病毒抗原與抗體檢測技術

關于病毒抗原與抗體檢測技術第1頁，課件共79頁，創(chuàng)作于2023年2月一、抗原—抗體反應特異性高可逆氫鍵、范德華力、靜電吸引力可見抗原-抗體比例適宜，復合物相成團第2頁，課件共79頁，創(chuàng)作于2023年2月二、影響反應的因素電解質(zhì)pH≥7時，適當電解質(zhì)使其結合可見凝集團或沉淀溫度37℃溫度升高，反應加快<56℃酸堿度pH6~8接近等電點時易出現(xiàn)假陽性第3頁，課件共79頁，創(chuàng)作于2023年2月第一節(jié)免疫熒光技術ImmunofluorescenceassayIFA能解決：是什么在哪里有多少熒光激發(fā)光譜發(fā)射光譜熒光效率熒光壽命熒光猝滅熒光偏振第4頁，課件共79頁，創(chuàng)作于2023年2月第一節(jié)免疫熒光技術熒光物質(zhì)熒光物質(zhì)最大吸收光譜最大發(fā)射光譜應用異硫氰酸熒光素(FITC)490～495nm520～530nm（黃綠色）FAT、熒光偏振免疫測定四乙基羅丹明(RB200)570～575nm595～600nm（橙紅色）FITC的襯比染色或雙標記FAT四甲基異硫氰酸羅丹明(TRITC)550nm620nm（橙紅色）FITC的襯比染色或雙標記FAT藻紅蛋白（PE）490-560nm595nm（紅色）雙標記FAT、流式細胞術7-氨基-4-甲基香豆素354nm430nm（藍色）雙標記或多標記FATEu3+螯合物340nm613nm時間分辨熒光免疫測定第5頁，課件共79頁，創(chuàng)作于2023年2月二、免疫熒光試驗（一）原理用熒光標記物標記病毒抗原或抗體，作為分子探針，檢查細胞或組織內(nèi)相應的病毒抗體或抗原。熒光標記物受激發(fā)光照射后發(fā)光，用熒光顯微鏡觀察，可確定病毒種類、定位、定量。第6頁，課件共79頁，創(chuàng)作于2023年2月二、免疫熒光試驗（二）類型熒光抗體法熒光抗原法免疫細胞（組織）化學技術第7頁，課件共79頁，創(chuàng)作于2023年2月二、免疫熒光試驗（三）方法制備標本制備熒光抗體熒光抗體染色熒光顯微鏡檢查第8頁，課件共79頁，創(chuàng)作于2023年2月二、免疫熒光試驗1.制作病毒染色標本培養(yǎng)敏感細胞（細胞爬片）↓種毒

↓固定、干燥丙酮第9頁，課件共79頁，創(chuàng)作于2023年2月二、免疫熒光試驗1.制作病毒染色標本臨床樣本（非固型組織）↓涂片↓固定、干燥第10頁，課件共79頁，創(chuàng)作于2023年2月二、免疫熒光試驗1.制作病毒染色標本尸檢樣品（3~5mm）

↓↓↓脫水脫色冰凍切片印片↓↓石蠟固定、脫蠟丙酮固定、干燥第11頁，課件共79頁，創(chuàng)作于2023年2月二、免疫熒光試驗2.熒光抗體制備制備抗體用高純度病毒免疫動物獲取血清，分離IgG，提純

家兔、綿羊、山羊高特異性高親和力第12頁，課件共79頁，創(chuàng)作于2023年2月二、免疫熒光試驗2.熒光抗體制備標記熒光素共價鍵結合抗體+熒光素↓4℃持續(xù)攪拌數(shù)小時純化（離心、透析、過濾）第13頁，課件共79頁，創(chuàng)作于2023年2月二、免疫熒光試驗3.鑒定制成的熒光抗體以FITC為例熒光（F）蛋白（P）結合率調(diào)整制備液至A280mm=12.87×A495mm

A280mm-0.35×A495mm比值越大，抗體結合熒光素越多F/P=第14頁，課件共79頁，創(chuàng)作于2023年2月二、免疫熒光試驗3.鑒定制成的熒光抗體測定抗體效價：雙向免疫擴散試驗抗體特異性：吸收試驗、抑制試驗抗體特異性染色滴度：倍比稀釋第15頁，課件共79頁，創(chuàng)作于2023年2月二、免疫熒光試驗4.熒光抗體染色直接法第16頁，課件共79頁，創(chuàng)作于2023年2月二、免疫熒光試驗4.熒光抗體染色間接法第17頁，課件共79頁，創(chuàng)作于2023年2月二、免疫熒光試驗4.熒光抗體染色補體法熒光標記抗補體抗體雙標記法兩種熒光素抗體檢測兩種抗原第18頁，課件共79頁，創(chuàng)作于2023年2月二、免疫熒光試驗5.設立對照區(qū)分特異性和非特異性染色標本自發(fā)熒光對照熒光抗體對照陽性抗原對照阻斷試驗第19頁，課件共79頁，創(chuàng)作于2023年2月三、免疫熒光顯微鏡技術熒光顯微鏡利用一定波長的激發(fā)光對樣品進行激發(fā)，產(chǎn)生一定波長的熒光，對樣品結構或其組分進行定性、定位、定量觀察檢測。

第20頁，課件共79頁，創(chuàng)作于2023年2月三、免疫熒光顯微鏡技術光源：高壓汞燈、氙燈或鹵素燈濾光片：隔熱、激發(fā)和吸收濾光片光路：透射光、落射光聚光器：明視野、暗視野和相差熒光聚光器鏡頭：消色差鏡頭第21頁，課件共79頁，創(chuàng)作于2023年2月三、免疫熒光顯微鏡技術透射光：照明光線從標本下經(jīng)聚光器透過標本進入物鏡。落射光：照明光線從標本上經(jīng)垂直照明器落射到標本，經(jīng)標本反射進入物鏡。第22頁，課件共79頁，創(chuàng)作于2023年2月四、時間分辯免疫熒光技術Time-resolvedfluoroimmunoassayTR-FIA（一）原理自發(fā)熒光壽命短:1ns～10ns鑭系元素壽命長:10μs～1000μs短壽命熒光完全衰變后再測定鑭系元素特異熒光銪Ed3+锝Tb3+釤Sm3+鏑Dy3+第23頁，課件共79頁，創(chuàng)作于2023年2月四、時間分辯免疫熒光技術（二）方法類型雙抗體夾心法固相抗體和Eu3+標記抗體與待檢抗原結合，形成固相抗體-待檢抗原-Eu3+標記抗體復合物，酸性增強液下，Eu3+解離，340nm激發(fā)光下發(fā)射613nm熒光。第24頁，課件共79頁，創(chuàng)作于2023年2月四、時間分辯免疫熒光技術（二）方法類型固相抗體競爭法待檢抗原和Eu3+標記抗原與固相抗體競爭結合,溫育洗滌后在固相中加入熒光增強液,測定熒光強度，熒光強度與待檢抗原含量成反比。固相抗原競爭法待檢抗原和固相抗原競爭結合定量的Eu3+標記抗體，溫育洗滌后在固相中加入熒光增強液,測定熒光強度，熒光強度與待檢抗原含量成反比。第25頁，課件共79頁，創(chuàng)作于2023年2月第二節(jié)酶免疫技術Enzymeimmunoassay抗原抗體反應特異性酶高效催化反應專一性

第26頁，課件共79頁，創(chuàng)作于2023年2月第二節(jié)酶免疫技術酶底物顯色反應

測定波長

辣根過氧化物酶HRP

鄰苯二胺OPD

四甲替聯(lián)苯胺TMB

氨基水楊酸

鄰聯(lián)苯甲胺

2,2‘-連胺基-2(3-乙基-并噻唑啉磺酸-6)銨鹽橘紅色

黃色

棕色

蘭色藍綠色492460449

425

642

堿性磷酸酯酶AP4-硝基酚磷酸鹽(PNP)

萘酚-AS-Mx磷酸鹽+重氮鹽黃色

紅色

400

500葡萄糖氧化酶ABTS+HRP+葡萄糖

葡萄糖+甲硫酚嗪+噻唑蘭黃色

深藍色405420β-Ｄ－半乳糖苷酶甲基傘酮基半乳糖苷(4MuG)

硝基酚半乳糖苷(ONPG)熒光

黃色

360,450

420第27頁，課件共79頁，創(chuàng)作于2023年2月第二節(jié)酶免疫技術酶標記戊二醛交聯(lián)法過碘酸氧化法醛基酶蛋白質(zhì)HRP過碘酸鹽HRP醛基第28頁，課件共79頁，創(chuàng)作于2023年2月第二節(jié)酶免疫技術固相載體塑料制品微粒膜載體NC膜、尼龍膜第29頁，課件共79頁，創(chuàng)作于2023年2月第二節(jié)酶免疫技術包被與封閉包被適宜濃度蛋白質(zhì)封閉二次包被填補空隙小牛血清第30頁，課件共79頁，創(chuàng)作于2023年2月二、酶聯(lián)免疫吸附試驗Enzyme-linkedimmunosorbentassayELISA酶標記抗體（抗原）與待測抗原（抗體）發(fā)生特異性反應，加入酶底物，通過酶對底物的顯色反應，對待測抗原（抗體）進行定位、定性或定量分析。第31頁，課件共79頁，創(chuàng)作于2023年2月第32頁，課件共79頁，創(chuàng)作于2023年2月間接法檢測抗體+++固相抗原標本酶標抗體底物顯色第33頁，課件共79頁，創(chuàng)作于2023年2月雙抗體夾心法檢測抗原+++固相抗體標本酶標抗體底物顯色第34頁，課件共79頁，創(chuàng)作于2023年2月競爭法可檢測抗原、抗體YYY+YYY+YYY參考管酶標抗原YYY+YYY+YYY待測管酶標抗原抗原第35頁，課件共79頁，創(chuàng)作于2023年2月捕獲法檢測IgM抗體+++抗IgM標本抗原酶標抗體顯色

（含IgM）+第36頁，課件共79頁，創(chuàng)作于2023年2月三、免疫酶染色試驗ImmunoenzymaticstainingtestIEST酶標抗體（抗原）—抗原（抗體）復合物

底物

有色底物第37頁，課件共79頁，創(chuàng)作于2023年2月三、免疫酶染色試驗細胞免疫酶染色均相酶免疫測定——無需分離游離與結合的酶標記物酶標記物結合后改變酶活性非均相酶免疫測定—需分離游離與結合的酶標記物液相：用二抗或沉淀去除游離酶標記物固相：ELISA第38頁，課件共79頁，創(chuàng)作于2023年2月第三節(jié)放射免疫技術RadioimmunoassayRIA利用放射性核素靈敏精確性與抗原抗體反應特異性相結合進行定量分析放射免疫核素標記抗原與未標記抗原競爭性結合特異性抗體免疫放射核素標記抗體結合待測抗原R.S.Yalow第39頁，課件共79頁，創(chuàng)作于2023年2月第三節(jié)放射免疫技術125I、131I、3H、14C標記純化鑒定放射性免疫活性第40頁，課件共79頁，創(chuàng)作于2023年2月第三節(jié)放射免疫技術第41頁，課件共79頁，創(chuàng)作于2023年2月第三節(jié)放射免疫技術放射免疫競爭法第42頁，課件共79頁，創(chuàng)作于2023年2月++++++++BoundFreeAgAb6/8=0.754/8=0.52/8=0.251/8=0.125B/B+F第43頁，課件共79頁，創(chuàng)作于2023年2月第三節(jié)放射免疫技術放射免疫以未結合的Ag*為F，Ag*Ab復合物為B，則B/F或B/(B＋F)與Ag的量變存在著函數(shù)關系－劑量反應曲線第44頁，課件共79頁，創(chuàng)作于2023年2月第四節(jié)血清學試驗中和試驗血凝/血凝抑制試驗補體結合試驗第45頁，課件共79頁，創(chuàng)作于2023年2月一、中和試驗neutralizationtest體外將病毒與特異性抗體混合并發(fā)生反應，再將混合物接種至敏感的宿主體內(nèi)，然后測定殘存病毒感染力的方法。

中和抗體第46頁，課件共79頁，創(chuàng)作于2023年2月一、中和試驗（一）原理中和抗體存在使病毒不能吸附和穿入宿主細胞，使病毒失去感染力。當病毒與抗體混合后，接種敏感宿主細胞再觀察敏感宿主的情況，即觀察殘存的病毒對宿主的感染力。第47頁，課件共79頁，創(chuàng)作于2023年2月一、中和試驗（二）方法步驟病毒---已知滴度，并有感染力測滴度：細胞培養(yǎng)，將病毒10倍稀釋接種敏感細胞或動物，觀察CPE或動物感染情況，確定滴定終點以CCID50或LD50表示標準病毒試驗濃度：100CCID50/單位體積或100LD50/單位體積第48頁，課件共79頁，創(chuàng)作于2023年2月一、中和試驗抗體用細胞培養(yǎng)法測病毒抗體的滴度：將倍比稀釋的病毒抗血清液與等量的標準病毒液混合，接種敏感細胞，觀察CPE。病毒抗體滴度的確定：抗血清保護細胞免受病毒感染的最高稀釋倍數(shù)的倒數(shù)。抗體滴度的含義：抑制CPE的最高稀釋倍數(shù)的抗血清中，每單位體積含一個抗體單位。第49頁，課件共79頁，創(chuàng)作于2023年2月一、中和試驗舉例如觀察結果是1：10至1：320抗血清均能抑制病毒的CPE，也就是當抗血清稀釋到320倍時，0.1ml抗血清含有1個抗體單位。請問：1：160及1：40含有幾個抗體單位？標準抗體濃度為20個抗體單位/0.1ml第50頁，課件共79頁，創(chuàng)作于2023年2月一、中和試驗宿主細胞培養(yǎng):觀察CPE和空斑（最理想和常用）雞胚：觀察雞胚的死亡（流感）、絨毛尿囊腔上痘瘡及血凝現(xiàn)象（天花、牛痘、HSV）動物（小白鼠）:成年和幼鼠易感，如乙腦病毒、森林腦炎病毒第51頁，課件共79頁，創(chuàng)作于2023年2月一、中和試驗（二）方法步驟固定血清—稀釋抗病毒法檢測病毒及其滴度固定病毒—稀釋抗血清法檢測血清效價第52頁，課件共79頁，創(chuàng)作于2023年2月一、中和試驗（二）方法步驟固定血清—稀釋病毒法用中和試驗方法鑒定病毒時，將不同稀釋倍數(shù)的病毒與標準的抗血清(20個抗體單位/單位體積)混合、孵育，使二者充分反應，然后將混合液接種到敏感宿主體內(nèi)，觀察試驗結果。第53頁，課件共79頁，創(chuàng)作于2023年2月固定血清稀釋病毒法試驗材料宿主:敏感細胞和動物、雞胚標準抗病毒血清(20個抗體單位/0.1ml)病毒分離物試驗步驟不同濃度病毒液與等量的抗病毒血清混合細胞培養(yǎng)液倍比稀釋病毒不同濃度病毒液與等量陰性血清混合接種細胞,設正常細胞對照，CO2孵箱觀察CPE中和試驗病毒CCID50：當抗血清組的CCID50與陰性組之差的對數(shù)大于2,才說明中和試驗陽性。第54頁，課件共79頁，創(chuàng)作于2023年2月固定血清稀釋病毒法陰性血清病毒CCID50的計算病毒稀釋度CPE孔數(shù)/接種孔數(shù)

累計數(shù)CPE數(shù)存活數(shù)CPE陽性比例CPE陽性率（％）10-45/510010/10100.010-54/5515/683.010-61/5151/617.010-70/50100/10

0第55頁，課件共79頁，創(chuàng)作于2023年2月固定血清稀釋病毒法距離比例＝（大于50%的CPE陽性率—50%）/（大于50%的CPE陽性率－小于50%的CPE陽性率）＝（83－50）/（83－17）＝0.5lgCCID50=大于50%的CPE陽性率血清稀釋度的對數(shù)+距離比例×稀釋系數(shù)的對數(shù)=lg10-5+0.5×lg0.1=-5.5,其反對數(shù)是10-5.5.陰性血清組的病毒CCID50為10-5.5/0.1ml。第56頁，課件共79頁，創(chuàng)作于2023年2月固定血清稀釋病毒法陽性血清病毒CCID50的計算病毒稀釋度CPE孔數(shù)/接種孔數(shù)累計數(shù)CPE數(shù)存活數(shù)CPE陽性比例CPE陽性率（％）10-25/510010/10100.010-33/5525/771.010-42/5252/729.010-50/50100/10

0第57頁，課件共79頁，創(chuàng)作于2023年2月固定血清稀釋病毒法距離比例＝（大于50%的CPE陽性率—50%）/（大于50%的CPE陽性率－小于50%的CPE陽性率）＝（71－50）/（71－29）＝0.5大于50%的CPE陽性率血清稀釋度的對數(shù)+距離比例×稀釋系數(shù)的對數(shù)=lg10-3+0.5×lg0.1=-3.5,其反對數(shù)是10-3.5。陽性血清組的病毒CCID50為10-3.5/0.1ml。因抗血清組的CCID50為10-3.5，陰性血清組的病毒CCID50為10-5.5,所以10-3.5-10-5.5=2,表明分離的病毒是與中和抗體相對應的病毒。第58頁，課件共79頁，創(chuàng)作于2023年2月一、中和試驗（二）方法步驟固定病毒—稀釋血清法用于血清抗體滴度的測量。用已知病毒檢測位置抗體滴度。100CCID50/單位體積的病毒+連續(xù)倍比稀釋血清→孵育1h→接種敏感宿主→觀察不同稀釋度的血清保護宿主感染病毒的情況第59頁，課件共79頁，創(chuàng)作于2023年2月固定病毒稀釋血清法試驗材料:敏感宿主標準滴定的病毒100CCID50/0.1ml急性期或恢復期血清試驗步驟細胞培養(yǎng)液倍比稀釋急性或恢復期血清取不同稀釋濃度血清與標準病毒混合并37℃孵育1h取混合液0.2ml接種細胞,CO2孵箱觀察CPE50％血清中和終點：50%細胞不產(chǎn)生細胞病變的血清稀釋度第60頁，課件共79頁，創(chuàng)作于2023年2月固定病毒稀釋血清法恢復期血清中和病毒的結果血清稀釋度CPE孔數(shù)/接種孔數(shù)累計數(shù)CPE數(shù)無CPE數(shù)CPE陽性比例CPE陽性率（％）1：16(10-1.2)0/4080/80.01：32(10-1.5)1/4141/520.01：64(10-1.8)3/4414/580.01：128(10-2.1)4/4808/8100.0第61頁，課件共79頁，創(chuàng)作于2023年2月固定病毒稀釋血清法距離比例＝（50%—小于50%的CPE陽性率）/（大于50%的CPE陽性率－小于50%的CPE陽性率）＝（50－20）/（80－20）＝0.550%血清中和終點的范圍:1:32與1:64之間。中和終點濃度=小于50%的CPE陽性率血清稀釋度的對數(shù)+距離比例×稀釋系數(shù)的對數(shù)=lg10-1.5+0.5×lg0.5=-1.65,其反對數(shù)是1/45即50%血清中和終點為1:45含義：1:45稀釋度的恢復期血清可保護50%細胞不產(chǎn)生細胞病變效應。第62頁，課件共79頁，創(chuàng)作于2023年2月二、血凝/血抑血凝HA第63頁，課件共79頁，創(chuàng)作于2023年2月血凝抑制HI第64頁，課件共79頁，創(chuàng)作于2023年2月

123456789101112血凝試驗HA試驗方法選擇96孔板（V型）病毒液倍比稀釋稀釋好后加雞紅細胞混勻后±20℃室溫靜置30min+50μlPBS吸出一半1:21:221:231:24+100μl病毒液+50μl雞紅細胞吸棄一半第65頁，課件共79頁，創(chuàng)作于2023年2月血凝試驗HA血凝滴度：以出現(xiàn)++的稀釋度的倒數(shù)為判定終點,為1個血凝單位。凝集效價：能使血球產(chǎn)生++凝集的病毒最高稀釋度為病毒的凝集效價，即0.5ml病毒液含1個血凝單位。第66頁，課件共79頁，創(chuàng)作于2023年2月三、補體結合試驗補體：正常人和動物血清與組織液中的一組經(jīng)活化后具有酶活性的蛋白質(zhì)，輔助抗體介導免疫溶菌和溶血作用。對熱不穩(wěn)定。綿羊紅細胞與抗綿羊紅細胞抗體（溶血素）作用形成溶血素致敏的綿羊紅細胞。補體可使這種致敏紅細胞溶解。補體可結合任何病毒抗原抗體復合物第67頁，課件共79頁，創(chuàng)作于2023年2月三、補體結合試驗如果反應系統(tǒng)中存在待測的抗體（或抗原），則抗原抗體發(fā)生反應后可結合補體；再加入指示系統(tǒng)時，而不出現(xiàn)溶血，是為補體結合試驗陽性。如果反應系統(tǒng)中不存在的待檢的抗體（或抗原），則在液體中仍有游離的補體存在，當加入指示系統(tǒng)時會出現(xiàn)溶血，是為補體結合試驗陰性。第68頁，課件共79頁，創(chuàng)作于2023年2月三、補體結合試驗有3個系統(tǒng)：①反應系統(tǒng)，即已知的抗原（或抗體）與待測的抗體（或抗原）；②補體系統(tǒng)；③指示系統(tǒng)，即SRBC與相應溶血素，形成致敏紅細胞。第69頁，課件共79頁，創(chuàng)作于2023年2月三、補體結合試驗病毒抗原從組織培養(yǎng)、雞胚和動物試驗中獲得病毒抗原應適當提純，純度愈高，特異性愈強如使用粗制抗原時，須經(jīng)同樣處理的正常組織作抗原對照，以識別待檢血清中可能存在的、對正常組織成分的非特異性反應

第70頁，課件共79頁，創(chuàng)作于2023年2月三、補體結合試驗抗體免疫用的病毒抗原最好不是同一細胞或動物，以免發(fā)生交叉反應血清樣品應加熱滅活處理，消除補體活性和非特異性抗補體活性人和豚鼠滅活溫度為56℃；家兔和馬滅活溫度為65℃第71頁，課件共79頁，創(chuàng)作于2023年2月三、補體結合試驗補體檢測人和哺乳動物血清應用豚鼠新鮮血清補體臨用前使用1％SRBC制備綿羊頸靜脈采血，生理鹽水洗滌溶血素用綿羊紅細胞免疫家兔獲得效價達到1:4000可獲得56℃30分鐘滅活，加甘油后長期保存稀釋液含鈣鎂離子的生理鹽水，可維持補體的穩(wěn)定第72頁，課件共79頁，創(chuàng)作于2023年2月三、補體結合試驗溶血素的滴定先將溶血素稀釋成1:100~1:1000,再依次加入溶血素0.1ml，鈣鎂鹽水0.2ml，1:60補體0.2ml、1％綿羊紅細胞0.1ml，混勻后再水浴結果判定：完全溶血的試管液體紅色透明，離心后見少許細胞;不溶血的試管液體混濁，放置后見紅細胞沉淀，上清無色透明溶血素效價的測定;以完全溶血的最高稀釋倍數(shù)確定為1個單位本例1個單位的溶血素的效價為1：4000；正式使用2個單位第73頁，課件共79頁，創(chuàng)作于2023年2月三、補體結合試驗補體的滴定補體不穩(wěn)定，每次試驗前需滴定管號1：60補體鈣鎂鹽水（ml)2U抗原(ml)1％致敏SRBC(ml)結果10.040.260.10.2不溶20.060.240.10.2不溶30.080.220.10.2微溶40.100.200.10.2微溶50.120.180.10.2全溶60.140.160.10.2全溶70.140.140.10.2全溶第74頁，