yàn)進(jìn)口確認(rèn)試劑太貴沒(méi)有國(guó)產(chǎn)確認(rèn)試劑HBsAg陽(yáng)性樣本太多HBsAg弱反應(yīng)性樣本應(yīng)做確認(rèn)試驗(yàn)李金明，感染性疾病血清學(xué)檢驗(yàn)中應(yīng)重視對(duì)弱反應(yīng)性標(biāo)本的確認(rèn).

中華檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志，2006,29(7):577-580

(述評(píng))“由于確認(rèn)試劑目前絕大部分只能依賴(lài)進(jìn)口，價(jià)格昂貴，因此可考慮只對(duì)較弱反應(yīng)性的標(biāo)本進(jìn)行確認(rèn)。”“至于弱反應(yīng)性的判斷標(biāo)準(zhǔn)，則有必要通過(guò)一系列的嚴(yán)謹(jǐn)?shù)亩嘀行难芯縼?lái)確定，在這種多中心研究結(jié)果還沒(méi)有之前，在臨床上，則可具體情況具體分析。如果一個(gè)陽(yáng)性結(jié)果對(duì)特定的被檢者會(huì)產(chǎn)生重大影響如升學(xué)、招工等的情況，則不管初篩為何種反應(yīng)性，建議進(jìn)行確認(rèn)試驗(yàn)?！盚BsAg弱反應(yīng)性樣本應(yīng)做確認(rèn)試驗(yàn)（文獻(xiàn)）O’BrienJ.HepatitisBsurfaceantigen:decreasedneedforconfirmationofreactiveresults.ClinicalChemistry,2000,46:582DufourR.Surfaceantigen(HBsAg)assays—Aretheygoodenoughfortheircurrentuses?ClinicalChemistry,2006,52(8):1457?！盋henD.andKaplanL.A.PerformanceofanewgenerationchemiluminescentassayforhepatitisBsurfaceantigen.ClinicalChemistry,2006,52(8):1592國(guó)產(chǎn)HBsAg確認(rèn)試劑盒的研發(fā)方筠等，乙型肝炎病毒表面抗原確認(rèn)試驗(yàn)方法的建立.

檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)，2006,21(5):478-480HBsAg確認(rèn)試驗(yàn)的基本原理中和試驗(yàn)在陽(yáng)性樣本中加入抗HBs特異抗體試劑，與相應(yīng)未加入特異抗體的相同樣本的檢測(cè)結(jié)果作比較，如果出現(xiàn)A值明顯降低，則表明樣本含有HBsAg，即為真正的陽(yáng)性，A值沒(méi)有明顯降低的，則為假陽(yáng)性麗珠公司研發(fā)的HBsAg確認(rèn)試劑盒試劑：1.HBsAg確認(rèn)試劑盒1)含抗HBs75000IU/L的特異性抗體試劑2)含20%小牛血清的對(duì)照試劑3)含HBsAg5ng/ml的陽(yáng)性參考品2.配套使用的麗珠HBsAgELISA試劑盒麗珠HBsAg確認(rèn)試劑盒測(cè)定方法：1.

將HBsAgELISA診斷試劑盒和確認(rèn)試劑盒平衡15~20分鐘至室溫2.

ELISA板條上各孔的設(shè)置及加液量見(jiàn)后圖。如果樣本原HBsAg檢測(cè)結(jié)果的A值＞2.0，應(yīng)使用對(duì)照試劑將樣本稀釋100倍后再進(jìn)行測(cè)定；如果樣本原HBsAg檢測(cè)結(jié)果的A值≤2.0，應(yīng)使用原倍樣本進(jìn)行測(cè)定；如果樣本原HBsAg檢測(cè)結(jié)果的A值≤0.5，除做常規(guī)確認(rèn)試驗(yàn)外，同時(shí)做“延長(zhǎng)確認(rèn)試驗(yàn)”，與常規(guī)確認(rèn)試驗(yàn)的不同點(diǎn)是將加入酶標(biāo)記物后的溫育時(shí)間延長(zhǎng)至120分鐘，以提高檢測(cè)的靈敏度ELISA板條上各孔的設(shè)置及加液量對(duì)照孔檢測(cè)孔加入20μl對(duì)照試劑加入20μl特異性抗體試劑－空白孔＋

＋加入50μl陽(yáng)性參考品加入50μl待測(cè)1號(hào)樣本加入50μl待測(cè)2號(hào)樣本加入50μl待測(cè)3號(hào)樣本加入50μl待測(cè)4號(hào)樣本參考陽(yáng)性孔樣本孔麗珠HBsAg確認(rèn)試劑盒測(cè)定方法：3.

加液完畢后，混勻

(10~15秒)；置37℃水浴箱溫育30分鐘4.

每孔加入酶標(biāo)記物

(HBsAgELISA試劑盒組份)50μl，混勻

(10~15秒)5.

以下按HBsAgELISA試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。最后顯色，用空白孔校零，讀取各孔A值，并按以下公式計(jì)算抑制率：對(duì)照孔A值－檢測(cè)孔A值抑制率