疏水層析相互作用

關于疏水層析相互作用第1頁，課件共41頁，創(chuàng)作于2023年2月一、疏水層析的概念及原理

“疏水作用”一詞是Kauzmann于1959年首次在“蛋白質進展”雜志中提出的，隨后陸續(xù)有學者發(fā)表用疏水層析成功分離蛋白質的文獻報道；如鈣調蛋白、苯丙氨酸裂解酶、凝集素等。（一）疏水層析的來歷及概念

1972年，ErelZ.等人將不同鏈長的α，ω—二胺同系物鍵合在瓊脂糖上，以不同pH的含鹽緩沖液作流動相成功純化了糖原磷酸化酶，開始確立了疏水層析在分離純化某些疏水蛋白質、肽類等生物大分子的重要作用。

疏水層析的原理完全不同于離子交換層析或凝膠過濾層析等技術，使該技術與后兩者經常聯(lián)合使用來分離復雜的生物樣品；

目前該技術主要應用領域是在蛋白質的純化方面，成為血清蛋白、膜結合蛋白、核蛋白、受體、重組蛋白等，以及一些藥物分子，甚至細胞等分離時的有效手段。第2頁，課件共41頁，創(chuàng)作于2023年2月

（二）原理

疏水層析是利用被分離組分分子表面的疏水微區(qū)、（可逆）變性后暴露出的疏水殘基，或在高鹽環(huán)境下暴露于分子表面的疏水殘基與固定相的疏水性配體之間的作用強弱，依次用從高至低離子強度洗脫液可將疏水作用由弱到強的組分分離開。高濃度鹽與水分子發(fā)生強烈作用，導致疏水分子周圍形成空穴的水分子減少，促進疏水性分子與介質的疏水配基之間發(fā)生結合。第3頁，課件共41頁，創(chuàng)作于2023年2月高濃度鹽與水分子發(fā)生強烈作用，導致疏水分子周圍形成空穴的水分子減少，促進疏水性分子與介質的疏水配基之間發(fā)生結合基質疏水配基疏水補丁第4頁，課件共41頁，創(chuàng)作于2023年2月疏水相互作用的機制A.高離子強度環(huán)境下（高鹽濃度），疏水性樣品分子結合在填料上。B.隨著鹽濃度降低，結合的樣品分子按照疏水性強弱洗脫下來第5頁，課件共41頁，創(chuàng)作于2023年2月二、疏水層析過程

介質的選擇樣品的準備層析條件的優(yōu)化

第6頁，課件共41頁，創(chuàng)作于2023年2月（一）、介質（基質+配基）的選擇

基質主要有多糖類如瓊脂糖、纖維素和人工合成聚合物類如聚苯乙烯、聚丙烯酸甲酯類。其中，半剛性的瓊脂糖類凝膠仍是應用最廣泛的疏水介質。近年來研制超大(superporous)瓊脂糖，在擴散孔的基礎上增加了對流孔，在流速較高的條件下獲較好的分辨率。殼聚糖具有良好的生物相容性和化學穩(wěn)定性，近年來在疏水層析中也得到了應用第7頁，課件共41頁，創(chuàng)作于2023年2月

HIC介質的疏水配基主要為烷基和芳香基，與反相層析介質相比，其烷基通常在C8以下，芳香基多為苯基。

R代表疏水配基，M代表基質。調節(jié)兩種反應物的比例可控制介質的配基密度第8頁，課件共41頁，創(chuàng)作于2023年2月偶聯(lián)至基質的常見配基類型（A）丁基，（B）辛基，（C）苯基，（D）新戊基

第9頁，課件共41頁，創(chuàng)作于2023年2月

對某些蛋白而言，上述有些配基與其結合力太強，為洗脫有時需用有機溶劑，有變性風險；具中等疏水的高分子配基(如聚乙二醇和聚丙二醇等)不僅可提供足夠的結合力，且避免了上述缺點。第10頁，課件共41頁，創(chuàng)作于2023年2月常用的疏水層析介質⒈O(jiān)ctylSepharose4FastFlow(辛基瓊脂糖凝膠4FF)

工作pH范圍為3-13,清洗pH范圍為2-14,工作的最大速度是600cm/h,載量為每ml填料結合50μmol正辛烷基，疏水性中等，適合各種蛋白的分離和純化。⒉ButylSepharose4FastFlow(丁基瓊脂糖凝膠4FF)工作pH范圍為3-13，清洗pH范圍為2-14，工作的最大速度是600cm/h,載量為每ml填料結合50umol正丁烷基，疏水性最弱，適合含脂族配體的生物分子。第11頁，課件共41頁，創(chuàng)作于2023年2月⒊PhenylSepharose6FastFlow(苯基瓊脂糖凝膠4FF)

疏水性最強，載量高，適合含芳香族配體的生物分子的預處理，載量為每ml填料結合40umol苯基，工作pH范圍為3-13，清洗pH范圍為2-14，工作的最大速度是600cm/h。⒋PhenylSepharoseCL-4B(苯基瓊脂糖凝膠CL-4B)

疏水性較Octyl弱，適用于分離和純化對疏水性尚未了解的蛋白，載量為每ml填料結合40umol苯基；工作pH范圍為3-13，清洗pH范圍為2-14，工作的最大速度是50cm/h。第12頁，課件共41頁，創(chuàng)作于2023年2月在HIC中，應選機械強度較大的剛性基質；若待分離物質分子量很大，且樣品量較大，則應選大孔基質，如瓊脂糖凝膠；若待分離物質較小，或樣品量很小，但分辨率的要求高，則可選孔徑小的基質甚至非孔型基質。HIC介質中，烷基配基的鏈長大多在C4～C8之間，苯基的疏水性大致與戊基相當，因與溶質發(fā)生π-π相互作用，它與戊基有不同的選擇性，而寡聚乙二醇固定相的疏水性介于丁基與苯基之間。第13頁，課件共41頁，創(chuàng)作于2023年2月不同的介質對同一樣品有不同的分離效果：第14頁，課件共41頁，創(chuàng)作于2023年2月填料的篩選試驗

試管法篩選填料1.取6支試管，標號1，2，3，4，5，6；2.取不同的填料，分裝于6支離心管中；3.向裝了填料的試管中加入樣品；4.混勻，離心，分別檢測6支試管上清的樣品活性；5.選擇目的蛋白結合效果最好的填料。123456管號各種填料的試管分別向各試管中加入樣品第15頁，課件共41頁，創(chuàng)作于2023年2月預裝柱篩選法試驗流程：1.平衡緩沖液：50mM磷酸鹽、PH7.0，再加入硫酸銨。2.洗脫緩沖液：50mM磷酸鹽、PH7.0。3.樣品準備:往樣品中添加適量濃度的硫酸銨，使樣品溶液中的鹽濃度與平衡緩沖液中基本一致，并調節(jié)樣品溶液的pH。（后將介紹樣品準備的硫酸銨沉淀法）4.用1ml/min的流速，5-10個CV的平衡緩沖液平衡柱子。5.用1ml/min的流速上樣，上樣過程中收集穿透液。選取不同填料的1ml的預裝柱進行試驗第16頁，課件共41頁，創(chuàng)作于2023年2月6.上完樣后以1ml/min的流速，繼續(xù)用平衡緩沖液沖洗直到紫外、電導基線平穩(wěn)（至少5個CV），過程中收集洗脫物。7.用洗脫緩沖液以1ml/min的流速進行洗脫，洗3-5個CV，收集洗脫峰。8.檢測每一個預裝柱洗脫下來的洗脫峰的純度及含量。

選擇目的蛋白能夠結合并且洗脫下來效果最好的填料，如果進行梯度洗脫，選擇選擇性和分辨率最好的填料第17頁，課件共41頁，創(chuàng)作于2023年2月基本原理

硫酸銨沉淀法可用于從大量粗制劑中濃縮和部分純化蛋白質。用此方法可以將主要的免疫球蛋白從樣品中分離，是免疫球蛋白分離的常用方法。高濃度的鹽離子在蛋白質溶液中可與蛋白質競爭水分子，從而破壞蛋白質表面的水化膜，降低其溶解度，使之從溶液中沉淀出來。各種蛋白質的溶解度不同，因而可利用不同濃度的鹽溶液來沉淀不同的蛋白質。這種方法稱之為鹽析。鹽濃度通常用飽和度來表示。硫酸銨因其溶解度大，溫度系數(shù)小和不易使蛋白質變性而應用最廣。（二）、樣品準備（即樣品處理）----實例試劑耗材及設備硫酸銨沉淀法-----抗體的純化1.血清；2.硫酸銨飽和溶液:硫酸銨800g~850g加水1000ml，加熱至絕大部分溶質溶解為止，趁熱過濾，置室溫過夜，然后以28％NH4OH調pH至7.0；3.0.01mol/LpH7.4PBS溶液；用0.10mol/LNaH2PO4溶液和0.10mol/LNa2HPO4溶液按一定比例混合；4.透析袋；5.高速冷凍離心機；6.PH計。第18頁，課件共41頁，創(chuàng)作于2023年2月實驗過程1.取20ml血清，加生理鹽水20ml，再逐滴加入（NH4)2SO4飽和溶液10ml，使成20%（NH4)2SO4溶液，邊加邊攪拌，充分混合后，靜置30min。2.40C、3000r/min離心20min，棄去沉淀，以除去纖維蛋白。3.在上清液中再加（NH4)2SO4飽和溶液30ml，使成為50%（NH4)2SO4溶液，充分混合，靜置30min。4.40C、3000r/min離心20min，棄上清。5.于沉淀中加20ml生理鹽水，使之溶解，再加（NH4)2SO4飽和溶液10ml，使成為33%（NH4)2SO4溶液，充分混合后，靜置30min。6.40C、3000r/min離心20min，棄上清，以除去白蛋白。重復步驟5，2~3次。7.用10ml生理鹽水溶解沉淀，裝入透析袋。8.透析除鹽，在純水中透析過夜，再在生理鹽水中于4℃透析24h，中間換液數(shù)次。9.透析液中的鹽可以使用脫鹽柱SephadexTMG-25除去。第19頁，課件共41頁，創(chuàng)作于2023年2月（三）、層析條件的優(yōu)化緩沖體系和PH的選擇離子強度的選擇其他鹽的選擇洗脫方式的選擇第20頁，課件共41頁，創(chuàng)作于2023年2月

疏水層析緩沖液中的pH對整個分離的影響不大，一般調至中性（6－8）左右.溶液的pH值主要考慮能維持生物大分子生物活性的pH環(huán)境，而且蛋白質結合疏水填料的能力一般在pH6-8下沒有什么變化。當溶液的pH接近蛋白質的等電點時，其疏水性增加，有利于與配基結合。（若緩沖液的PH為蛋白的PI，則蛋白易發(fā)生沉淀）1.緩沖體系和PH的選擇：PH的選擇第21頁，課件共41頁，創(chuàng)作于2023年2月緩沖體系的選擇試管法篩選緩沖體系向各試管中加入不同的緩沖體系管號12341.取4支試管，標號1，2，3，4；2.配置不同的緩沖體系如Tris-Hcl、PBS、NaAc-HAc、檸檬酸-檸檬酸鈉等；3.向4支試管中加入2中配制的不同緩沖體系；4.混勻，靜置2h后檢測4支試管中樣品活性及穩(wěn)定性；5.選擇活性及穩(wěn)定性最好的緩沖體系。實驗過程

未知樣品建議使用的緩沖液：起始緩沖液：1.5M硫酸銨，50mM

PBS，PH7.0洗脫緩沖液：50mM

PBS，PH7.0第22頁，課件共41頁，創(chuàng)作于2023年2月如同填料選擇一樣，疏水相互作用層析中鹽的選擇也是不斷嘗試的過程，因為每種鹽在促進疏水相互作用方面的能力都不同，隨著鹽濃度的增加，結合的蛋白幾乎隨著線性增加，直到一個特殊的鹽濃度，然后隨著鹽濃度的增加，結合的蛋白呈指數(shù)形式增加

在實踐中，鈉、鉀或銨的硫酸鹽具有有效的促進了疏水相互作用層析中配基和蛋白的相互作用，并且對蛋白結構具有穩(wěn)定作用。因此，最通常使用的鹽是硫酸銨、硫酸鈉、氯化鈉、氯化鉀和醋酸銨。2.鹽的選擇

建議：1.在給定的濃度下，和其他鹽相比，硫酸銨能夠給出最好的分辨率，可以使用的最高濃度是2M。2.3M的鹽濃度通常需要使用氯化鈉3.硫酸鈉是一種非常好的鹽析試劑，但是在高濃度下，蛋白不是穩(wěn)定定。4.硫酸銨不推薦在PH8.0下使用第23頁，課件共41頁，創(chuàng)作于2023年2月下圖顯示的是不同的鹽如何影響選擇性的.按出峰順序依次為：細胞色素C、溶菌酶、核糖核酸酶A，ａ-糜蛋白酶原第24頁，課件共41頁，創(chuàng)作于2023年2月3.離子強度的選擇在所使用的鹽的種類確定的前提下，鹽濃度的高低會影響溶質分子與介質的結合強度及介質的結合容量。蛋白質的疏水性吸附作用隨緩沖液的離子強度提高而增加，因此HIC通常在略低于鹽析點的鹽濃度上樣吸附，而洗脫時逐漸降低洗脫液的離子強度。下圖為不同離子強度對蛋白分離的選擇性的影響：在這個例子中，目的蛋白是最后一個洗脫峰。在（a）中，目的蛋白在較窄的區(qū)域洗脫，容易造成雜質和目的蛋白一起被洗脫下來；在（b）中，此時在上一次使用較高鹽濃度運行過程中結合的雜蛋白現(xiàn)在在初始的洗脫階段洗脫，剩下目的蛋白結合著，降低了雜質和目的蛋白一起洗脫下來的風險，并且增加了柱子對目的蛋白的載量；（c）圖,由于初始鹽濃度較低，樣品在上樣的過程中結合的不夠緊，導致在洗脫過程中洗脫峰顯著的展寬。第25頁，課件共41頁，創(chuàng)作于2023年2月離子強度確定方法試管法123456管號↓↓↓↓↓↓2.0M1.5M1.0M0.5M0.1M0.05M鹽以硫酸銨為例加入各濃度的硫酸銨實驗過程：1.取六支試管，標號為1，2，3，4，5，6；2.向6支試管中加入含不同濃度硫酸銨的平衡緩沖液；3.向各試管中加入樣品；4.混勻，靜置30-60min；5.取上清，檢測上清液中蛋白含量及純度；6.選擇目的蛋白剛好完全結合而雜質不結合或結合很少的鹽濃度。第26頁，課件共41頁，創(chuàng)作于2023年2月預裝柱法實驗過程：1.配置含有不同濃度硫酸銨（0.05M-2M）的平衡緩沖液；2.1ml/min的流速，用5-10個CV的平衡緩沖液（含2M的硫酸銨）平衡柱子；3.用1ml/min的流速上樣，收集穿透液；4.1ml/min的流速，至少用5個CV的起始緩沖液（含2.0M的硫酸銨）繼續(xù)平衡柱子直到紫外、電導基線平穩(wěn)；5.1ml/min的流速，用3-5個CV的洗脫緩沖液洗脫，收集洗脫峰；6.重復2-5步驟，每次將上述步驟2中的平衡緩沖液改為含1.5M硫酸銨的平衡緩沖液。直到使用含有0.05M硫酸銨的起始緩沖液；7.分析所有的洗脫峰，檢測純度和結合到柱子上的量；8.確定能夠讓目的蛋白結合而雜蛋白流出的鹽濃度。確定需要使目的蛋白完全洗脫下來的最低的鹽濃度。使用1ml的預裝柱第27頁，課件共41頁，創(chuàng)作于2023年2月4.洗脫方式的選擇

結合的蛋白可以通過控制降低鹽濃度來洗脫。根據(jù)分離的目的可以選擇線性梯度洗脫或者逐步洗脫。（1）線性梯度洗脫：1.高分辨率的分離或分析；2.確定逐步洗脫的條件；3.在保持需要的分辨率條件下可用增加流速來優(yōu)化梯度洗脫。

線性梯度洗脫是最常用的洗脫方式：當從一個未知的樣品開始時，通常使用線性梯度洗脫，盡可能的讓各種組分結合在填料上，然后分別洗脫下來看總的蛋白圖樣。隨著緩沖液中鹽濃度的降低，疏水相互作用也會逐漸減弱，結合的物質開始被洗脫。特點

用10-30個柱體積進行梯度洗脫，增加洗脫緩沖液的比例，直到鹽濃度達到最低即無鹽緩沖液。第28頁，課件共41頁，創(chuàng)作于2023年2月（2）逐步洗脫：洗脫步驟：第一步，洗脫緩沖液的鹽濃度和體積經過優(yōu)化來洗脫所有和柱子結合能力比目的蛋白弱的的物質，注意，鹽濃度和緩沖液體積應該足夠大，以用來洗脫結合弱的雜質，但是一定不能低于目的蛋白開始共同洗脫出峰的水平。（例如目的蛋白被洗脫出峰的鹽濃度為1.2M,則洗脫緩沖液的鹽濃度應高于1.2M）第二步，鹽濃度降低到目的蛋白洗脫的水平。注意，鹽濃度應該足夠低來洗脫目的蛋白而不過分稀釋，但是濃度又必須保持高于一定水平以防止結合的雜質被共同洗脫。第三步，鹽濃度進一步降低來洗脫殘余的雜質，這一步可以直接用無鹽緩沖液。第四步，柱子用起始緩沖液平衡，為下一步做準備。

最多用5個柱體積的洗脫緩沖液（鹽濃度低于起始緩沖液的濃度）洗脫結合蛋白，重復，降低每一步的鹽濃度，直到目的蛋白被洗脫下來。

當疏水層析作用已經用線性梯度洗脫優(yōu)化過了，轉換到逐步洗脫可以降低分離所用的總柱體積數(shù)，有助于加快分離時間，減少緩沖液消耗，而且保持需要的純度，這種類型的逐步洗脫通常用于常規(guī)的、大規(guī)模的分離。

特點第29頁，課件共41頁，創(chuàng)作于2023年2月5.其他

一般柱溫升高，生物大分子的構象會發(fā)生變化，疏水作用增加，吸附能力增加，有利于提高層析柱的分離度，所以有時可以通過提高柱溫來增加疏水基團與配基間的相互作用，分離性質相近的化合物，如對分離一些小分子是非常有效的。但是對于具有生物活性的物質或酶類，在高溫條件下易變性失活，因此不宜在高溫條件下進行分離。一般都在常溫或低溫下操作。

如下圖說明了樣品、起始和洗脫緩沖液、柱子、層析設備在相同溫度的重要性。兩次分離都在室溫（23度），相同的條件下（除了樣品溫度在23或4度)進行。所有的組分都在同一溫度時，目的蛋白結合了，然后在梯度的中間被洗脫，而樣品的溫度在4度時，目的蛋白在穿透中洗脫。（1）.柱溫第30頁，課件共41頁，創(chuàng)作于2023年2月根據(jù)分離階段的不同，流速也不一樣。如在平衡、洗滌、再平衡的過程中可以稍微提高流速；在上樣和線性洗脫或時建議使用低流速，以免流穿或分離不開。（2）.流速（3）.上樣量第31頁，課件共41頁，創(chuàng)作于2023年2月三、應用蛋白類（包括酶）、肽類的分離

鈣調蛋白的純化疏水作用層析法純化抗乙肝病毒核心抗原單克隆抗體第32頁，課件共41頁，創(chuàng)作于2023年2月牛皮層骨中純化酸性磷酸酶：ABCD（A）CM-Sepharose陽離子交換層析，（B）磷酸纖維素親和層析，（C）SephacrylS-200凝膠過濾層析，（D）Phenyl-Sepharose疏水作用層析

第33頁，課件共41頁，創(chuàng)作于2023年2月鈣調蛋白純化過程1.除去填料中的乙醇后，以50%（m/v）濃度懸于10mmol/LTris-HclPH8.0,1mmol/LMgCL2，

2mmol/LEDTA,1mmol/Lａ-巰基乙醇（E液）---50mmol/LNacl,1mmol/L尿素的溶液中;2.層析柱（2.5cm*10cm，裝40ml填料）：用3-5個CV的10mmol/LTris-HclPH8.0,1mmol/LMgCL2，2mmol/LEDTA,1mmol/Lａ-巰基乙醇（F液），進行平衡；3.將離子交換層析分離好的鈣調蛋白，用F液透析后，補加固體CaCl2于樣品（終濃度為1mmol/L,，確保鈣離子處于飽和狀態(tài)，并有效的與固定相結合），接著上樣；4.用2-4CV的含0.2mol/LNaCl的F液進行洗脫，以除去吸附力弱的雜質及與鈣調蛋白結合的一些蛋白；5.用含0.2mol/LNaCl的E液進行洗脫，使有效成分解離（EDTA對Ca2+有較大的親和力，Mg2+可置換柱中Ca2+）；6.即可得到較為純的雞胗鈣調蛋白。

鈣調蛋白的外形似啞鈴,有兩個球形的末端,中間被一個長而富有彈性的螺旋結構相連,每個末端有兩個Ca2+結構域,每個結構域可以結合一個Ca2+,這樣,一個鈣調蛋白可以結合4個Ca2+,鈣調蛋白與Ca2+結合后的構型相當穩(wěn)定。苯基-SepharoseCL-4B第34頁，課件共41頁，創(chuàng)作于2023年2月疏水作用層析法純化抗乙肝病毒核心抗原單克隆抗體目的:采用疏水作用層析法純化小鼠腹水來源的抗乙肝核心抗原(HBcAg)單克隆抗體(mAb),并對分離條件進行優(yōu)化。方法:

采用不同疏水層析介質、溶液pH和NaCl濃度,研究其對抗體吸附的影響,以及分析不同的洗脫方式和洗脫體積對抗體洗脫的影響,并用ELISA法檢測純化后抗體的活性。結果:疏水作用層析法純化小鼠腹水來源的抗HB2cAgmAb(IgG1)的最適條件是以pH7.0、20mmol/LPB+1.2mol/L(NH4)2SO4為上樣緩沖液,采用1.2～0mol/L(NH4)2SO4,12CV梯度進行洗脫,獲得的mAb純度大于75%,回收率達80%,純化后mAb的活性保持良好。結論:采用疏水作用層析對mAb進行純化,并優(yōu)化了各步實驗條件,為建立具有抗體純度高、生物學活性好、易于放大的抗HBcAg的mAb的純化方法提供了必要的實驗基礎第35頁，課件共41頁，創(chuàng)作于2023年2月

近年來，隨著層析技術的發(fā)展，與HIC相關的其它層析技術也得到了發(fā)展，主要有以下兩種：

1）親硫性疏水層析(thio—philicchromatography)

2）疏水電荷誘導層析(HCIC)