第十章酶的定向進(jìn)化詳解演示文稿

第十章酶的定向進(jìn)化詳解演示文稿目前一頁(yè)\總數(shù)二十九頁(yè)\編于十八點(diǎn)優(yōu)選第十章酶的定向進(jìn)化目前二頁(yè)\總數(shù)二十九頁(yè)\編于十八點(diǎn)一、自然進(jìn)化與定向進(jìn)化達(dá)爾文在《物種起源》中提出以自然選擇為基礎(chǔ)的進(jìn)化學(xué)說(shuō)，成為生物學(xué)史上的一個(gè)轉(zhuǎn)折點(diǎn)。1、自然進(jìn)化

（1）環(huán)境壓力下物種朝著適應(yīng)生存環(huán)境的方向發(fā)展；（2）漫長(zhǎng)時(shí)間里通過(guò)DNA復(fù)制發(fā)生突變或通過(guò)重組，產(chǎn)生了遺傳多樣性；（3）自發(fā)、非常緩慢、自然選擇；目前三頁(yè)\總數(shù)二十九頁(yè)\編于十八點(diǎn)2、定向進(jìn)化是達(dá)爾文的進(jìn)化論思想在核酸、肽或蛋白等分子水平上的延伸和應(yīng)用。它不需要深入了解蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)功能關(guān)系，在實(shí)驗(yàn)室條件下人工模擬生物大分子自然進(jìn)化過(guò)程，在體外對(duì)基因進(jìn)行隨機(jī)誘變，使基因發(fā)生大量變異，并定向選擇出所需性質(zhì)的突變體，從而可以在短時(shí)間內(nèi)實(shí)現(xiàn)自然界幾百萬(wàn)年才能完成的進(jìn)化過(guò)程。人為引發(fā)、較短時(shí)間、人為選擇。目前四頁(yè)\總數(shù)二十九頁(yè)\編于十八點(diǎn)3、定向進(jìn)化的一般過(guò)程細(xì)菌誘變500C培養(yǎng)突變體庫(kù)選擇壓力（溫度）溫度耐受型突變體最適生長(zhǎng)溫度為370C目前五頁(yè)\總數(shù)二十九頁(yè)\編于十八點(diǎn)4、酶定向進(jìn)化的意義酶作為生物催化劑其專一性和高效性是一般催化劑所不能比擬的，但是天然酶的許多性質(zhì)不適應(yīng)工業(yè)生產(chǎn)的條件。選擇特殊環(huán)境，利用酶定向進(jìn)化技術(shù)重新設(shè)計(jì)及改進(jìn)酶分子的結(jié)構(gòu)和性質(zhì)，可以逐步接近和滿足將酶催化用于工業(yè)生產(chǎn)的需要。目前六頁(yè)\總數(shù)二十九頁(yè)\編于十八點(diǎn)二、理論來(lái)源利用基因工程原理在實(shí)驗(yàn)室中模擬生物進(jìn)化過(guò)程

待進(jìn)化酶基因的PCR擴(kuò)增反應(yīng)中，利用TaqDNA多聚酶不具有3′→5′校對(duì)功能的性質(zhì)，配合適當(dāng)條件，以很低的比率向目的基因中隨機(jī)引入突變，構(gòu)建突變庫(kù)，憑借定向的選擇方法，選出所需性質(zhì)的優(yōu)化酶(或蛋白質(zhì))，從而排除其他突變體?；瘜W(xué)進(jìn)化生物進(jìn)化目前七頁(yè)\總數(shù)二十九頁(yè)\編于十八點(diǎn)是蛋白質(zhì)工程的新策略主要是利用分子生物學(xué)手段，在分子水平創(chuàng)造分子的多樣性，在事先不了解酶的空間結(jié)構(gòu)和催化機(jī)制的情況下，人為地創(chuàng)造特殊的進(jìn)化條件，模擬自然進(jìn)化機(jī)制（隨機(jī)突變、基因重組和自然選擇），在體外改造酶基因，并定向選擇（或篩選）出所需性質(zhì)的突變酶。是一種在生物體體外快速模擬達(dá)爾文進(jìn)化的、具有一定目的性和快速改造蛋白質(zhì)的方法，相對(duì)于傳統(tǒng)的蛋白質(zhì)的“理性設(shè)計(jì)”，酶的分子定向進(jìn)化屬于蛋白質(zhì)的非合理設(shè)計(jì)。三、定向進(jìn)化概念定向進(jìn)化=隨機(jī)突變+正向重組+選擇（或篩選）目前八頁(yè)\總數(shù)二十九頁(yè)\編于十八點(diǎn)定向進(jìn)化的過(guò)程（1）通過(guò)隨機(jī)突變和(或)基因體外重組創(chuàng)造基因多樣性；（2）導(dǎo)入適當(dāng)載體后構(gòu)建突變文庫(kù)；（3）通過(guò)靈敏的篩選方法，選擇陽(yáng)性突變子。這個(gè)過(guò)程可重復(fù)循環(huán)，直至得到預(yù)期性狀的酶。目前九頁(yè)\總數(shù)二十九頁(yè)\編于十八點(diǎn)20世紀(jì)60年代利用RNA噬菌體進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，是第一次在分子水平上定向改造單一分子。SolSpiegelman第二節(jié)酶分子定向進(jìn)化的歷史目前十頁(yè)\總數(shù)二十九頁(yè)\編于十八點(diǎn)1981年，B.G.Hall等定向改變E.coliK12中ebg酶的底物專一性，開(kāi)發(fā)出對(duì)幾種糖苷鍵有水解能力的酶。1993年，Arnold研究組提出易錯(cuò)PCR的方法。1994年，Stemmer將DNA重組方法引用到酶分子的定向進(jìn)化中。1999年，Stemmer等把DNA改組延伸到族改組。目前十一頁(yè)\總數(shù)二十九頁(yè)\編于十八點(diǎn)

第三節(jié)定向進(jìn)化的選擇策略

隨機(jī)突變策略易錯(cuò)PCR、DNA改組和外顯子改組、體外隨機(jī)引發(fā)重組、交錯(cuò)延伸、定位誘變篩選——采用回交法目前十二頁(yè)\總數(shù)二十九頁(yè)\編于十八點(diǎn)1、易錯(cuò)PCR(error-pronePCR)通過(guò)改變PCR反應(yīng)條件，使擴(kuò)增的基因出現(xiàn)少量堿基錯(cuò)配，從而導(dǎo)致目的基因的隨機(jī)突變?？刂艱NA的突變頻率。不足之處：靶序列長(zhǎng)度一般在0.5-1.0kb，應(yīng)用范圍有限；中性突變較多；且較為耗時(shí)、費(fèi)力；獲得的DNA序列中堿基的轉(zhuǎn)換高于顛換。此法突變具有一定的密碼偏向性。目前十三頁(yè)\總數(shù)二十九頁(yè)\編于十八點(diǎn)連續(xù)易錯(cuò)PCR(Sequentialerror-pronePCR)將一次PCR擴(kuò)增得到的有益突變基因作為下一次PCR擴(kuò)增的模板，連續(xù)反復(fù)進(jìn)行隨機(jī)誘變，使得每一次獲得的少量突變累積而產(chǎn)生重要的有益突變。目前十四頁(yè)\總數(shù)二十九頁(yè)\編于十八點(diǎn)2、DNA改組1994年，Stemmer在Nature發(fā)表了一篇題為《RapidevolutionofaproteininvitrobyDNAshuffling》的文章，首次提出了DNA改組(DNAshuffling)技術(shù)。Stemmer以β-內(nèi)酰胺酶系統(tǒng)為試驗(yàn)對(duì)象，用DNA改組，經(jīng)過(guò)三輪篩選和兩次回交得到一新菌株，其頭孢噻肟(Cefotaxime)的最低抑制濃度比原始菌株提高了32,000倍，也遠(yuǎn)高于易錯(cuò)PCR的突變篩選結(jié)果。目前十五頁(yè)\總數(shù)二十九頁(yè)\編于十八點(diǎn)DNA改組是DNA分子的體外重組，是基因在分子水平上有性重組。通過(guò)改變單個(gè)基因(或基因家族)原有核苷酸序列，創(chuàng)造新基因，并賦予表達(dá)產(chǎn)物以新功能。是一種分子水平上的定向進(jìn)化。因此也稱為分子育種。DNA改組的效果必須由改組后的基因表達(dá)產(chǎn)物的功能來(lái)驗(yàn)證。因此，靈敏可靠的篩選方法是DNA改組技術(shù)成功與否的關(guān)鍵。目前十六頁(yè)\總數(shù)二十九頁(yè)\編于十八點(diǎn)DNA改組原理DNaseI產(chǎn)生隨機(jī)片段；隨機(jī)片段變性；隨機(jī)片段復(fù)性；4.延伸反復(fù)重復(fù)步后，可獲得全長(zhǎng)DNA片段2-4。目前十七頁(yè)\總數(shù)二十九頁(yè)\編于十八點(diǎn)DNA改組步驟：（1）目的DNA片段的獲得；（2）目的基因的隨機(jī)片段化，即將目的基因（可以是單個(gè)基因或一組相關(guān)基因）酶切成隨機(jī)片段，這些隨機(jī)片段集合包含了來(lái)自不同的同源序列的寡核苷酸，這些寡核苷酸具有不同的3’末端；（3）無(wú)引物PCR，具有互補(bǔ)3’末端的寡核苷酸互為引物，各為模板，通過(guò)不斷的PCR循環(huán)，在不同模板上隨機(jī)互補(bǔ)進(jìn)一步延伸；（4）有引物PCR，以上輪無(wú)引物PCR的產(chǎn)物為模板，加入基因兩端序列為引物，經(jīng)過(guò)多輪PCR得到重排產(chǎn)物的集合為突變文庫(kù)；（5）克隆、篩選、分析及多輪篩選，即進(jìn)一步對(duì)突變文庫(kù)進(jìn)行篩選，選擇改良的突變體組成下一輪改組的模板，重復(fù)上述步驟進(jìn)行多次重排和篩選，最終獲得性狀比較理想的突變體。目前十八頁(yè)\總數(shù)二十九頁(yè)\編于十八點(diǎn)單個(gè)DNA改組技術(shù)原理示意圖(a)單個(gè)基因目前十九頁(yè)\總數(shù)二十九頁(yè)\編于十八點(diǎn)（b)基因家族改組技術(shù)(familyshuffling)Crameri等于1998年首次提出“DNA家族改組”的概念。他們發(fā)現(xiàn)，采用傳統(tǒng)的DNA改組方法雖然能完成定向進(jìn)化的目的，但其中隨機(jī)產(chǎn)生的多為點(diǎn)突變，且有益突變頻率低，導(dǎo)致篩選工作艱巨且進(jìn)展緩慢。DNA家族改組是以來(lái)自不同種屬的同源基因作為重排對(duì)象進(jìn)行DNA改組操作的技術(shù)。該技術(shù)打破不同種、屬間的遺傳界限,利用同源基因之間的同源序列進(jìn)行DNA改組。特點(diǎn)：顯著加速有益突變的累積，易于實(shí)現(xiàn)目的蛋白多種特性的共進(jìn)化。目前二十頁(yè)\總數(shù)二十九頁(yè)\編于十八點(diǎn)1、需要有一個(gè)含有各種不同正突變的基因組庫(kù)(例如:通過(guò)經(jīng)典的誘變育種得到目的性狀發(fā)生改進(jìn)的不同的正突變菌株，就構(gòu)成了所需的基因組庫(kù))；2、通過(guò)原生質(zhì)體融合將這些正突變菌株的全基因組進(jìn)行隨機(jī)重組；3、篩選目的性狀得到進(jìn)一步改進(jìn)的菌株來(lái)進(jìn)行下一輪基因組改組；4、循環(huán)多輪隨機(jī)重組。目前二十一頁(yè)\總數(shù)二十九頁(yè)\編于十八點(diǎn)與常規(guī)突變技術(shù)相比，DNA改組有以下顯著優(yōu)點(diǎn)：①DNA改組可在短時(shí)間內(nèi)通過(guò)重組有效的突變體發(fā)掘所有可能的重組體與突變序列，從而大大加快進(jìn)化速度；而且對(duì)可操作的靶序列沒(méi)有任何要求，長(zhǎng)度可以達(dá)到幾十kb；②通過(guò)多輪篩選或選擇，可使有益突變迅速積累，導(dǎo)致功能的明顯提高；③DNA改組從表型上早期進(jìn)行選擇，而不必了解DNA片斷上序列的信息，簡(jiǎn)化了操作程序；④DNA改組比隨機(jī)突變顯著提高了良性突變的概率。研究表明，DNA改組比隨機(jī)突變具有較大的優(yōu)勢(shì)，隨機(jī)突變的方法一般產(chǎn)生1%的良性突變，但DNA改組可產(chǎn)生13%的良性突變。目前二十二頁(yè)\總數(shù)二十九頁(yè)\編于十八點(diǎn)DNA改組與常規(guī)定向進(jìn)化的比較目前二十三頁(yè)\總數(shù)二十九頁(yè)\編于十八點(diǎn)3、體外隨機(jī)引發(fā)重組法

(random-priminginvitrorecombination,RPR)以單鏈DNA為模板，配合一套隨機(jī)序列引物，先產(chǎn)生大量互補(bǔ)于模板不同位點(diǎn)的短DNA片段，由于堿基的錯(cuò)配和錯(cuò)誤引發(fā)，這些短DNA片段中也會(huì)有少量的點(diǎn)突變，在隨后的PCR反應(yīng)中，它們互為引物進(jìn)行合成，伴隨組合，再組裝成完整的基因長(zhǎng)度。反復(fù)進(jìn)行上述過(guò)程，直到獲得滿意的進(jìn)化酶性質(zhì)。目前二十四頁(yè)\總數(shù)二十九頁(yè)\編于十八點(diǎn)該法優(yōu)于DNA改組法的特點(diǎn)在于:(1)RPR可以利用單鏈DNA為模板，可10~20倍地降低親本DNA量；(2)在DNA改組中，片段重新組裝前必須徹底除去；DNaseⅠ，故RPR方法更簡(jiǎn)單;(3)合成的隨機(jī)引物具有同樣長(zhǎng)度，無(wú)順序傾向性。在理論上，PCR擴(kuò)增時(shí)模板上每個(gè)堿基都應(yīng)被復(fù)制或以相似的頻率發(fā)生突變；(4)隨機(jī)引發(fā)的DNA合成不受DNA模板長(zhǎng)度的限制。目前二十五頁(yè)\總數(shù)二十九頁(yè)\編于十八點(diǎn)4、交錯(cuò)延伸方法：PCR反應(yīng)中把常規(guī)的退火和延伸合并為一步，縮短其反應(yīng)時(shí)間，從而只能合成出非常短的新生鏈，經(jīng)變性的新生鏈再作為引物與體系內(nèi)同時(shí)存在的不同模板退火而繼續(xù)延伸。反復(fù)進(jìn)行，直到產(chǎn)生完整的基因長(zhǎng)度，結(jié)果產(chǎn)生間隔的含不同模板序列的新生DNA分子。特點(diǎn)：重組發(fā)生在單一試管中，不需分離親本DNA和產(chǎn)生的重組DNA。目前二十六頁(yè)\總數(shù)二十九頁(yè)\編于十八點(diǎn)第四節(jié)定向進(jìn)化的應(yīng)用一、提高酶分子的催化活力二、提高酶分子的穩(wěn)定性三、提高底物的專一性和增加對(duì)新底物催化活力的進(jìn)化五、對(duì)映體選擇性的定向進(jìn)化目前二十七頁(yè)\總數(shù)二十九頁(yè)\編于十八點(diǎn)一、提高酶分子的催化活力酶活的高低反映一個(gè)生物催化與轉(zhuǎn)化過(guò)程反應(yīng)速率的快慢，酶活越高，反應(yīng)速率越快，反之則反應(yīng)速率越慢。因此，實(shí)現(xiàn)較高的酶活是企業(yè)一直追求的目標(biāo)。L—天冬氨酸酶定向進(jìn)化研究進(jìn)行4輪易錯(cuò)PCR，篩選了3000個(gè)菌落。得到酶活力提高28倍的突變體，該酶的pH穩(wěn)定性和熱穩(wěn)定性均優(yōu)于天然酶目前二十八頁(yè)\總數(shù)二