藥物毒理學(xué)講座

藥物毒理學(xué)講座第一頁(yè)，共125頁(yè)。一、概述

(一)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

(designofexperiment,DOE)

良好的設(shè)計(jì)是順利進(jìn)行科學(xué)研究和數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析的先決條件，也是獲得預(yù)期結(jié)果的重要保證。第二頁(yè)，共125頁(yè)。設(shè)計(jì)包括專業(yè)設(shè)計(jì)和統(tǒng)計(jì)設(shè)計(jì)兩部分：

專業(yè)設(shè)計(jì)是從各專業(yè)角度考慮實(shí)驗(yàn)的科學(xué)安排，是基礎(chǔ)。包括選題，建立假說(shuō)，確定研究對(duì)象和技術(shù)方法等；

統(tǒng)計(jì)設(shè)計(jì)則是從統(tǒng)計(jì)學(xué)角度，考慮設(shè)計(jì)的科學(xué)性和邏輯性，使研究結(jié)果具有重現(xiàn)性，更可靠，更科學(xué)，經(jīng)得起時(shí)間的考驗(yàn)。第三頁(yè)，共125頁(yè)。(二)醫(yī)學(xué)科學(xué)研究種類

●臨床研究

●流行病學(xué)研究

●動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究第四頁(yè)，共125頁(yè)。(三)研究深度廣度層次●

整體→系統(tǒng)→器官→組織

→細(xì)胞→亞細(xì)胞→分子水平●

個(gè)體群體●

體外

體內(nèi)●

宏觀微觀第五頁(yè)，共125頁(yè)。(四)醫(yī)學(xué)科學(xué)研究的基礎(chǔ)學(xué)科和方法學(xué)

●衛(wèi)生統(tǒng)計(jì)學(xué)

●流行病學(xué)

●衛(wèi)生毒理學(xué)第六頁(yè)，共125頁(yè)。

(五)毒理學(xué)及其相關(guān)術(shù)語(yǔ)

1.

毒理學(xué)(toxicology)

是研究化學(xué)物質(zhì)對(duì)機(jī)體的生物學(xué)作用及其機(jī)理的學(xué)科；

研究化學(xué)物質(zhì)對(duì)機(jī)體的有益作用，即通過(guò)影響機(jī)體器官的生理功能或細(xì)胞代謝活動(dòng)達(dá)到防治疾病的目的，屬藥物學(xué)范疇；

研究化學(xué)物質(zhì)對(duì)機(jī)體的有害作

用及其防護(hù)措施，屬預(yù)防醫(yī)學(xué)范疇。第七頁(yè)，共125頁(yè)。

2.外源化學(xué)物(xenobiotics)：

以前叫外來(lái)化合物，指存在于人類生活的外界環(huán)境中、可能與機(jī)體接觸并進(jìn)入機(jī)體的化學(xué)物質(zhì)；它們并非人體的組成成分，也非人體所需的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，也不是維持正常生理功能和生命所必需的物質(zhì)，但可由外界環(huán)境經(jīng)一定環(huán)節(jié)和途徑與機(jī)體接觸并進(jìn)入機(jī)體，在體內(nèi)呈現(xiàn)一定的生物學(xué)作用。確切地說(shuō)，應(yīng)稱為“外來(lái)生物活性物質(zhì)”。須強(qiáng)調(diào)：包括“藥物”。第八頁(yè)，共125頁(yè)。外源化學(xué)物包括：

醫(yī)藥

農(nóng)藥

工業(yè)化學(xué)物

環(huán)境污染物

食品添加劑

產(chǎn)業(yè)性化學(xué)物：如化妝品、洗滌劑等

與外源化學(xué)物相對(duì)應(yīng)的概念是內(nèi)源活性化合物：指機(jī)體代謝過(guò)程中所形成的產(chǎn)物或中間產(chǎn)物。第九頁(yè)，共125頁(yè)。3.毒物(poison)

指在一定條件下，以較小劑量進(jìn)入機(jī)體就能干擾正常的生化過(guò)程或生理功能，引起暫時(shí)或永久性的病理改變，甚至危及生命的化學(xué)物質(zhì)。

“毒物”與“非毒物”的概念是相對(duì)的。第十頁(yè)，共125頁(yè)。

4.毒性(toxicity)化學(xué)物能夠?qū)C(jī)體造成損害的能力，稱為毒性。

在同等劑量下，化學(xué)物質(zhì)對(duì)機(jī)體損害能力越大，其毒性越高。相對(duì)于同一損害指標(biāo)，需要?jiǎng)┝吭叫〉幕瘜W(xué)物質(zhì)，其毒性越大。第十一頁(yè)，共125頁(yè)。如同“毒物”和“非毒物”是相對(duì)的一樣，化學(xué)物質(zhì)的毒性高低具有相對(duì)意義。

對(duì)于毒性，一定要強(qiáng)調(diào)“量”的概念。任何化學(xué)物質(zhì)，只要達(dá)到一定的劑量，對(duì)機(jī)體都具有毒性，而低于某一劑量水平時(shí)，則不具有毒性。

如人體必需的微量元素Se、食鹽等；

毒性大的非人體必需化學(xué)物，在某一劑量范圍內(nèi)對(duì)機(jī)體不呈現(xiàn)損害作用，有的反而對(duì)某種疾病有治療作用，如As、Pb。

因此，劑量(dose)是化學(xué)物質(zhì)毒性的決定因素。第十二頁(yè)，共125頁(yè)。化學(xué)物質(zhì)的毒性除主要取決于劑量外，還與化學(xué)物對(duì)機(jī)體的作用條件(如接觸途徑、接觸方式：包括接觸次數(shù)、時(shí)間、間隔等)、理化特性(如溶解度、分散度、揮發(fā)度、比重、硬度)、環(huán)境因素(如氣溫、氣濕)、宿主因素(如物種、品系、性別、年齡、遺傳素質(zhì)、免疫水平、健康狀況、營(yíng)養(yǎng)狀況)等有關(guān)。

因此，探討化學(xué)物對(duì)機(jī)體的生物學(xué)作用，關(guān)鍵是作用劑量和作用條件。即在嚴(yán)格控制條件下通過(guò)實(shí)驗(yàn)研究(動(dòng)物實(shí)驗(yàn))觀察藥物對(duì)機(jī)體及其組成部分的作用規(guī)律及其原理。第十三頁(yè)，共125頁(yè)?！?/p>

5.半數(shù)致死劑量

(medianletheldose,LD50)，或半數(shù)致死濃度(LC50)：指化學(xué)毒物能夠引起受試對(duì)象死亡一半所需要的劑量或濃度。又稱致死中量。為一統(tǒng)計(jì)量。

毒物的毒性大小，通常用動(dòng)物急性毒性試驗(yàn)所得出的LD50或LC50來(lái)表示。化學(xué)毒物的急性毒性與LD50呈反比，即急性毒性越大，LD50的數(shù)值越小。

經(jīng)口、經(jīng)皮毒性用LD50表示，單位mg/kg·BW)；

吸入毒性或?qū)λ鷦?dòng)物的毒性用LC50表示，單位mg/m3或mg/L。第十四頁(yè)，共125頁(yè)。

LD50或LC50是評(píng)價(jià)化學(xué)毒物急性毒性大小最重要的參數(shù)，也是對(duì)不同化學(xué)毒物進(jìn)行急性毒性分級(jí)的基礎(chǔ)標(biāo)準(zhǔn)。我國(guó)農(nóng)藥的急性毒性分級(jí)級(jí)別經(jīng)口LD50(mg/kg·WB)經(jīng)皮LD50(mg/kg·WB)4h吸入LC50(mg/m3)2h劇毒＜5＜20＜20高毒5~20~20~中等毒50~500200~2000200~2000低毒＞500＞2000＞2000第十五頁(yè)，共125頁(yè)。化學(xué)物質(zhì)急性毒性分級(jí)級(jí)別大鼠口服LD50(mg/kg·WB)相當(dāng)于人的致死劑量(mg/kg·WB)(g/人)極毒＜1稍嘗0.05劇毒1~50500~40000.5中等毒51~5004000~300005低毒501~500030000~25000050實(shí)際無(wú)毒5001500000500無(wú)毒＞15000＞5000002500第十六頁(yè)，共125頁(yè)。反映化學(xué)物質(zhì)急性毒性大小的指標(biāo)還有：

最大無(wú)作用劑量(NOEL)；

最小有作用劑量(minimaleffctlevel，MEL)，又叫中毒閾劑量(thresholddose)

，或中毒閾值，或毒性閾值；

最大耐受劑量(maximaltolerancedose,MTD,LD0)

最小致死劑量(LD1)；

絕對(duì)致死劑量(LD100)。

第十七頁(yè)，共125頁(yè)。

6.劑量—反應(yīng)關(guān)系(dose-responserelationship)表示化學(xué)毒物的劑量與某一群體中質(zhì)效應(yīng)的發(fā)生率之間的關(guān)系。

7.

劑量—效應(yīng)關(guān)系(dose-effectrelationship)表示化學(xué)毒物的劑量與個(gè)體

或群體中發(fā)生的量效應(yīng)強(qiáng)度

之間的關(guān)系。第十八頁(yè)，共125頁(yè)。

安全系數(shù)種屬差異,動(dòng)物實(shí)驗(yàn),外推到人。

試驗(yàn)組不同劑量組

陰性對(duì)照組

陽(yáng)性對(duì)照組為何設(shè)陰性、陽(yáng)性對(duì)照組？

樣本含量原則：既符合統(tǒng)計(jì)學(xué)要求,又不致人力、物力、財(cái)力、時(shí)間的浪費(fèi)。

統(tǒng)計(jì)學(xué)處理計(jì)量資料;計(jì)數(shù)資料第十九頁(yè)，共125頁(yè)。醫(yī)藥藥效學(xué)農(nóng)藥研究產(chǎn)業(yè)性化學(xué)物毒理學(xué)(五)

藥物研究●藥效學(xué)研究●毒理學(xué)研究?jī)烧呔毻ㄟ^(guò)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)、流行病學(xué)、臨床研究方法進(jìn)行研究，但毒理學(xué)研究主要采用動(dòng)物實(shí)驗(yàn)。第二十頁(yè)，共125頁(yè)。(六)

毒理學(xué)安全性評(píng)價(jià)

我國(guó)現(xiàn)有的毒理學(xué)安全性評(píng)價(jià)程序：

《食品安全性毒理學(xué)評(píng)價(jià)程序》

《農(nóng)藥安全性毒理學(xué)評(píng)價(jià)程序》

《新藥(農(nóng)藥)毒理學(xué)研究指導(dǎo)原則》

《化妝品安全性毒理學(xué)評(píng)價(jià)程序》

《化學(xué)品毒性鑒定管理規(guī)范》(入世為與國(guó)際接軌頒布)

實(shí)驗(yàn)室研究質(zhì)量規(guī)范(goodlaboratorypractice,GLP)，對(duì)毒性鑒定機(jī)構(gòu)的認(rèn)證、實(shí)驗(yàn)室要求作出明確規(guī)定。第二十一頁(yè)，共125頁(yè)。對(duì)不同化學(xué)品(食品添加劑、藥物、農(nóng)藥、化妝品、工業(yè)化學(xué)物等)，由于接觸方式、途徑、劑量不同，按照不同的國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)，采用不同行業(yè)規(guī)范程序進(jìn)行評(píng)價(jià)。第二十二頁(yè)，共125頁(yè)。毒理學(xué)安全性評(píng)采用分階段試驗(yàn)的原則(考慮急性危害、慢性危害、遠(yuǎn)期危害)。各階段試驗(yàn)之間有關(guān)聯(lián)，要按順序進(jìn)行。

如急性毒性實(shí)驗(yàn)是所有毒理學(xué)實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)；

慢性毒性實(shí)驗(yàn)的劑量、觀察指標(biāo)的選擇要參考亞慢性毒性實(shí)驗(yàn)的結(jié)果。

根據(jù)前一階段的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，判斷是否進(jìn)行下一階段的實(shí)驗(yàn)。第二十三頁(yè)，共125頁(yè)。

不同階段的毒理學(xué)試驗(yàn)項(xiàng)目

我國(guó)現(xiàn)有毒理學(xué)評(píng)價(jià)程序多數(shù)為4個(gè)階段?！痘瘖y品安全性毒理學(xué)評(píng)價(jià)程序》為5個(gè)階段。

新藥研究分為全身用藥的毒性試驗(yàn)、局部用藥的毒性試驗(yàn)、特殊毒理研究，三部分。

化學(xué)物的種類不同，用途不同，試驗(yàn)方法和先后順序不同(如化妝品、食品，口皮急毒順序不同)。第二十四頁(yè)，共125頁(yè)。

第一階段，包括：

?

急性毒性試驗(yàn)；

?

局部毒性試驗(yàn)。

目的：主要是測(cè)定LD50或LC50，并進(jìn)行急性毒性分級(jí)，為其它試驗(yàn)提供劑量參考依據(jù)，并推測(cè)靶器官。

農(nóng)藥、化裝品要進(jìn)行

?

皮膚、黏膜刺激試驗(yàn)；

?

眼刺激試驗(yàn)；

?

皮膚致敏試驗(yàn)；

?

皮膚光毒試驗(yàn)；

?

光變態(tài)反應(yīng)試驗(yàn)。第二十五頁(yè)，共125頁(yè)。第二階段，一般包括：

?

蓄積試驗(yàn)；

?

致突變?cè)囼?yàn)。

目的：了解與受試物多次接觸后體內(nèi)的蓄積情況以及可能的危害，并判斷是否具有致突變性進(jìn)而估計(jì)致癌性。

蓄積試驗(yàn)，以死亡為指標(biāo)，有一定局限性，目前有些評(píng)價(jià)程序已經(jīng)去掉。

致突變?cè)囼?yàn)，包括多種組合，以觀察不同的遺傳終點(diǎn)。第二十六頁(yè)，共125頁(yè)。某些受試物在第一、第二階段試驗(yàn)后，可決定是否進(jìn)行下一階段的試驗(yàn)。

如引進(jìn)產(chǎn)品、生產(chǎn)工藝，國(guó)外已經(jīng)登記注冊(cè)，毒性資料全面，其質(zhì)量規(guī)格、生產(chǎn)工藝、與國(guó)外產(chǎn)品一致，進(jìn)行第一階段和第二階段結(jié)果與國(guó)外一致，可以不進(jìn)行第三、第四階段試驗(yàn)。第二十七頁(yè)，共125頁(yè)。

第三階段，包括：

?亞慢性毒性試驗(yàn)；

?生殖及發(fā)育毒性試驗(yàn)；

?代謝試驗(yàn)。

亞慢性毒性試驗(yàn)?zāi)康模捍_定反復(fù)接觸受試物所引起的毒性效應(yīng)、強(qiáng)度、靶器官，初步估計(jì)NOAEL或LOAEL，為慢性毒性試驗(yàn)和致癌試驗(yàn)提供劑量、指標(biāo)參考依據(jù)。

生殖發(fā)育毒性試驗(yàn)包括：致畸試驗(yàn)；繁殖試驗(yàn)。目的：觀察對(duì)生殖過(guò)程的影響。

代謝試驗(yàn)?zāi)康模毫私馐茉囄镌隗w內(nèi)的吸收、分布、消除情況，判斷蓄積性。第二十八頁(yè)，共125頁(yè)。

第四階段，包括：

?慢性毒性試驗(yàn)；

?致癌試驗(yàn)。

目的：獲得NOAEL或LOAEL，

為制訂衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)提供參考數(shù)據(jù)。

特點(diǎn)：時(shí)間長(zhǎng)、費(fèi)人力物力。第二十九頁(yè)，共125頁(yè)。

(七)藥物毒理學(xué)研究的發(fā)展

隨著醫(yī)學(xué)科學(xué)和醫(yī)藥工業(yè)的進(jìn)步和發(fā)展，研制和開(kāi)發(fā)了大量新藥，對(duì)醫(yī)治人類疾病,保障人類健康起到了巨大作用。

但由于1961年反應(yīng)停(thalidomide)藥害事件發(fā)生，使28國(guó)家中出生了8000多短肢畸形兒，引起世界各國(guó)極大關(guān)注，使醫(yī)學(xué)界首次認(rèn)識(shí)到對(duì)母體安全的化學(xué)藥物對(duì)胎兒產(chǎn)生不可逆損傷。由此揭開(kāi)藥物和其它環(huán)境化學(xué)毒物致畸的研究序幕。人們?cè)谝笏幮У耐瑫r(shí)，更注意其安全性。第三十頁(yè)，共125頁(yè)。一種藥物的藥理概況，決定于臨床前的藥理和毒性研究，在供使用前必需了解預(yù)期藥效、藥理性質(zhì)、毒性作用，有助于顯示其使用安全性。藥物的安全性，是保證藥品質(zhì)量的重要環(huán)節(jié)，隨著新藥的國(guó)際化，國(guó)際間相互利用安全性試驗(yàn)數(shù)據(jù)也日益增加。第三十一頁(yè)，共125頁(yè)。為此，英國(guó)1968年頒布藥品法，1971年成立了藥物檢定機(jī)構(gòu)和藥物安全委員會(huì)。此后，在藥物市場(chǎng)經(jīng)濟(jì)推動(dòng)下，許多發(fā)達(dá)國(guó)家開(kāi)始重視藥物和其它化學(xué)品對(duì)人類生殖的影響，首先是致畸性(teratogenicity)，WHO于1967年在國(guó)際疾病分類中把先天缺陷列為第14項(xiàng)，分20大類、133小類。同時(shí)，研究懷孕至出生之間胚胎/胎兒異常發(fā)育的畸胎學(xué)(teratology)創(chuàng)立。1981年OECD(經(jīng)濟(jì)合作和發(fā)展組織)制定了“化學(xué)物質(zhì)毒性試驗(yàn)指導(dǎo)原則”，該指導(dǎo)原則不僅對(duì)藥品也包括一般產(chǎn)業(yè)性化學(xué)物質(zhì)，使毒性試驗(yàn)規(guī)范化。第三十二頁(yè)，共125頁(yè)。第三十三頁(yè)，共125頁(yè)。第三十四頁(yè)，共125頁(yè)。第三十五頁(yè)，共125頁(yè)。第三十六頁(yè)，共125頁(yè)。(七)新藥研究過(guò)程

大致可分三步：即臨床前研究、臨床研究和售后調(diào)研。

1.臨床前研究

用動(dòng)物試驗(yàn)進(jìn)行系統(tǒng)藥理研究和急慢性毒理觀察，對(duì)于具有選擇性藥理效應(yīng)的藥物，在進(jìn)行臨床試驗(yàn)前，還需測(cè)定該藥物在動(dòng)物體內(nèi)的吸收、分布及消除過(guò)程(藥代動(dòng)力學(xué))，故臨床前研究目的是弄清新藥的作用譜(藥效)及可能發(fā)生的毒性反應(yīng)(毒作用特點(diǎn))。第三十七頁(yè)，共125頁(yè)。

2.臨床研究

首先從10～30名志愿者中找出安全劑量(依據(jù)動(dòng)物試驗(yàn)結(jié)果，安全系數(shù))，再選有特異特征病人隨機(jī)分組，設(shè)立已知有效藥物及空白安慰劑雙重對(duì)照(陽(yáng)、陰性對(duì)照),對(duì)治療結(jié)果統(tǒng)計(jì)分析，判斷其療效。

3.售后調(diào)研

重點(diǎn)了解長(zhǎng)期使用后出現(xiàn)的不良反應(yīng)和遠(yuǎn)期療效(流行病學(xué)研究)。第三十八頁(yè)，共125頁(yè)。(八)新藥藥理毒理研究的技術(shù)要求

新藥的藥理毒理研究包括主要藥效學(xué)、一般藥理學(xué)、藥代動(dòng)力學(xué)及毒理學(xué)研究等。第三十九頁(yè)，共125頁(yè)。新藥的藥效研究，以醫(yī)藥理論為指導(dǎo)，運(yùn)用現(xiàn)代科學(xué)方法，制定具有醫(yī)藥特點(diǎn)的試驗(yàn)方案，根據(jù)新藥的功能主治，選用或建立相應(yīng)的動(dòng)物模型和試驗(yàn)方法，其目的是對(duì)新藥的有效性評(píng)價(jià)提供科學(xué)依據(jù)。

新藥的毒理研究包括急性毒性、長(zhǎng)期毒性和特殊毒性試驗(yàn)等，其目的是對(duì)新藥的安全性評(píng)價(jià)提供科學(xué)依據(jù)。第四十頁(yè)，共125頁(yè)。

基本要求

1.試驗(yàn)主要負(fù)責(zé)人應(yīng)具有藥理毒理專業(yè)高級(jí)技術(shù)職稱和有較高的理論水平、工作經(jīng)驗(yàn)與資歷。確保試驗(yàn)設(shè)計(jì)合理，數(shù)據(jù)可靠，結(jié)果可信，結(jié)論判斷準(zhǔn)確。試驗(yàn)報(bào)告應(yīng)有試驗(yàn)負(fù)責(zé)人簽字及單位蓋章。

2.受試藥物應(yīng)處方固定、制備工藝及質(zhì)量基本穩(wěn)定。

3.從事新藥安全性研究的實(shí)驗(yàn)室應(yīng)符合國(guó)家藥品監(jiān)督管理局《藥品非臨床研究質(zhì)量管理規(guī)范》(GLP)的要求，藥理研究也可參照實(shí)行。第四十一頁(yè)，共125頁(yè)。

全身性用藥的毒理試驗(yàn)

1．急性毒性試驗(yàn)

觀察一次給藥后，動(dòng)物產(chǎn)生的毒性反應(yīng)并測(cè)定其半數(shù)致死量(LD50)。

要用兩種以上給藥途徑(包括推薦臨床研究的給藥途徑，溶于水的藥應(yīng)當(dāng)測(cè)定iv的LD50)。給藥后至少觀察7d，觀察到動(dòng)物有毒性反應(yīng)時(shí)應(yīng)進(jìn)行肉眼尸檢，記錄所有病變。存活24h或更長(zhǎng)時(shí)間的處理動(dòng)物，當(dāng)尸檢發(fā)現(xiàn)有病變組織時(shí)，應(yīng)對(duì)該組織進(jìn)行鏡檢。第四十二頁(yè)，共125頁(yè)。

2．長(zhǎng)期毒性試驗(yàn)

觀察動(dòng)物因連續(xù)用藥而產(chǎn)生的毒性反應(yīng)、中毒時(shí)首先出現(xiàn)的癥狀及停藥后組織和功能損害的發(fā)展和恢復(fù)情況。第四十三頁(yè)，共125頁(yè)。

(1)動(dòng)物：至少兩種動(dòng)物(包括嚙齒類和非嚙齒類)，嚙齒類常用大白鼠，年齡為6W，飼養(yǎng)觀察1W后使用，動(dòng)物數(shù)按毒性試驗(yàn)時(shí)間的長(zhǎng)短決定，如毒性試驗(yàn)時(shí)間＜90d，每劑量組為雌雄各10只。如毒性試驗(yàn)時(shí)間＞90d，每劑量組為雌雄各20只。非嚙齒類常用狗，年齡為4~6月，每劑量組為雌雄各2只。對(duì)照組和試驗(yàn)組的動(dòng)物數(shù)要相等。第四十四頁(yè)，共125頁(yè)。

(2)劑量：常用三個(gè)劑量，大動(dòng)物也可用兩個(gè)劑量。在試驗(yàn)過(guò)程中，高劑量組應(yīng)有部分動(dòng)物出現(xiàn)毒性反應(yīng)或死亡(≯20％)，低劑量組應(yīng)當(dāng)略高于藥物對(duì)動(dòng)物的有效量或臨床試驗(yàn)用的劑量而不出現(xiàn)任何觀察指標(biāo)的異常。第四十五頁(yè)，共125頁(yè)。

(3)給藥途徑：注射用藥的給藥途徑應(yīng)與推薦臨床試驗(yàn)的給藥途徑相同，口服給藥最好采用灌胃法。第四十六頁(yè)，共125頁(yè)。

(4)試驗(yàn)周期：一般參考推薦臨床試驗(yàn)的用藥持續(xù)時(shí)間考慮，即動(dòng)物試驗(yàn)連續(xù)給藥期必須為臨床試驗(yàn)給藥期的3~4倍。例如，臨床試驗(yàn)給藥期為1~3d者，毒性試驗(yàn)給藥期為2W。7d者，為4W。30d者，為3月。＞30d者，毒性試驗(yàn)給藥期至少半年。

試驗(yàn)周期在半年以上的新藥，可在長(zhǎng)期毒性試驗(yàn)進(jìn)行3個(gè)月后、未發(fā)現(xiàn)明顯毒性反應(yīng)的情況下，申請(qǐng)進(jìn)行第Ⅰ期臨床試驗(yàn)。第四十七頁(yè)，共125頁(yè)。

(5)觀察指標(biāo)：一般體征、體重、外觀、行為、尿常規(guī)、血常規(guī)、肝腎功能及重要器官的肉眼觀察和病理檢查，必要時(shí)作骨髓檢查，血液生化，大動(dòng)物應(yīng)檢查心率和心電圖變化。凡有可能引起眼、耳毒性的藥物，應(yīng)增加眼、耳毒性檢查指標(biāo)。有些藥物尚需研究對(duì)酸堿平衡、水鹽代謝的影響。第四十八頁(yè)，共125頁(yè)。產(chǎn)生毒性反應(yīng)的新藥至少應(yīng)對(duì)高劑量組和對(duì)照組的動(dòng)物在給藥期結(jié)束后繼續(xù)進(jìn)行觀察，對(duì)引起不可逆性功能損害和組織病變的藥物，要慎重考慮臨床試驗(yàn)問(wèn)題。第四十九頁(yè)，共125頁(yè)。對(duì)毒性較高、安全范圍較小的特殊品種新藥，如擬進(jìn)行臨床試驗(yàn)，最好通過(guò)研究找出一種解救藥，以備過(guò)量中毒時(shí)使用。第五十頁(yè)，共125頁(yè)。有的新藥還應(yīng)根據(jù)其藥理性質(zhì)和用途，觀察對(duì)注射部位(皮下、肌肉、血管)的刺激性，注射用生化制品應(yīng)進(jìn)行熱原、異性蛋白及過(guò)敏試驗(yàn)。第五十一頁(yè)，共125頁(yè)。

(二)局部用藥毒性試驗(yàn)

局部用藥(如呼吸道吸入以及粘膜、皮膚用藥等)，大都可以被吸收。因此，局部用藥應(yīng)先進(jìn)行局部吸收試驗(yàn)，根據(jù)藥物從局部吸收的程度，考慮進(jìn)行全身性用藥的各項(xiàng)試驗(yàn)。根據(jù)用藥方法，對(duì)用藥部位要進(jìn)行局部刺激性試驗(yàn)，用肉眼觀察及組織切片的鏡檢，測(cè)試刺激性(即炎癥)的發(fā)展和恢復(fù)情況。第五十二頁(yè)，共125頁(yè)。

1．皮膚用藥進(jìn)行完整和破損皮膚的毒性試驗(yàn)以及皮膚致敏試驗(yàn)，除嬰兒皮膚用藥應(yīng)使用剛成年動(dòng)物外，其余均用成年動(dòng)物?？蛇x用家兔、豚鼠或大鼠。至少應(yīng)設(shè)三個(gè)劑量組，每組動(dòng)物數(shù)≮3只，以觀察與劑量相關(guān)的毒性反應(yīng)。觀察期一般在停止敷用后不超過(guò)14d。第五十三頁(yè)，共125頁(yè)。

2．滴鼻劑和吸入劑進(jìn)行呼吸道(包括肺部)的局部刺激性和毒性試驗(yàn)。大鼠或豚鼠。每一個(gè)濃度組至少10只動(dòng)物(雌雄各半)，至少設(shè)3個(gè)濃度組。接觸吸入劑的時(shí)間不少于4h。觀察期一般為14d。第五十四頁(yè)，共125頁(yè)。

3．滴眼劑觀察對(duì)眼結(jié)合膜和眼球的刺激作用。家兔為首選，至少用3只家兔。液體制劑的劑量一般每次用0.1ml，軟膏等制劑每次≯100mg。觀察期一般在停止給藥后21d內(nèi)，以觀察出現(xiàn)反應(yīng)的可逆性和不可逆性。第五十五頁(yè)，共125頁(yè)。

4．局部作用于直腸、陰道的制劑，進(jìn)行對(duì)作用部位的刺激及局部毒性試驗(yàn)。第五十六頁(yè)，共125頁(yè)。

(三)特殊毒理研究

1．致突變?cè)囼?yàn)根據(jù)受試物的化學(xué)結(jié)構(gòu)、理化性質(zhì)及對(duì)遺傳物質(zhì)作用終點(diǎn)(基因突變和染色體畸變)的不同。要求新藥必須做以下三項(xiàng)試驗(yàn)：第五十七頁(yè)，共125頁(yè)。

(1)微生物回復(fù)突變?cè)囼?yàn)

菌株：組氨酸缺陷型鼠傷寒沙門菌四株(TA97、TA98、TA100、TA102)，亦可采用大腸桿菌(E.Coli)WP2若干株(大腸桿菌試驗(yàn))。第五十八頁(yè)，共125頁(yè)。

劑量選擇：決定受試物最高劑量的標(biāo)準(zhǔn)是細(xì)菌毒性和溶解度。一般最大劑量可達(dá)5mg/皿。受試物至少應(yīng)有5種不同的劑量，否則應(yīng)說(shuō)明選擇劑量的理由。

代謝活化：應(yīng)有誘導(dǎo)劑處理后的哺乳動(dòng)物肝臟微粒體(S9)進(jìn)行體外代謝活化試驗(yàn)，即在加S9混合物和不加S9混合物平行的條件下測(cè)試。

對(duì)照組：用溶媒作陰性對(duì)照，用已知突變?cè)麝?yáng)性對(duì)照。第五十九頁(yè)，共125頁(yè)。

結(jié)果判定：受試物的回復(fù)突變菌落數(shù)的增加與劑量相關(guān)并有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，或至少某一測(cè)試點(diǎn)呈現(xiàn)可重復(fù)的并有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的陽(yáng)性反應(yīng)時(shí)記為陽(yáng)性。第六十頁(yè)，共125頁(yè)。

(2)哺乳動(dòng)物培養(yǎng)細(xì)胞染色體畸變?cè)囼?yàn)

細(xì)胞：哺乳動(dòng)物原代或傳代培養(yǎng)細(xì)胞。

劑量：至少應(yīng)有三種不同劑量，高劑量以50％細(xì)胞生長(zhǎng)抑制濃度為基準(zhǔn)，否則應(yīng)說(shuō)明選擇劑量的理由。

標(biāo)本制作時(shí)間：藥物與細(xì)胞接觸后應(yīng)有適當(dāng)時(shí)間，最好包括整個(gè)細(xì)胞周期，通常在藥物處理后24和48h制作染色體標(biāo)本。第六十一頁(yè)，共125頁(yè)。

代謝活化：應(yīng)用適當(dāng)?shù)拇x活化法。

對(duì)照組：用溶媒作陰性對(duì)照，已知突變?cè)麝?yáng)性對(duì)照。

鏡檢：每種濃度至少觀察100個(gè)中期分裂相細(xì)胞的染色體結(jié)構(gòu)的異常及多倍體的出現(xiàn)率。

結(jié)果判定：受試物誘發(fā)的染色體畸變出現(xiàn)率較陰性對(duì)照有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的增加，并有劑量反應(yīng)關(guān)系時(shí)記為陽(yáng)性，同時(shí)標(biāo)明異常細(xì)胞出現(xiàn)的頻率和種類。第六十二頁(yè)，共125頁(yè)。

(3)體內(nèi)試驗(yàn)：一般選用微核試驗(yàn)，但作用于生殖系統(tǒng)的藥物進(jìn)行顯性致死試驗(yàn)等。第六十三頁(yè)，共125頁(yè)。

1)嚙齒類動(dòng)物微核試驗(yàn)

動(dòng)物：一般用小鼠，每組10只性成熟動(dòng)物(♀♂各半)或至少6只性成熟♂動(dòng)物。

給藥劑量及途徑：至少采用三種劑量，最高劑量以1/2LD50為基準(zhǔn)，腹腔和/或口服一次給藥，必要時(shí)可連續(xù)給藥、否則應(yīng)說(shuō)明選定劑量的理由。

對(duì)照組：用溶媒作陰性對(duì)照，已知能誘發(fā)微核陽(yáng)性的物質(zhì)作陽(yáng)性對(duì)照。第六十四頁(yè)，共125頁(yè)。

標(biāo)本制作：給藥后18~30h或12~72h處死動(dòng)物，取骨髓，離心，涂片，Giemsa染色或吖啶橙染色。

鏡檢：每只動(dòng)物至少觀察計(jì)數(shù)1000個(gè)多染紅細(xì)胞和正染紅細(xì)胞的比率。

結(jié)果判定：微核細(xì)胞出現(xiàn)的頻度與對(duì)照組相比有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的增加，并有劑量反應(yīng)關(guān)系時(shí)，或同一劑量有重復(fù)性并有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義時(shí)記為陽(yáng)性。第六十五頁(yè)，共125頁(yè)。

2)嚙齒類動(dòng)物顯性致死試驗(yàn)

動(dòng)物：性成熟的嚙齒類動(dòng)物，一般采用小鼠。每組至少15只♂鼠。

給藥劑量及途徑：至少采用三種劑量，但在初期評(píng)價(jià)中單劑量或二種劑量即可。高劑量以30d連續(xù)給藥使100％動(dòng)物生存的最大耐受量為基準(zhǔn)?？诜蚋骨蛔⑸淇刹捎靡淮谓o藥，每天給藥一次，連續(xù)給藥5d或連續(xù)給藥6W的方法之一。第六十六頁(yè)，共125頁(yè)。

交配方法：給藥的♂♂動(dòng)物以適當(dāng)?shù)臅r(shí)間間隔依次與未給藥的♀動(dòng)物交配，交配時(shí)間取決于給藥方式，一般一次或連續(xù)給藥5d的動(dòng)物，以最后給藥后6W內(nèi)為交配時(shí)間；連續(xù)給藥6W的動(dòng)物以最后給藥后1W內(nèi)為交配時(shí)間。第六十七頁(yè)，共125頁(yè)。

對(duì)照組：用溶媒作陰性對(duì)照，已知能誘發(fā)顯性致死陽(yáng)性物質(zhì)作陽(yáng)性對(duì)照。但在同一實(shí)驗(yàn)室，對(duì)同一品系的動(dòng)物，可不設(shè)陽(yáng)性對(duì)照。

觀察指標(biāo)：交配的♀動(dòng)物在妊娠后期剖腹，觀察子宮內(nèi)胚胎著床數(shù)，生存胎仔數(shù)，死亡胎仔數(shù)及未著床數(shù)。顯性致死率以DL表示：

DL(100％)＝[1－(試驗(yàn)組妊娠鼠的平均生存胎仔數(shù)/陰性對(duì)照組妊娠鼠的平均生存胎仔數(shù))]×100第六十八頁(yè)，共125頁(yè)。

結(jié)果判定：死亡胎仔數(shù)的增加，胚胎著床總數(shù)的減少，或未著床胚胎數(shù)的增加，生存胎仔總數(shù)減少，這些結(jié)果有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義并有劑量反應(yīng)關(guān)系時(shí)記為陽(yáng)性顯性致死效應(yīng)。

當(dāng)上述三項(xiàng)致突變?cè)囼?yàn)結(jié)果難以下結(jié)論時(shí)，可選擇其他補(bǔ)充試驗(yàn)予以確證。第六十九頁(yè)，共125頁(yè)。

2．生殖毒性試驗(yàn)所用藥物至少應(yīng)有2~3種劑量并設(shè)對(duì)照組。高劑量可產(chǎn)生輕度毒性反應(yīng)，低劑量應(yīng)為人臨床擬用劑量的若干倍。給藥途徑原則上與推薦臨床應(yīng)用的給藥途徑相同，口服制劑應(yīng)用灌胃法。第七十頁(yè)，共125頁(yè)。

(1)一般生殖毒性試驗(yàn)

動(dòng)物：一種或一種以上試驗(yàn)動(dòng)物，如用小鼠或大鼠每組♀♂各20只以上。

給藥時(shí)期：選擇性成熟的動(dòng)物，交配前♂動(dòng)物連續(xù)給藥60d以上，♀動(dòng)物連續(xù)給藥14d?！鈩?dòng)物在確定已經(jīng)交配后繼續(xù)給藥至多數(shù)胚胎器官發(fā)生期。第七十一頁(yè)，共125頁(yè)。

檢查：給藥的♀動(dòng)物與給藥的♂動(dòng)物同籠飼養(yǎng)期限最多2W。必要時(shí)給藥動(dòng)物可以和非給藥動(dòng)物分別交配。已交配的雌性動(dòng)物，推定其妊娠末期及時(shí)解剖，觀察妊娠的確立、胎兒的吸收和死亡及子宮內(nèi)活胎的發(fā)育情況，并進(jìn)行形態(tài)學(xué)檢查(性別、外表及內(nèi)部器官的形態(tài)學(xué)觀察及骨骼透明標(biāo)本的檢查)，必要時(shí)進(jìn)行組織學(xué)和組織化學(xué)的詳細(xì)檢查。給藥的♂動(dòng)物及未交配上的♀鼠均作剖檢，必要時(shí)進(jìn)行病理組織學(xué)檢查。第七十二頁(yè)，共125頁(yè)。

(2)致畸胎試驗(yàn)

動(dòng)物：至少一種動(dòng)物。一般采用小鼠或大鼠，每組15~20只孕鼠，家兔每組8~12只孕兔。

劑量：至少有2~3種劑量。并另設(shè)對(duì)照組，高劑量可有輕度毒性反應(yīng)，低劑量應(yīng)以擬議中的治療量的某些倍量。

給藥途徑：與推薦臨床應(yīng)用的給藥途徑相同，口服制劑應(yīng)用灌胃法。

給藥時(shí)期：胚胎的器官形成期。第七十三頁(yè)，共125頁(yè)。

檢查：全部動(dòng)物在妊娠末期剖檢，觀察妊娠的確立，有無(wú)死胎和吸收胎及子宮內(nèi)活胎的發(fā)育情況，并進(jìn)行形態(tài)學(xué)檢查(性別、外表及內(nèi)部器官的形態(tài)學(xué)觀察及骨骼透明染色標(biāo)本的檢查)，必要時(shí)進(jìn)行組織學(xué)和/或組織化學(xué)的詳細(xì)檢查。第七十四頁(yè)，共125頁(yè)。某些新藥需要觀察其對(duì)子代的影響。動(dòng)物數(shù)相應(yīng)增加孕鼠10只，使其自然分娩，觀察下一代直至成年。檢查新生動(dòng)物的存活、生長(zhǎng)及發(fā)育情況，包括行為、生殖功能和其他異常癥狀。必要時(shí)還可對(duì)給藥的♀動(dòng)物長(zhǎng)期觀察其生殖、受孕、分娩及次子代的情況。第七十五頁(yè)，共125頁(yè)。

結(jié)果處理：將數(shù)據(jù)匯總成表，盡量將全部觀察的結(jié)果采用適當(dāng)?shù)慕y(tǒng)計(jì)學(xué)方法分析及評(píng)價(jià)。第七十六頁(yè)，共125頁(yè)。

(3)圍產(chǎn)期毒性試驗(yàn)

動(dòng)物：小鼠或大鼠，每組15~20只孕鼠，家兔每組8~20只孕兔。

給藥時(shí)期：妊娠后期及整個(gè)泌乳期。

檢查：所有♀動(dòng)物自然分娩，觀察下一代直至成年，檢查其新生后存活、生長(zhǎng)和發(fā)育情況，其中包括行為、生殖功能及其他異常癥狀。必要時(shí)還可對(duì)給藥的♀動(dòng)物長(zhǎng)期觀察其生殖、受孕、分娩及次子代的情況。第七十七頁(yè)，共125頁(yè)。

3．致癌試驗(yàn)在選擇動(dòng)物的種系時(shí)，應(yīng)考慮其對(duì)感染疾患的抵抗性、壽命、自發(fā)腫瘤的頻度系對(duì)致癌物的敏感性。同一藥物的致癌性預(yù)備試驗(yàn)及致癌試驗(yàn)應(yīng)該用同一飼養(yǎng)場(chǎng)飼養(yǎng)的同一種和系的動(dòng)物。嚙齒動(dòng)物的給藥時(shí)間，最好在斷乳后盡早開(kāi)始。第七十八頁(yè)，共125頁(yè)。

(1)致癌試驗(yàn)的預(yù)備實(shí)驗(yàn)：應(yīng)由急性毒性試驗(yàn)決定亞急性毒性試驗(yàn)的最高劑量，由亞急性毒性試驗(yàn)決定致癌試驗(yàn)的最高劑量，此劑量應(yīng)具有：實(shí)驗(yàn)和對(duì)照組之比，體重增長(zhǎng)抑制＜10％；無(wú)中毒死亡動(dòng)物；一般形態(tài)變化不大。第七十九頁(yè)，共125頁(yè)。嚙齒類動(dòng)物每組♀♂各10只，設(shè)三個(gè)試驗(yàn)組及一個(gè)對(duì)照組。給藥途徑應(yīng)與進(jìn)行致癌試驗(yàn)時(shí)準(zhǔn)備采用的途徑一致，連續(xù)給藥90d。對(duì)有慢性蓄積性效應(yīng)的藥物，需延長(zhǎng)給藥期。藥物混入飼料或飲水中給藥的方式，要定期測(cè)定飼料或飲水的消耗量，以推算出藥物的攝取量。第八十頁(yè)，共125頁(yè)。每天觀察動(dòng)物的一般情況，每周測(cè)量動(dòng)物體重，對(duì)死亡動(dòng)物及試驗(yàn)期末的動(dòng)物均需作大體解剖，并作病理解剖記錄。肉眼觀察后，認(rèn)為有病變或可疑病變的臟器進(jìn)行病理組織學(xué)檢查。第八十一頁(yè)，共125頁(yè)。

(2)致癌試驗(yàn)

動(dòng)物：試驗(yàn)組和對(duì)照組動(dòng)物♀♂各50只以上。

劑量：至少應(yīng)有三種以上劑量，一定要有溶媒或賦形劑對(duì)照組。

給藥期：大鼠為24月以上，小鼠、地鼠為18月以上。第八十二頁(yè)，共125頁(yè)。

觀察指標(biāo)：對(duì)所有動(dòng)物每天應(yīng)觀察一般癥狀，開(kāi)始時(shí)每周測(cè)一次體重和攝食量，第13W后，至少每4W測(cè)一次。應(yīng)盡量減少腫瘤以外的死亡率。大鼠在試驗(yàn)24個(gè)月，小鼠、地鼠18個(gè)月時(shí)，各組的存活率不小于50％。試驗(yàn)期末解剖或懷疑有血液疾患時(shí)，最好做末梢血液白細(xì)胞及紅細(xì)胞計(jì)數(shù)。第八十三頁(yè)，共125頁(yè)。如果在試驗(yàn)組和對(duì)照組肉眼觀察到有腫瘤性病變或可疑腫瘤病變時(shí)，則應(yīng)對(duì)以下器官進(jìn)行病理組織學(xué)檢查：皮膚、乳腺、淋巴結(jié)、唾液腺、胸骨、脊椎及大腿骨(含有骨髓)、胸腺、氣管、肺及支氣管、心、甲狀腺及副甲狀腺、舌、食管、胃、十二指腸、大腸、小腸、肝、胰、脾、腎、腎上腺、睪丸、卵巢、性腺及其附屬器官、眼球、腦下垂體、脊髓及其它。第八十四頁(yè)，共125頁(yè)。如果試驗(yàn)組和對(duì)照組均無(wú)肉眼可見(jiàn)的腫瘤性病變，則對(duì)高劑量組的部分動(dòng)物(1/2~1/3)的上述器官進(jìn)行病理組織學(xué)檢查，如發(fā)現(xiàn)有腫瘤病變則需對(duì)全部動(dòng)物進(jìn)行病理組織學(xué)檢查。第八十五頁(yè)，共125頁(yè)。

結(jié)果判斷：符合下列情況之一者判斷為陽(yáng)性：①試驗(yàn)組腫瘤陽(yáng)性，對(duì)照組陰性；②試驗(yàn)組和對(duì)照組均有腫瘤發(fā)生，但試驗(yàn)組腫瘤發(fā)生率高于對(duì)照組；③試驗(yàn)組腫瘤發(fā)生的部位多于對(duì)照組；④試驗(yàn)組和對(duì)照組腫瘤的發(fā)生率雖無(wú)明顯差異，但試驗(yàn)組腫瘤出現(xiàn)早。第八十六頁(yè)，共125頁(yè)。

(3)評(píng)價(jià)：如果在一種動(dòng)物中發(fā)現(xiàn)有明確的致癌作用，預(yù)示對(duì)人可能有致癌潛力。如果在所有動(dòng)物中(最好兩種)都是陰性結(jié)果，則可判為陰性。第八十七頁(yè)，共125頁(yè)。二、藥品臨床前毒性試驗(yàn)★

(一)目的

剔除毒性大的化學(xué)物，找出發(fā)生不良反應(yīng)的靶器官和靶組織，以便在早期臨床試驗(yàn)中注意觀察這些器官和組織的構(gòu)造及功能變化，最好還要找出這些不良反應(yīng)與劑量和療程間關(guān)系，毒性作用是可逆的，還是不可逆的，是可以預(yù)防的，還是不可避免的，如果能證實(shí)毒作用機(jī)制，就可以更精確地預(yù)測(cè)藥品對(duì)人體毒性(但要考慮其不良反應(yīng)是否與超劑量—反應(yīng)的界限，就會(huì)出現(xiàn)與藥理作用范圍內(nèi)的劑量缺乏聯(lián)系的毒性反應(yīng))。第八十八頁(yè)，共125頁(yè)。

(二)試驗(yàn)原則

●單次給藥毒性試驗(yàn)

●重復(fù)給藥毒性試驗(yàn)

●生殖、發(fā)育毒性試驗(yàn)

●致突變?cè)囼?yàn)

●致癌試驗(yàn)

●皮膚過(guò)敏試驗(yàn)

●皮膚光敏性試驗(yàn)第八十九頁(yè)，共125頁(yè)。

1.單次給藥毒性試驗(yàn)

又稱急性毒性，指一次給藥。

目的:一次給予受試物后，從質(zhì)與量?jī)煞矫孀C明其毒性。第九十頁(yè)，共125頁(yè)。動(dòng)物物種選用原則★

①解剖結(jié)構(gòu)、生理生化、化學(xué)物

在體內(nèi)的代謝與人類近似；

②經(jīng)濟(jì)可行；

③有符合試驗(yàn)要求的壽命長(zhǎng)度；

④便于飼養(yǎng)管理。第九十一頁(yè)，共125頁(yè)。常用毒理學(xué)試驗(yàn)的動(dòng)物選擇★

●一般毒性試驗(yàn)常選大鼠、小鼠；

●眼刺激試驗(yàn)常選家兔；

●皮膚刺激試驗(yàn)常選家兔、豚鼠；

●

致敏試驗(yàn)和光敏試驗(yàn)常選豚鼠；

●

生殖發(fā)育毒性試驗(yàn)常選大鼠；

●

致癌試驗(yàn)常選大鼠……

第九十二頁(yè)，共125頁(yè)。

動(dòng)物數(shù)量確定原則

即統(tǒng)計(jì)學(xué)中的樣本含量問(wèn)題，既要符合統(tǒng)計(jì)學(xué)要求，又不致人力、物力、財(cái)力、時(shí)間的浪費(fèi)。第九十三頁(yè)，共125頁(yè)。動(dòng)物性別確定原則

至少一種，♀♂各半。某些特殊試驗(yàn)例外，如致癌試驗(yàn)可只用♂性動(dòng)物。第九十四頁(yè)，共125頁(yè)。

給藥途徑選擇原則★

與人類實(shí)際接觸途徑一致。藥物毒理學(xué)研究給藥途徑同臨床。

但：臨床po、iv，動(dòng)物只iv。第九十五頁(yè)，共125頁(yè)。單次給藥毒性試驗(yàn)動(dòng)物要求：兩種以上，嚙齒類動(dòng)物(每組5只)，非嚙齒類(2只)，要求二級(jí)以上動(dòng)物(即飼養(yǎng)于簡(jiǎn)易屏障系統(tǒng)，無(wú)危害動(dòng)物種群的微生物和寄生蟲(chóng),為我國(guó)當(dāng)前的合格的標(biāo)準(zhǔn)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物)。

性別：至少一種，♀♂各半。第九十六頁(yè)，共125頁(yè)。

途徑：臨床po、iv，動(dòng)物只iv。

劑量：設(shè)計(jì)的劑量組能全面掌握毒性劑量范圍，要求能求出近似致死量足夠的劑量范圍，不一定LD50，非嚙齒類要求能觀察到出現(xiàn)明顯毒性癥狀的劑量范圍，并希望能顯示出劑量—反應(yīng)關(guān)系。(近似致死量：因用動(dòng)物量少，劑距大，求出死亡率只能近似致死量，以xx～xxmg/kg范圍表示)。

觀察期：14d，死亡和存活動(dòng)物均應(yīng)剖檢，異常者要做病理組織學(xué)檢查。第九十七頁(yè)，共125頁(yè)。常用LD50計(jì)算方法

●Horn(霍恩)氏法(又叫平均移動(dòng)法、劑量遞增法)

●寇氏法和改進(jìn)寇氏法

●概率單位法

●序貫法(又叫平均數(shù)法、階梯法、上－下法)

●Bliss法(又叫最大似然性法)第九十八頁(yè)，共125頁(yè)。LD50計(jì)算方法之—Horn氏法簡(jiǎn)介

原理

Horn氏法，又叫平均移動(dòng)法、劑量遞增法，是利用劑量對(duì)數(shù)與死亡率(反應(yīng)率)的轉(zhuǎn)換數(shù)(即幾率單位)呈直線關(guān)系而設(shè)計(jì)的方法。

優(yōu)缺點(diǎn)使用動(dòng)物數(shù)少；可直接從Horn氏表查出LD50及其95％可信限，不需計(jì)算，甚為簡(jiǎn)便。但LD50的95％可信區(qū)間范圍較大，方法精確度尚不夠。第九十九頁(yè)，共125頁(yè)。

Horn氏法設(shè)計(jì)原則★

4個(gè)劑量組；每組動(dòng)物數(shù)相等；每組4只或5只；設(shè)計(jì)劑量時(shí)可根據(jù)化學(xué)物致死劑量范圍的寬窄應(yīng)用兩個(gè)劑量系列，其組距分別為2.15倍和3.16倍。根據(jù)每組動(dòng)物數(shù)、組距和每組動(dòng)物死亡數(shù)，即可從Horn氏表中查得LD50及其95％可信限。

見(jiàn)《MicrosoftPowerPoint－霍恩法.ppt》第一百頁(yè)，共125頁(yè)。

2.重復(fù)給藥毒性試驗(yàn)(包括亞急性和慢性毒性試驗(yàn))

目的：觀察劑量與反應(yīng)的時(shí)間關(guān)系和首次出現(xiàn)的毒性變化及停藥后組織和功能損害的發(fā)展和恢復(fù)情況。

動(dòng)物和性別：同單次給藥毒性試驗(yàn)。

動(dòng)物數(shù)：♀♂各半,每組≥10只(非嚙齒類3只),如實(shí)驗(yàn)中要活殺,則要追加動(dòng)物數(shù)。若毒性試驗(yàn)＞90d,♀♂各20只。

途徑：同臨床。

給藥期：見(jiàn)表1，一般約為臨床試驗(yàn)用藥的3～9倍。第一百零一頁(yè)，共125頁(yè)。表1重復(fù)給藥毒性試驗(yàn)給藥期臨床擬給藥期動(dòng)物試驗(yàn)給藥期(月)單次或連續(xù)1W1＞1W或4W內(nèi)連續(xù)給藥3＞1月或6個(gè)月連續(xù)給藥6＞6個(gè)月或蓄積性12第一百零二頁(yè)，共125頁(yè)。

劑量組別：至少3組(高劑量組有部分動(dòng)物出現(xiàn)毒性反應(yīng)或死亡≯20％)(毒性反應(yīng)劑量、無(wú)毒性反應(yīng)劑量、臨床試用劑量)。對(duì)照組：溶媒對(duì)照,必要時(shí)設(shè)空白、陽(yáng)性對(duì)照。觀察指標(biāo)：①一般狀況：(體重、攝食量、飲水量)；②血、尿常規(guī)；③生理指標(biāo)：如心、視、聽(tīng)等功能；④大體解剖、病理組織學(xué)檢查。第一百零三頁(yè)，共125頁(yè)。

3.生殖、發(fā)育毒性試驗(yàn)將妊娠前到離乳期分為三個(gè)試驗(yàn)階段：①妊娠前及妊娠初期；②胚胎器官形成期；③圍產(chǎn)期及授乳期)。以掌握對(duì)生殖、發(fā)育的影響。要求三個(gè)階段試驗(yàn)動(dòng)物種系要統(tǒng)一，應(yīng)選擇受孕率高、自畸率低、對(duì)陽(yáng)性物敏感的動(dòng)物。第一百零四頁(yè)，共125頁(yè)。

⑴妊娠前及妊娠初期給藥試驗(yàn)

動(dòng)物：大鼠、小鼠任選一種(大鼠胎盤結(jié)構(gòu)更接近人)，♀♂各20只。

給藥途徑：同臨床。

劑量組別：3個(gè)劑量組、對(duì)照組(陽(yáng)性、陰性、比較對(duì)照。后者指化學(xué)結(jié)構(gòu)或藥效與受試物相似的已知物質(zhì))。給藥期：♂出生后40d連續(xù)給藥60d以上，交配，直至交配成立止，♀成熟動(dòng)物14d以連續(xù)給藥后交配，懷孕直到胚胎的器官形成初期為止,大鼠(受孕0～7d)小鼠(0～6d)。試驗(yàn)方法：同致畸試驗(yàn)。觀察身長(zhǎng)、體重及頭顱、肢體等有無(wú)畸形。第一百零五頁(yè)，共125頁(yè)。

⑵胚胎器官形成期給藥試驗(yàn)

動(dòng)物數(shù)：每組孕鼠30只以上。

給藥期：大鼠受孕后7～17d，小鼠6～15d。⑶圍產(chǎn)期及授乳期給藥

動(dòng)物數(shù)：大小鼠每組20只以上。

給藥期：大鼠受孕后17～分娩后21d，小鼠受孕后15～分娩后21d，觀察子代至成年的存活、生長(zhǎng)和發(fā)育(展)情況。第一百零六頁(yè)，共125頁(yè)。

4.致突變?cè)囼?yàn)：

原則上要進(jìn)行：①細(xì)菌回復(fù)突變?cè)囼?yàn)；②培養(yǎng)細(xì)胞的染色體畸變?cè)囼?yàn)；③嚙齒類動(dòng)物的微核試驗(yàn)(體內(nèi)試驗(yàn))。

第一百零七頁(yè)，共125頁(yè)。

5.致癌試驗(yàn)

凡長(zhǎng)期使用的新藥或依其結(jié)構(gòu)和藥理作用懷疑致癌性應(yīng)進(jìn)行試驗(yàn),但對(duì)用于罕見(jiàn)及難治疾病的藥物,并且在臨床使用,利大于弊時(shí),可不受致癌性影響。

⑴試驗(yàn)動(dòng)物：應(yīng)考慮對(duì)疾病抵抗力、壽命、自發(fā)腫瘤發(fā)生率和已知對(duì)致癌性物質(zhì)的敏感性等。

第一百零八頁(yè)，共125頁(yè)。

⑵試驗(yàn)方法：依據(jù)單次給藥和重復(fù)給藥結(jié)果決定劑量。高劑量要求與對(duì)照組比較10％以內(nèi)體重增長(zhǎng)受抑制，但不出現(xiàn)顯著的毒性變化，沒(méi)有中毒死亡，此結(jié)果可以通過(guò)預(yù)試驗(yàn)獲得。

1)動(dòng)物：2種以上，♀♂各半(多用大、小鼠)6W齡以下動(dòng)物(最好同一周齡)。

2)動(dòng)物數(shù)：♀♂各50只。

3)給藥途徑：同臨床。第一百零九頁(yè)，共125頁(yè)。

4)劑量組：應(yīng)設(shè)3組以上：

①高劑量組按上述要求設(shè)劑量，低劑量原則上應(yīng)呈現(xiàn)藥效或根據(jù)臨床擬給藥劑量決定，中間組是高、低劑量的等比中項(xiàng)。

②當(dāng)與臨床治療比較毒性很低時(shí)，高劑量可按臨床擬給藥劑量的100倍設(shè)計(jì)。

③低劑量應(yīng)是高劑量的10％以上，當(dāng)其量顯著偏離臨床擬給藥量時(shí)，可設(shè)計(jì)不足高劑量10％的劑量。

④混入飼料或飲水中給藥(自然經(jīng)口攝入)時(shí)，前三個(gè)月每周測(cè)一次攝入量和飲水量，以后每三個(gè)月測(cè)一次，以計(jì)算受試物攝入量。

第一百一十頁(yè)，共125頁(yè)。

5)對(duì)照組：陰性對(duì)照給受試物溶媒或乳化劑；空白對(duì)照。

6)給藥期：大鼠24～30月,小鼠18～24月，連續(xù)給藥，灌胃給藥可給5d停2d。

7)試驗(yàn)期：大鼠最長(zhǎng)30月,小鼠和倉(cāng)鼠24月,當(dāng)?shù)蛣┝拷M或?qū)φ战M動(dòng)物累積死亡率達(dá)75％時(shí),應(yīng)全部剖殺。實(shí)驗(yàn)期間要求各組存活率≮50％。

8)試驗(yàn)方法：稱體重前3月1次/W，以后每月1次，死亡動(dòng)物及時(shí)剖檢(病理)，實(shí)驗(yàn)結(jié)束應(yīng)剖檢高劑量組，發(fā)現(xiàn)靶器官以便有目的檢查。

第一百一十一頁(yè)，共125頁(yè)。

9)結(jié)果判斷

①試驗(yàn)組腫瘤陽(yáng)性,對(duì)照組陰性(有與無(wú))；

②兩組均有腫瘤,試驗(yàn)組>對(duì)照組(P<0.05)(多與少)；

③試驗(yàn)組腫瘤發(fā)生部位多于對(duì)照組(部位多少)；

④兩組腫瘤發(fā)生率無(wú)差異,試驗(yàn)組出現(xiàn)早(早與晚)。第一百一十二頁(yè)，共125頁(yè)。

6．皮膚過(guò)敏試驗(yàn)(針對(duì)外用藥物)

1)劑型：液體、半固體可直接用，固體應(yīng)用水或溶媒濕潤(rùn)后用。

2)動(dòng)物：豚鼠，每組5只。

試驗(yàn)組：①受試物涂敷組；②陽(yáng)性對(duì)照(1-氯-2,4-二硝基苯)；③陰性對(duì)照(空白、基質(zhì)、乳化劑)。

第一百一十三頁(yè)，共125頁(yè)。

試驗(yàn)步驟

①背部皮膚脫毛(2×4cm)；

②將蒸餾水、受試劑、溶劑0.1ml±對(duì)稱皮內(nèi)注射；

③1W后在皮膚注射部位涂敷月桂醇硫酸鈉(1％凡士林),次日在同一部位帖敷封包0.2ml/0.2mg(液/固)受試物;

④激發(fā)致敏結(jié)束2W后，同一部位帖敷受試物24h；

⑤評(píng)價(jià)：去帖敷后24、48h觀察皮膚反應(yīng),以紅斑、水腫程度、頻率與陽(yáng)性對(duì)照、陰性對(duì)照比較。

第一百一十四頁(yè)，共125頁(yè)。

7．皮膚光敏性試驗(yàn)

方法同皮膚過(guò)敏試驗(yàn)，只是在致敏后3W，于豚鼠背部一側(cè)以錫紙遮光，以10Joales/cm2的紫外線照射。

第一百一十五頁(yè)，共125頁(yè)。

三、藥效試驗(yàn)研究的基本要求

1.掌握藥物的化學(xué)結(jié)構(gòu)和理化特性。

2.以整體動(dòng)物體內(nèi)試驗(yàn)為主，試驗(yàn)動(dòng)物應(yīng)符合國(guó)家規(guī)定的等級(jí)動(dòng)物要求(二級(jí)，即清潔級(jí)動(dòng)物：飼養(yǎng)于簡(jiǎn)易屏障或隔離系統(tǒng)，應(yīng)排除對(duì)動(dòng)物有危害的微生物和寄生蟲(chóng)，即按我國(guó)國(guó)情采用的過(guò)渡級(jí)別。發(fā)達(dá)國(guó)家用三級(jí)，即無(wú)特定病原體動(dòng)物)，必要時(shí)配合體外試驗(yàn)，從不同層次證實(shí)其藥效，充分證實(shí)其主要治療作用以及較重要的其他治療作用。動(dòng)物模型應(yīng)符合治療病征。

第一百一十六頁(yè)，共125頁(yè)。

3.觀測(cè)指標(biāo)：應(yīng)選用特異性強(qiáng)、敏感性高、重現(xiàn)性好、客觀、定量或半定量的指標(biāo)進(jìn)行觀測(cè)，對(duì)實(shí)驗(yàn)方法應(yīng)作詳細(xì)敘述。

4.給藥量及途徑

劑量：應(yīng)設(shè)兩個(gè)組,其中一個(gè)劑量相當(dāng)于臨床劑量的2～5倍(小鼠10～15倍)，大動(dòng)物可僅設(shè)一個(gè)劑量，藥效試驗(yàn)量不應(yīng)高于長(zhǎng)期毒性試驗(yàn)劑量。

途徑：二種，一種與臨床相同。

第一百一十七頁(yè)，共125頁(yè)。

5.對(duì)照藥：

空白對(duì)照：正常及模型動(dòng)物對(duì)照組，必要