基因克隆與表達(dá)

蛋白原核表達(dá)

衛(wèi)文強(qiáng)

2015.12基因克隆與表達(dá)

目的基因-T表達(dá)載體酶切，膠回收，連接轉(zhuǎn)化到克隆用細(xì)胞（Top10)

提質(zhì)粒，酶切驗(yàn)證轉(zhuǎn)化到表達(dá)用細(xì)胞（BL21（DE3)）誘導(dǎo)表達(dá)

SDS基因克隆與表達(dá)DNA中的雜質(zhì)如蛋白質(zhì)、酚、氯仿、乙醇、SDS、EDTA等都會(huì)影響酶的活性。1）.DNA的純度影響限制性內(nèi)切酶活性的因素2）.DNA的甲基化程度dam甲基化酶（修飾GATC中的A）；dcm甲基化酶（修飾CCA/TGG的C）?；蚩寺∨c表達(dá)3）.溫度

不同的限制性內(nèi)切酶的最適反應(yīng)溫度不同。大多數(shù)是37oC，少數(shù)要求40-65oC。是影響限制酶活性的重要因素。4）.緩沖液(Buffer)商品化的限制酶一般都帶有專用緩沖液。MgCl2、NaCl/KCl：提供Mg2+和離子強(qiáng)度；Tris-HCl：維持pH；二硫蘇糖醇（DTT）：保持酶穩(wěn)定性；牛血清白蛋白BSA等：有助于酶的穩(wěn)定；β－巰基乙醇：保持酶的穩(wěn)定性，防止酶失活?；蚩寺∨c表達(dá)用時(shí)在冰上操作；取酶用干燥、滅菌、新的槍頭酶用量不能超過(guò)酶切總體積的10%；多種酶進(jìn)行酶切時(shí)，先低鹽后高鹽緩沖液；關(guān)心小貼士告訴你使用時(shí)注意事項(xiàng)：基因克隆與表達(dá)連接、轉(zhuǎn)化與重組子鑒定1、連接基因克隆與表達(dá)（1）必須是兩條雙鏈DNA。（2）DNA3’端有游離的-OH，

5’端有一個(gè)磷酸基團(tuán)（P）。（3）需要能量動(dòng)物或噬菌體中：ATP大腸桿菌中：NAD+（2）.連接條件基因克隆與表達(dá)

ATP：反復(fù)凍熔，ATP活性降低，ATP溶解度不高，連接緩沖液宜分裝；單價(jià)離子：150-200mMNaCl，提高連接效果；

PEG：5%以下可以提高連接效率連接效果最好在37℃，但形成的互補(bǔ)不穩(wěn)定;最佳連接溫度：12-16℃，較好的連接效果，互補(bǔ)又較穩(wěn)定;2）連接溫度：3）反應(yīng)液中的成分：基因克隆與表達(dá)目的或作用：4）插入片段與載體的濃度比例載體DNA與外源DNA的分子摩爾比通常為1﹕3左右，甚至1﹕10或更高。增加插入片段與載體的接觸機(jī)會(huì)，減少載體自我連接的現(xiàn)象?；蚩寺∨c表達(dá)

化學(xué)法（CaCl2法)：轉(zhuǎn)化原理：是Ca2+與細(xì)菌外膜磷脂在低溫下形成液晶結(jié)構(gòu)，后者經(jīng)熱脈沖發(fā)生收縮作用，使細(xì)胞膜出現(xiàn)空隙，質(zhì)?；駾NA重組分子便可進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)（感受態(tài)細(xì)胞）。2、轉(zhuǎn)化基因克隆與表達(dá)影響轉(zhuǎn)化率的主要影響因素:載體本身的性質(zhì)及其空間構(gòu)象：超螺旋構(gòu)象轉(zhuǎn)化率最高；插入片段的大?。翰迦肫卧酱?，轉(zhuǎn)化效率越低；受體細(xì)胞的類型及預(yù)處理；轉(zhuǎn)化方法：電擊法高于化學(xué)法?；蚩寺∨c表達(dá)ROPROISalIBamHITcrPvuIPstIPstIEcoRIClaIHindIIIHindIIBalIAprpBR3224363bpori限制性酶切圖譜法3、轉(zhuǎn)化子的篩選和鑒定基因克隆與表達(dá)質(zhì)粒DNA的提取基因組DNA質(zhì)粒DNA質(zhì)粒具有自主復(fù)制和轉(zhuǎn)錄能力，能在子代細(xì)胞中保持恒定的拷貝數(shù)，并表達(dá)所攜帶的遺傳信息。質(zhì)粒(Plasmid)是一種染色體外的穩(wěn)定遺傳因子，大小從1-200kb不等，為雙鏈、閉環(huán)的DNA分子，并以超螺旋狀態(tài)存在于宿主細(xì)胞中?；蚩寺∨c表達(dá)ⅰ質(zhì)粒DNA提取方法：堿裂解法、煮沸法、SDS法等ⅱ

堿裂解法原理：

在堿性條件下，雙連DNA氫鍵斷裂，結(jié)構(gòu)破壞變性，環(huán)狀超螺旋質(zhì)粒不充分變性。在中性條件下變性質(zhì)?；謴?fù)原來(lái)構(gòu)型，而線性大分子細(xì)菌DNA不能復(fù)性呈不溶物而經(jīng)離心除去?；蚩寺∨c表達(dá)ⅲ抽提出質(zhì)粒的構(gòu)型：1）超螺旋質(zhì)粒DNA:在提取質(zhì)粒過(guò)程中，超螺旋DNA占大部分。2）開環(huán)質(zhì)粒DNA：如果質(zhì)粒DNA兩條鏈中有一條鏈發(fā)生一處或多處斷裂，分子就能旋轉(zhuǎn)而消除鏈的張力，形成松馳型的環(huán)狀分子，稱開環(huán)DNA。3）線狀質(zhì)粒DNA：如果質(zhì)粒DNA的兩條鏈在同一處斷裂，則形成線狀DNA?；蚩寺∨c表達(dá)抽提出的質(zhì)粒三種構(gòu)型電泳結(jié)果：1）開環(huán)

2）線狀

3）超螺旋+-電泳方向基因克隆與表達(dá)凝膠電泳技術(shù)電泳目的：對(duì)核酸分子進(jìn)行分離和檢測(cè)基因克隆與表達(dá)?凝膠分辨DNA的能力：

瓊脂糖聚丙烯酰胺凝膠濃度分辨范圍(kb)濃度分辨范圍(bp)0.3%5-603.51000-20000.6%1-20590-500

0.7%0.8-108.060-400

0.9%0.5-71240-200

1.2%0.4-61525-1601.5%0.2-3206-100凝膠濃度:濃度大，篩孔小，適合小分子電泳；濃度小，篩孔大，適合大分子電泳凝膠濃度的選擇：取決于待檢測(cè)的DNA的大小原來(lái)如此！基因克隆與表達(dá)電泳緩沖液

pH值：偏堿性，帶負(fù)電荷

離子濃度：離子濃度高電流大發(fā)熱快膠溶解種類：TAE（Tris+EDTA+醋酸）:電流大，易產(chǎn)生離子富集TBE

（Tris+EDTA+硼酸）:緩沖能力最強(qiáng)TPE（Tris+EDTA+磷酸）:緩沖能力低TNE（Tris+EDTA+醋酸鈉）基因克隆與表達(dá)pET表達(dá)載體基因克隆與表達(dá)基因克隆與表達(dá)基因克隆與表達(dá)基因克隆與表達(dá)pET表達(dá)載體的啟動(dòng)子是T7噬菌體基因10啟動(dòng)子（T7啟動(dòng)子），需要T7RNA聚合酶才能轉(zhuǎn)錄。T7RNA聚合酶轉(zhuǎn)錄機(jī)制十分有效并具有選擇性：充分誘導(dǎo)時(shí)，幾乎所有的細(xì)胞資源都用于表達(dá)目的蛋白；在非誘導(dǎo)條件下，幾乎可以使目的基因完全處于沉默而不轉(zhuǎn)錄。T7RNA聚合酶基因插入由大腸桿菌lacUV5啟動(dòng)子控制、λDE3溶原狀態(tài)下的大腸桿菌染色體上?；蚩寺∨c表達(dá)T7表達(dá)系統(tǒng)轉(zhuǎn)錄調(diào)控的機(jī)理

化學(xué)誘導(dǎo)型噬菌體DE3是

l噬菌體的衍生株，一段含有l(wèi)acI、lacUV5

啟動(dòng)子和T7RNA聚合酶基因的

DNA片段被插入其

int基因中

用噬菌體DE3的溶源菌作為表達(dá)載體的宿主菌，調(diào)控方式為

化學(xué)誘導(dǎo)型，類似于Lac表達(dá)系統(tǒng)。

T7RNA聚合酶基因

lac

啟動(dòng)子E.Coli（DE3）T7啟動(dòng)子

目的基因T7RNA

聚合酶IPTG誘導(dǎo)基因克隆與表達(dá)BL21:lon,ompT

BL21(DE3):T7polymeraseRosetta:optimalcodonsOrigami:thioredoxinreductase(trxB),glutathionereductase(gor)Rosetta-gami

OrigamiB:(IPTGconcentrationdependent)菌株種類基因克隆與表達(dá)基本原理

SDS技術(shù)是根據(jù)SDS能使蛋白質(zhì)變性解聚成肽鏈并與肽鏈側(cè)鏈以一定比例結(jié)合成SDS—肽鏈復(fù)合體，從而掩蓋了肽鏈本身所帶電荷（SDS帶負(fù)電），并消除了蛋白質(zhì)分子間的形狀差異，再結(jié)合PAGE技術(shù)（根據(jù)分子的形狀、電荷、分子量綜合差異來(lái)分離不同分子的技術(shù)）來(lái)分離不同分子量蛋白質(zhì)或測(cè)定定蛋白質(zhì)分子量的實(shí)驗(yàn)技術(shù)?；蚩寺∨c表達(dá)基本步驟制備分離膠制備濃縮膠上樣并電泳凝膠板剝離與染色脫色結(jié)果分析基因克隆與表達(dá)加入分離膠溶液pH8.8封水出現(xiàn)明顯界面時(shí)，分離膠凝聚完成（３０min~１h）倒出水，并用濾紙吸干制備分離膠封水的目的是使分離膠上表面平直，并排除氣泡。凝膠聚合好的標(biāo)志是膠與水層之間形成清晰的界面?；蚩寺∨c表達(dá)分離膠pH8.8加入濃縮膠溶液pH6.8制備濃縮膠樣梳需一次平穩(wěn)插入,梳口處不得有氣泡,梳底需水平。插入樣品梳基因克隆與表達(dá)加入電極緩沖液pH8.3濃縮膠pH6.8通電分離膠pH8.8加入樣品上樣及電泳開始電壓恒定在80V，當(dāng)進(jìn)入分離膠后改為120V，溴酚藍(lán)距凝膠邊緣約5mm時(shí)，停止電泳?；蚩寺∨c表達(dá)凝膠板剝