上海市臨檢中心 PCR培訓(xùn)課件 6、Thermo-芯片數(shù)字PCR技術(shù)及質(zhì)量控制

芯片數(shù)字PCR技術(shù)及質(zhì)量控制房孝良FieldApplication

SpecialistThe

world

leader

inserving

scienceProprietary

&Confidential主要內(nèi)容?

1.

芯片數(shù)字PCR的技術(shù)原理介紹?

2.

芯片數(shù)字PCR實驗的質(zhì)控介紹2Proprietary

&ConfidentialPCR

進化/革命Performance第二代/實時熒光定量PCR第三代/數(shù)字PCR第一代/普通PCR3Proprietary

&Confidential什么是數(shù)字PCR-DigitalPCRWhy

do

we

divide

andhow

do

weconquer分，有什么好處？4Proprietary

&Confidential芯片數(shù)字PCR原理vol.96no.

16

Bert

Vogelstein,

9236–9241,doi:10.1073/pnas.96.16.92365Proprietary

&Confidential芯片數(shù)字PCR原理Digital

PCR是一種基于單分子模版PCR擴增，無需使用標(biāo)準曲線，通過對陽性PCR反應(yīng)和陰性PCR反應(yīng)的計數(shù)來計算樣品核酸的絕對數(shù)目，從而達到定量的分析方法反應(yīng)體系準備微分化PCR擴增數(shù)據(jù)分析6Proprietary

&Confidential芯片數(shù)字PCR原理?

納升級別的加樣體積?

1cm2芯片上20,000

個反應(yīng)孔?

反應(yīng)孔彼此獨立60

μMQuantStudio?

3DDigital

PCR20KChip7Proprietary

&Confidential數(shù)字PCR的優(yōu)勢Absolute

Quantification絕對定量SpecificityPrecisionSensitivity更靈敏更特異更精確Many

countingevents

meanshighaccuracySingle

molecule

detectionExquisite

discrimination微量核酸樣本檢測稀有突變檢測精確定量8Proprietary

&Confidential芯片數(shù)字PCR系統(tǒng)組成芯片加樣器ProFlex?

2xflatPCR儀芯片讀取儀PCR儀底座芯片托架芯片及Master

Mix9Proprietary

&Confidential芯片數(shù)字PCR工作流程

工作流程簡單

密封系統(tǒng)密閉系統(tǒng)

自動化程度高，極少的手動操作讀取（30S）配反應(yīng)液上樣擴增10Proprietary

&Confidential芯片數(shù)字PCR的特點20,000個物理分割反應(yīng)孔快速簡單的工作流程密閉的反應(yīng)系統(tǒng)較小的體積足夠多的數(shù)據(jù)量保證理想結(jié)果的獲得最少的手工操作，縮短實驗時間。杜絕污染f有利于實驗室內(nèi)的擺放和移動。一個樣品/一個耗材彈性的規(guī)格11Proprietary

&Confidential數(shù)字PCR系統(tǒng)主要應(yīng)用參照/標(biāo)準品的定量稀有突變分析低含量病原體檢測病毒載量的分析NGS文庫定量分析高精度拷貝數(shù)變異GMO檢測NGS測序結(jié)果驗證12Proprietary

&Confidential循環(huán)游離DNA(cfDNA)是最易獲得的液體活檢靶標(biāo)液體活檢靶標(biāo)??CirculatingTumorCell(CTC，循環(huán)腫瘤細胞)Cell-free

DNA(cfDNA，循環(huán)游離DNA)?Exosomes

(外泌體)Crowley

E,et

al.(2013)

Liquid

biopsy:

monitoring

cancergenetics

intheblood.

Nat

RevClinOnc10:

472–484.13Proprietary

&Confidential基于數(shù)字PCR平臺的液體活檢解決方案早期診斷治療方案選擇療效監(jiān)控復(fù)發(fā)監(jiān)控(Screening)腫瘤患者疾病周期LiquidbiopsysampleLiquidbiopsysampleSolidtumorsample血液樣本3

weeks

為周期取樣，3-6個月為周期取樣血液樣本、手術(shù)樣本及術(shù)后三天樣本持續(xù)6-8輪?

高靈敏度?

低價?

中等靈敏度?

價格適中?

高靈敏度?

低價?

最高靈敏度?

低價市場需求適用平臺?

NGS(largepan-?

一代測序：組織?

NGS(0.1%to

1%

LOD)：組織

&血液?

數(shù)字PCR?

NGS(0.1%LOD)?PCR數(shù)字cancerpanels)?

NGS(0.1%LOD)?

數(shù)字PCR*PiperJaffray,The2015

Liquid

Biopsy

Report,

September201514Proprietary

&ConfidentialForResearchUse

Only.

Not

for

usein

diagnosticprocedures諾禾致源、南京科維思、泛生子已獲得QS

3D的CFDA認證

三家聯(lián)合報證，均取得CFDA認證

諾禾致源：EGFR

T790M

科維思：EGFR19外顯子缺失、L858R與T790M；HER2擴增；ALK融合

泛生子：EGFR、KRAS、PIK3CA、NRAS、BRAF、C-KIT、PDGFRA等熱點突變；HER2擴增；MET擴增15Proprietary

&Confidential芯片數(shù)字PCR實驗質(zhì)控介紹檢測流程：16Proprietary

&Confidential芯片數(shù)字PCR實驗質(zhì)控介紹建議的抽血管類型：K2EDTA

(preferred),

StreckCell-FreeDNA

BloodCollection

Tubes

(BCT)

StreckCell-Free

DNA

BCT

管中的血液樣本在6~37℃環(huán)境下可以穩(wěn)定儲存7天；

EDTA

的抗凝管中的血液樣本在18~25℃環(huán)境下儲存不超過4小時。17Proprietary

&Confidential芯片數(shù)字PCR實驗質(zhì)控介紹

分離完的血漿樣本應(yīng)立即提取，否則應(yīng)放入-20℃冰箱中保存，保存時間不超過7

天。2000xg4°C

10minTransfer16000

xg4°C

10minTransfer

觀察分離后的血漿，如果血漿顏色為淡黃色，證明樣本無溶血，可以進入下一步提取流程，如果血漿呈粉紅色或者紅色，說明出現(xiàn)溶血，不可進行后續(xù)操作18Proprietary

&Confidential芯片數(shù)字PCR實驗質(zhì)控介紹

熒光計Qubit?3.0Fluorometer（Q33216）對cfDNA

進行濃度的檢測

推薦使用Agilent

2200

Tapestation

系統(tǒng)對cfDNA

進行純度的檢測

不推薦使用Nanodrop對cfDNA

進行濃度的檢測

主要片段應(yīng)分布為170bp~200bp，無大片段基因組DNA

的污染

提取純化完成的cfDNA于-20±5℃保存，保存時間不超過30天。19Proprietary

&Confidential芯片數(shù)字PCR實驗質(zhì)控介紹密閉系統(tǒng)配反應(yīng)液微分化PCR擴增數(shù)據(jù)讀取

質(zhì)量控制點：模板上樣量不要超過數(shù)字PCR的檢測量程，液體活檢推薦30ng

作為質(zhì)量控制的重要環(huán)節(jié)，每次實驗同時檢測陽性對照品（PC）、陰性對照品（NC）20Proprietary

&Confidential芯片數(shù)字PCR實驗質(zhì)控介紹密閉系統(tǒng)配反應(yīng)液微分化PCR擴增數(shù)據(jù)讀取

利用微分化工具，將前一步的PCR反應(yīng)體系分成2萬個獨立微反應(yīng)體系，每天微反應(yīng)體系包含有PCR正常進行的成分

質(zhì)量控制點：任何微分化工具都需要在上樣的時候避免產(chǎn)生氣泡。21Proprietary

&Confidential芯片數(shù)字PCR實驗質(zhì)控介紹密閉系統(tǒng)配反應(yīng)液微分化PCR擴增數(shù)據(jù)讀取

需要對微反應(yīng)體系進行PCR擴增，這一步轉(zhuǎn)移到普通PCR儀器上

質(zhì)量控制點：PCR的反應(yīng)條件建議在qPCR儀器上進行優(yōu)化22Proprietary

&Confidential芯片數(shù)字PCR實驗質(zhì)控介紹密閉系統(tǒng)配反應(yīng)液微分化PCR擴增數(shù)據(jù)讀取

PCR擴增完后，需要對每個微反應(yīng)的熒光信號進行讀取。

質(zhì)量控制點：陽性微反應(yīng)孔的熒光信號要明顯高于陰性熒光信號23Proprietary

&Confidential液態(tài)活檢數(shù)字PCR實驗質(zhì)控介紹

芯片圖標(biāo)顯示綠旗和黃旗，則表示滿足數(shù)據(jù)分析的要求，顯示紅旗則表示不能滿足數(shù)據(jù)分析的要求；

將FA

M閾值設(shè)定到7600，VIC閾值由系統(tǒng)自動生成，必要時也可手動調(diào)整；24Proprietary

&Confidential液態(tài)活檢數(shù)字PCR實驗質(zhì)控介紹

陽性對照品：FAM、VIC

區(qū)域均有熒光信號，且FAM

區(qū)域熒光信號個數(shù)≥5（圖1）

陰性對照品