植病研究法細(xì)菌病害的研究法

關(guān)于植病研究法細(xì)菌病害的研究法第1頁，課件共57頁，創(chuàng)作于2023年2月第一節(jié)植物病原細(xì)菌的鑒定1．細(xì)菌病害標(biāo)本的檢查(1)癥狀的觀察植物細(xì)菌病害表現(xiàn)各種類型的癥狀，不同屬的細(xì)菌侵染植物后引起的癥狀有所不同。棒形桿菌屬細(xì)菌主要引起萎蔫，假單胞菌屬細(xì)菌主要引起葉斑和葉枯（少數(shù)枝枯、蔫萎和軟腐），黃單胞菌屬細(xì)菌主要引起葉斑和葉枯，土壤桿菌屬細(xì)菌主要引起瘤腫（少數(shù)其他畸形），歐文氏菌屬細(xì)菌主要引起軟腐（少數(shù)蔫萎和枝枯）。這樣的區(qū)分雖然不是絕對的，但是指出它們之間的關(guān)系，在診斷上是很有意義的。許多細(xì)菌性病害的病斑帶有水漬狀，有時可以作為診斷的特征，但并不是所有細(xì)菌病害都是這樣。病部有時有菌膿排出。菌膿灰白色到黃色，珠狀或其他形狀，干燥后在表面形成菌膜。第2頁，課件共57頁，創(chuàng)作于2023年2月第二節(jié)病原細(xì)菌的分離培養(yǎng)植物病原細(xì)菌一般都是用稀釋分離法。病原細(xì)菌在組織中的數(shù)量很大，稀釋培養(yǎng)可以使病原細(xì)菌與雜菌分開，形成分散的菌落，容易分離得到純培養(yǎng)。組織分離法對病原細(xì)菌是不適用的，原因是它不能使病原細(xì)菌與雜菌分開，雜菌生長快，會抑制病原細(xì)菌的生長。稀釋分離有以下兩種方法。第3頁，課件共57頁，創(chuàng)作于2023年2月1.培養(yǎng)皿稀釋分離法

取滅菌的培養(yǎng)皿3個，每個培養(yǎng)皿中加滅菌水0.5ml，切取約4mm見方的小塊病組織，經(jīng)過表面消毒和滅菌水洗過3次以后，移在第一個培養(yǎng)皿的水滴中。用滅菌的玻棒將病組織研碎，靜置10～15min，使組織中的細(xì)菌流入水中(配成懸浮液)，然后用滅菌的移植環(huán)從第一個培養(yǎng)皿中移植3環(huán)到第二個培養(yǎng)皿中，充分混合后再移植3環(huán)到第三個培養(yǎng)皿中。然后，將溶化的瓊膠培養(yǎng)基冷卻到45℃左右，倒在三個培養(yǎng)皿中。冷卻凝固后，將培養(yǎng)皿翻轉(zhuǎn)，在適溫下培養(yǎng)。培養(yǎng)皿用記號筆注明分離材料、日期和稀釋編號。第4頁，課件共57頁，創(chuàng)作于2023年2月細(xì)菌懸浮液的配法有時影響分離的效果。一般植物病原細(xì)菌，用滅菌水稀釋是適宜的。有時改用滅菌的生理食鹽水(0.85%的NaCl)或肉汁凍培養(yǎng)液稀釋比較好。如水稻白葉枯病細(xì)菌，用蛋白胨水或粘土懸浮液稀釋的，培養(yǎng)后形成菌落的數(shù)目比用清水稀釋的多。粘土的作用大致是細(xì)菌團(tuán)聚在土粒上，更容易形成菌落。第5頁，課件共57頁，創(chuàng)作于2023年2月第6頁，課件共57頁，創(chuàng)作于2023年2月2.平板劃線分離法

取小塊病組織，經(jīng)過表面消毒和滅菌水洗過2次以后，放在滅菌載玻片上的滅菌水中，用滅菌玻棒研碎。靜置一定時間，用滅菌的移植環(huán)蘸取以上組織液在瓊膠平板上劃線培養(yǎng);先在平板的一側(cè)順序劃3～5條線，再將培養(yǎng)皿轉(zhuǎn)60°將移植環(huán)滅菌后,從第二條線末端，順序劃出3-5條線。目的都是使細(xì)菌分開形成分散的菌落。

第7頁，課件共57頁，創(chuàng)作于2023年2月劃線分離法的關(guān)鍵是要等到瓊膠平板表面的冷凝水完全消失后才能劃線，否則細(xì)菌將在冷凝水中流動而影響形成單個分散的菌落。為了加快消除冷凝水，可以將培養(yǎng)皿在37℃的溫箱中放一二天，或者在無菌的條件下，將培養(yǎng)皿的蓋打開，翻轉(zhuǎn)培養(yǎng)皿斜靠在蓋上，在50℃的干燥箱中干燥30min。第8頁，課件共57頁，創(chuàng)作于2023年2月第9頁，課件共57頁，創(chuàng)作于2023年2月植物病原細(xì)菌的分離還需注意：

[1]分離材料新鮮

要從新鮮的標(biāo)本和新的病斑分離。存放太久的標(biāo)本，其中病原細(xì)菌的生活力減弱，而腐生性細(xì)菌則滋長很快，從這種組織分離到的大都是腐生菌。分離用的標(biāo)本最好是夾在吸水紙中郵寄，放在塑料袋中保濕是不適宜的。

標(biāo)本保存的時間較長而不容易直接分離成功，可以經(jīng)過接種后再分離.例如，分離軟腐病細(xì)菌時，由于腐爛組織中往往雜有大量的腐生菌，可以挑取少許腐爛組織針刺接種在相應(yīng)的健全組織上，發(fā)病以后再從接種的組織上分離。第10頁，課件共57頁，創(chuàng)作于2023年2月[2]適宜的培養(yǎng)基

分離失敗的原因，有時是由于培養(yǎng)基不適宜。一般來說，寄生性細(xì)菌對培養(yǎng)基的要求要比腐生性細(xì)菌嚴(yán)格。同時，一種適宜于純培養(yǎng)的培養(yǎng)基(細(xì)菌群集沒有其他雜菌干擾)，不一定適宜于分離(細(xì)菌分散而單獨(dú)存在，同時還可能有雜菌干擾)。因此，分離時要選用適當(dāng)?shù)呐囵B(yǎng)基，有時要用選擇性培養(yǎng)基。但有時失敗的原因不是培養(yǎng)基的成分不適宜，而是由于培養(yǎng)基的酸度不適當(dāng)或存放的時間太長。因此，在滅菌后和使用前，最好是再核對一下培養(yǎng)基的酸度。

第11頁，課件共57頁，創(chuàng)作于2023年2月二、分離培養(yǎng)基（1）通用培養(yǎng)基:NA培養(yǎng)基（2）屬和種的選擇性培養(yǎng)基[1]土壤桿菌屬(Agrobacterium)一般是用甘露糖醇培養(yǎng)基

甘露糖醇15g硝酸鈉(NaNO3)5g硝酸鈣[Ca(NO3)z·4Hz0320mg磷酸氫二鉀(K2HPO4)2g氯化鋰(LiCl)6g硫酸鎂(MgSO4·7H20)0.2g溴百里酚藍(lán)0.1g瓊膠15g蒸餾水1000ml

滅菌后酸度是pH7.2，培養(yǎng)基呈深藍(lán)色。土壤桿菌屬細(xì)菌的菌落圓形、凸起、發(fā)亮，最初淺藍(lán)色，以后深綠色。溴百里酚藍(lán)抑制革蘭氏反應(yīng)陽性的細(xì)菌，氯化鋰抑制假單胞菌屬細(xì)菌。以上培養(yǎng)基，已有選擇性培養(yǎng)基的作用，以甘露糖醇作為碳源是它的特點(diǎn)。第12頁，課件共57頁，創(chuàng)作于2023年2月[2]假單胞菌屬(Pseudomonas)沒有特殊的營養(yǎng)要求，許多培養(yǎng)基都可用于分離。常用的培養(yǎng)基有：①甘油酪朊水解物培養(yǎng)基

甘油10ml蔗糖10g酪朊水解物1g氯化銨(NH4c1)5g磷酸氫二鈉(Na2HPO4)2.3g硫酸十二烷基鈉0.6g瓊膠15g蒸餾水1000ml|pH值6.8由于培養(yǎng)基中含有十二烷基硫酸鈉，已經(jīng)有一定的選擇性。②金氏培養(yǎng)基B(King‘smediumB)，分離有熒光的假單胞菌

蛋白胨20.0g甘油10.0g磷酸氫二鉀(K2HPO4)1.5g硫酸鎂(MgSO4·7H2O)1.5g瓊膠15.0g蒸餾水1000mlpH7.2。

熒光假單胞菌在培養(yǎng)基中產(chǎn)生可擴(kuò)散的青或褐色的色素，紫外線照射顯示青到藍(lán)色。此培養(yǎng)基也可用于歐文氏菌屬(Erwinia)細(xì)菌的分離。第13頁，課件共57頁，創(chuàng)作于2023年2月③Kelmen(1954)TTC培養(yǎng)基：

蛋白胨10.0g酪朊水解物1.0g葡萄糖5.0g瓊膠15.0g蒸餾水1000mlpH7.0分裝100ml，滅菌后。加過濾滅菌的1%2，3，5一氯化三苯基四氮唑(TTC)的水溶液到滅菌冷卻到55℃的培養(yǎng)基中，使?jié)舛茸詈筮_(dá)到0.005%。青枯菌P.solanacearum

培養(yǎng)2天后，致病力強(qiáng)的野生型菌落白色，或中間有一淡紅色點(diǎn)的菌落；致病力弱或喪失致病力的菌落深紅色，邊緣帶藍(lán)色。第14頁，課件共57頁，創(chuàng)作于2023年2月[3]黃單胞菌屬(Xanthomonas)①蔗糖蛋白胨培養(yǎng)基(Aaywood1960)

蔗糖2.0%蛋白胨0.5%磷酸氫二鉀(K2HPO4)0.05%

硫酸鎂(MgSO4·7H20)0.025%瓊膠1.5%蒸餾水1000mlpH7.2～7.4這是分離Xanthomonas屬細(xì)菌最常用的培養(yǎng)基，也適用于假單胞菌屬、歐文氏菌屬和有些棒桿菌屬的細(xì)菌，②SX瓊膠培養(yǎng)基(SchaadandWhite，1974)

可溶性淀粉10g牛肉浸膏5g磷酸二氫鉀(KH2PO4)2g瓊膠15g蒸餾水1000ml

適用于分離可以水解淀粉的X.campestris的致病變種。必要時還可以加1%甲基紫B的20%的酒精溶液lml，甲基綠的1%水溶液2ml，和環(huán)己酰亞胺250mg，提高它的選擇性。

第15頁，課件共57頁，創(chuàng)作于2023年2月[4]歐文氏菌屬(Erwinia)前面介紹的培養(yǎng)基有許多也適用于歐文氏菌屬，以下是對歐文氏菌具有特色的結(jié)晶紫聚果膠培養(yǎng)基。將攪碎器預(yù)加熱，加500ml煮沸的蒸餾水，將以下成分依次加入，低速攪拌:

結(jié)晶紫的10%水溶液1.0mllmol/L氫氧化鈉(NaOH)4.5ml氯化鈣(CaCl2·2H2O)新鮮配制的1%水溶液4.5ml瓊膠2g硝酸鈉(NaNO3)1.0g隨后將聚果膠酸鈉加入，高速攪拌15s，分裝三角瓶滅菌后要立即倒入培養(yǎng)皿，制成平板干燥后使用。歐文氏菌屬細(xì)菌有分解果膠酶活性的，形成中間有凹陷的菌落。第16頁，課件共57頁，創(chuàng)作于2023年2月[5]棒形桿菌屬(Clavibacter)此屬細(xì)菌有些是難培養(yǎng)的。酵母葡萄糖礦物鹽瓊膠培養(yǎng)基(YGM)是很好的一種。

酵母浸膏2.0g葡萄糖2.．5g磷酸氫二鉀(K2HPO4)0.25g磷酸二氫鉀(KH2PO4)0.25g硫酸鎂(MgSO4·7H2O)0.1g硫酸錳(MnSO4)0.15g氯化鈉(NaCl)0.05g

硫酸鐵(FeSO4·7H2O)0.005g瓊膠15.0g蒸餾水1000ml適用于分離棒桿菌．也適用于Xanthomonas。第17頁，課件共57頁，創(chuàng)作于2023年2月第三節(jié)培養(yǎng)性狀

培養(yǎng)性狀對細(xì)菌的鑒定是很重要的。不同屬的植物病原細(xì)菌，它們的培養(yǎng)性狀顯然不同。不同種的植物病原細(xì)菌，很難根據(jù)它們的培養(yǎng)性狀區(qū)別，但可以作為最后鑒別的參考

1.培養(yǎng)性狀的描述培養(yǎng)性狀要分別在培養(yǎng)液、瓊膠斜面和瓊膠平板上觀察。描述時，要指明培養(yǎng)基、培養(yǎng)時間和培養(yǎng)溫度等。第18頁，課件共57頁，創(chuàng)作于2023年2月[1]培養(yǎng)液培養(yǎng)性狀

肉汁凍培養(yǎng)液常常用來觀察培養(yǎng)性狀。培養(yǎng)性狀主要是指生長量、表面生長情況、色素的產(chǎn)生、有無沉淀和特殊氣味等。表面的生長情況包括是否形成菌膜和菌環(huán)以及它們的厚度、細(xì)菌是否形成團(tuán)狀的漂浮物。培養(yǎng)液表面下生長的情況包括混濁程度，是均勻的云霧狀還是形成團(tuán)粒狀和片狀的菌團(tuán)。底部的性狀則指有無沉積物和沉積物的形狀。第19頁，課件共57頁，創(chuàng)作于2023年2月[2]瓊膠斜面培養(yǎng)性狀

斜面的培養(yǎng)性狀:生長量的多少、菌苔的形狀、顏色光澤和粘度，以及培養(yǎng)基的顏色和有無特殊的氣味等。細(xì)菌學(xué)上往往將菌苔的形狀分為絲狀、念珠狀、薄膜狀、分枝狀和根狀等。菌苔的表面有光滑的、不平整的和有皺褶的。菌苔的顏色也不同，質(zhì)地有粘質(zhì)的、膜質(zhì)的或蠟質(zhì)的。菌苔有透明的、半透明或不透明的，表面有暗色的或發(fā)亮的。第20頁，課件共57頁，創(chuàng)作于2023年2月[3]瓊膠平板培養(yǎng)性狀

了解平板上菌落的特征，有助于判斷分離是否正確和挑取所需的菌落。瓊膠平板上菌落的觀察主要是：形狀和大小、顏色和光澤、表面是否隆起或凹陷、邊緣的形狀、透明度和粘度、培養(yǎng)基顏色的變化等。

第21頁，課件共57頁，創(chuàng)作于2023年2月2.細(xì)菌的色素非水溶性色素:不能擴(kuò)散到培養(yǎng)基中，所以菌落表現(xiàn)不同的顏色，而培養(yǎng)基則不改變顏色。黃單胞菌屬的細(xì)菌能夠形成非水溶性的黃色素，所以菌落是黃色的。

不能將形成黃色菌落的植物病原細(xì)菌都當(dāng)作黃單胞菌屬的細(xì)菌。如玉米蔫萎病細(xì)菌，曾經(jīng)分在黃單胞菌屬中，但是根據(jù)它的黃色素與黃單胞菌屬的細(xì)菌顯然不同，現(xiàn)在已經(jīng)分在泛生菌屬(Pantoea)。歐文氏菌屬的細(xì)菌，除去有些可產(chǎn)生非水溶性的藍(lán)色素外，有的也能產(chǎn)生非水溶性的黃色素，菌落也呈黃色。有些棒桿菌屬細(xì)菌也能形成黃色菌落。

第22頁，課件共57頁，創(chuàng)作于2023年2月水溶性色素:

擴(kuò)散到培養(yǎng)基中就能使培養(yǎng)基變色，其中有些色素是熒光性的。假單胞菌屬細(xì)菌能否產(chǎn)生熒光性色素，是很重要的分類特征。色素的產(chǎn)生與培養(yǎng)基有關(guān)，如在新鮮牛肉配成的培養(yǎng)基上，熒光性色素的產(chǎn)生要比用牛肉浸膏配成的更為明顯。為了測定假單胞菌屬細(xì)菌色素的產(chǎn)生，可用特殊的如金氏培養(yǎng)基,有兩種配方：

第23頁，課件共57頁，創(chuàng)作于2023年2月

培養(yǎng)基I培養(yǎng)基Ⅱ蛋白胨2g2g硫酸鉀(K2SO4)lg一甘油1g1g氯化鎂(MgCl2)0.14g一磷酸氫二鉀(K2HPO4)一0.15g硫酸鎂(MgSO4·7H2O)一0.15g瓊膠(水洗)2g2g蒸餾水100ml100ml

酸度調(diào)節(jié)到pH7.2。培養(yǎng)基I適用于觀察非熒光性色素，培養(yǎng)基Ⅱ適用于觀察熒光性色素。熒光性色素的產(chǎn)生可以直接觀察或用紫外線照射觀察。第24頁，課件共57頁，創(chuàng)作于2023年2月四、細(xì)菌的計數(shù)細(xì)菌的繁殖量、植物接種和血清學(xué)方面的研究都要求知道細(xì)菌的數(shù)量。細(xì)菌計數(shù)的方法有：

①測數(shù)器計數(shù)法；

②混濁度計數(shù)法；

③平板菌落計數(shù)法。前兩種方法是計數(shù)活的和死的細(xì)菌的總數(shù)，后一種方法是測定活細(xì)菌數(shù)目。第25頁，課件共57頁，創(chuàng)作于2023年2月（1）測數(shù)器計數(shù)法紐鮑爾(Neubauer)血球計數(shù)板是常用的一種。它是一塊很厚的載玻片，上面劃有每邊長為O.05mm的小方格，方格的深度是0.1mm。測數(shù)時，先將蓋玻片放在計數(shù)計上有刻度的位置，從蓋玻片的一側(cè)加小滴適當(dāng)稀釋的孢子懸浮液，然后在顯微鏡下觀察每小格中孢子的數(shù)目；觀察80小格，以它的平均數(shù)乘以4000000，就是每毫升懸浮液中孢子的數(shù)目。第26頁，課件共57頁，創(chuàng)作于2023年2月第27頁，課件共57頁，創(chuàng)作于2023年2月第28頁，課件共57頁，創(chuàng)作于2023年2月測定時注意事項：（1）取待測稀釋菌懸液向血球計數(shù)板加樣前，須將菌懸液充分搖勻。（2）加樣過程中，應(yīng)避免將菌液滴在蓋玻片（3）由于菌體在計數(shù)室中處于不同空間位置，須在不同焦距下才能觀察到，故觀察時須不斷調(diào)節(jié)微調(diào)，計數(shù)菌液中全部菌體，盡量避免遺漏。第29頁，課件共57頁，創(chuàng)作于2023年2月實(shí)驗(yàn)步驟1、鏡檢計數(shù)室：對計數(shù)室進(jìn)行鏡檢，若內(nèi)有污物，清洗后才能計數(shù)。2、加樣液：先在血球計數(shù)板兩個計數(shù)室部位加蓋玻片，再用無菌玻棒或滴管沾取待測菌懸液稀釋液（已搖勻），從蓋玻片邊緣滴加，使菌液沿縫隙靠毛細(xì)作用自行進(jìn)入計數(shù)室內(nèi)。靜置5min。3、顯微鏡計數(shù)：將血球計數(shù)板置于載物臺上，先用低倍鏡觀察，后換高倍鏡觀察計數(shù)。位于格線上菌體只計上邊線和左邊線上的，如果出芽酵母芽體大小達(dá)到母細(xì)胞一半時，可計作兩個菌體。選擇五個視野，在每個視野內(nèi)任意選擇五個小方格計數(shù)，求出每個小方格菌體數(shù)量平均值。4、根據(jù)公式計算每ml菌液含菌數(shù)。5、測量完畢后，取下蓋玻片用水沖洗血球計數(shù)板（嚴(yán)禁用硬物刷洗），晾干，放入盒內(nèi)保存。第30頁，課件共57頁，創(chuàng)作于2023年2月(2)混濁度計數(shù)法測定懸浮液中細(xì)菌、酵母菌或孢子的數(shù)目，可先測定它的混濁度，然后與標(biāo)準(zhǔn)比較而后決定數(shù)目。麥法蘭云度計可作為混濁度的比較標(biāo)準(zhǔn)。測定混濁度更精確的方法是用光度計。測定無色細(xì)菌懸浮液，一般是用波長450nm的光，或者用藍(lán)色濾色片；如是有色的肉汁凍培養(yǎng)液，則用波長650nm的光較好，或用橙紅色濾色片。第31頁，課件共57頁，創(chuàng)作于2023年2月(3)平板菌落計數(shù)法

將細(xì)菌懸浮液定量稀釋后，取一定量不同稀釋度的細(xì)菌懸浮液，分別在瓊膠平板上培養(yǎng)，從形成菌落的數(shù)目和稀釋度，可算出每毫升中細(xì)菌數(shù)：

第32頁，課件共57頁，創(chuàng)作于2023年2月細(xì)菌懸浮液一般都是按10倍的比例稀釋，稀釋以后，每管中吸lml或0.1ml加到滅菌的培養(yǎng)皿中，然后加溶化并冷卻到50℃左右的瓊膠培養(yǎng)基，充分混合后培養(yǎng)，計算平板上菌落的數(shù)目。還有一種方法是先制成瓊膠平板，取稀釋的懸浮液加在平板上，然后用滅菌的“L”形玻棒將菌液涂勻，培養(yǎng)后計算菌落數(shù)目。涂抹法的好處是細(xì)菌都在平板的表面，可以避免培養(yǎng)基中下層細(xì)菌的生長條件不同的影響。一般是只將3個稀釋度較高的(如5、6、7三管)培養(yǎng)測定，這要根據(jù)具體情況決定。由于細(xì)菌懸浮液是成10倍稀釋的，前一個稀釋度在瓊膠平板上菌落的數(shù)目大致是后一個稀釋度的10倍，如果差別很大，說明實(shí)驗(yàn)有差錯。第33頁，課件共57頁，創(chuàng)作于2023年2月平板菌落測數(shù)法雖然比較費(fèi)時，但是不需要特殊的設(shè)備，并且所測定的是活的細(xì)菌。平板菌落測數(shù)法測得菌落的數(shù)目，一般都要低于實(shí)際數(shù)目。由此可見，平板菌落計數(shù)法測定的是可形成菌落單元(colonyformingunit，CFU)并不是細(xì)菌的數(shù)目。當(dāng)然CFU和實(shí)際數(shù)之間是成正相關(guān)的。第34頁，課件共57頁，創(chuàng)作于2023年2月第四節(jié)致病性的測定病株上分離到的細(xì)菌，確定它的致病性，是一種細(xì)菌病害鑒定的關(guān)鍵。一般來說，致病性的和腐生性的細(xì)菌是很難從形態(tài)和其他細(xì)菌學(xué)性狀上區(qū)別的。黃單胞菌屬的植物病原細(xì)菌是比較容易鑒別的一類。這類細(xì)菌大都是致病性的，有很明顯的形態(tài)特征(單根極鞭)，菌落的性狀也比較典型。而其他幾個屬的植物病原細(xì)菌，尤其是假單胞菌屬細(xì)菌，就沒有這樣明顯的特征可以作為初步鑒別的依據(jù)。因此，一般的工作順序是先確定致病性，完成符合柯赫法則的要求，然后再進(jìn)行其他細(xì)菌學(xué)測定。在致病性沒有確定前就進(jìn)行一系列的細(xì)菌生理生化學(xué)測定，最后可能發(fā)現(xiàn)分離到的并不是真正的病原細(xì)菌。因此，寧可多花些時間確定致病性。進(jìn)度似乎較慢，事實(shí)上可能更快一些。第35頁，課件共57頁，創(chuàng)作于2023年2月1．過敏性反應(yīng)——致病性的初步測定為了確定分離到的大量菌種哪些是致病性的，用常規(guī)接種方法比較費(fèi)事，有的要經(jīng)過相當(dāng)長的時間。用植物的過敏性反應(yīng)，來快速篩選致病性細(xì)菌。方法是將濃度107/ml的細(xì)菌的懸浮液注射在煙草葉片的細(xì)胞間致病性細(xì)菌往往在6-24h內(nèi)就在注射點(diǎn)周圍出現(xiàn)過敏性枯斑，而腐生性細(xì)菌則不表現(xiàn)這種反應(yīng)。注射Pseudomonas屬細(xì)菌的，一般在6-l0h即出現(xiàn)枯斑，注射

Xanthomonas屬細(xì)菌的要10-24h。注射的植物要在光照良好的溫室中培養(yǎng)，溫度在25-35℃間，由于枯斑的出現(xiàn)很快，因此也可用離體葉片接種的方法，溫度和光照便于控制。第36頁，課件共57頁，創(chuàng)作于2023年2月除去煙草外，其他植物也能用來測定過敏性反應(yīng)，如棉苗的子葉可以測試水稻白葉枯病細(xì)菌，酸漿屬植物可用來測定歐文氏菌屬的細(xì)菌等。蠶豆葉片也是很好的試驗(yàn)材料。過敏性反應(yīng)的測定只能作為一種參考性狀，以此可以初步區(qū)別分離到的菌種是否為致病性的，但是它的適用范圍還要經(jīng)過更多的實(shí)踐經(jīng)驗(yàn)。因此，致病性的最后確定，一般還要用常規(guī)的接種方法。第37頁，課件共57頁，創(chuàng)作于2023年2月2．常規(guī)接種技術(shù)（1）接種物的準(zhǔn)備

繁殖的細(xì)菌一般都配成懸浮液接種，有時也可直接用來接種。至于測定菌系致病性的強(qiáng)弱和比較品種抗病性的差異等，則規(guī)定一定的濃度為妥，濃度太低有時接種不易成功。針對不同的病原細(xì)菌和實(shí)驗(yàn)的要求，經(jīng)過實(shí)踐確定適當(dāng)?shù)臐舛?，一般可用每毫升?億個細(xì)菌(3×l08CFU/m1)的菌液。接種用的細(xì)菌要注意菌齡，菌齡老則細(xì)菌致病力顯著減退，接種后甚至不發(fā)病。第38頁，課件共57頁，創(chuàng)作于2023年2月(2)各種類型細(xì)菌病害的常用接種方法[1]葉斑病和葉枯病的接種葉斑和葉枯是最常見的細(xì)菌病害，接種的方法很多，但不外乎使細(xì)菌從傷口或氣孔等自然孔口侵入葉片。由于植物病原細(xì)菌不能從表皮直接侵入，也不像真菌那樣以孢子萌發(fā)形成的芽管從氣孔侵入，因此要求在接種的時候就有較多的細(xì)菌進(jìn)入氣孔內(nèi)。針刺接種噴霧接種高壓噴霧接種摩擦接種接種方法第39頁，課件共57頁，創(chuàng)作于2023年2月1)針刺接種

針刺接種是很有效的接種方法，為了測定分離到的細(xì)菌的致病性，一般都先試用這種方法。比較簡單的辦法是：用接種針從瓊膠斜面上挑取少許細(xì)菌直接穿刺葉片接種。為了提高接種效率，可以將許多針固定在橡皮塞或軟木塞上，蘸取細(xì)菌懸浮液接種，一般稱為多針接種法。針刺接種后的植物，不一定要求保濕，但有時保濕的效果要好一些。第40頁，課件共57頁，創(chuàng)作于2023年2月2)噴霧接種

將細(xì)菌懸浮液噴布葉面是常用的接種方法，在葉背更好。懸浮液的濃度一般是106～107CFU/ml，有時濃度高一些更好。植物在接種后要保濕24-48h左右，如接種前也保濕24h，使氣孔張開，則效果更好。大田噴霧接種，保濕是很困難的，因此多半是在傍晚進(jìn)行。由于噴霧接種的細(xì)菌只有很少一部分能夠從氣孔進(jìn)入葉片內(nèi)，接種的效率較低；為了提高接種的效率，噴霧時可以在細(xì)菌懸浮液中加適當(dāng)?shù)恼共紕?，如吐?0或各種洗滌劑等。吐溫的用量在0.1％～1.0％左右。第41頁，課件共57頁，創(chuàng)作于2023年2月3)高壓噴霧接種

細(xì)菌懸浮液用高壓噴霧方法接種，會有較大量的細(xì)菌進(jìn)入組織內(nèi)。噴過的葉組織，充水而呈水漬狀，有利于細(xì)菌的蔓延，接種的效率高，并且發(fā)病一般也較重。許多細(xì)菌病害在暴風(fēng)雨后迅速蔓延，可以說是天然的高壓噴霧接種造成的。接種細(xì)菌懸浮液的濃度，一般不宜超過5×106CFU/ml；溫室接種的植物，接種后一般保濕24-48h，有時不保濕也能發(fā)病。高壓噴霧也適用于大田接種，在每4000ml左右稀釋的細(xì)菌懸浮液中，還可加容量15ml的金剛砂(600目)，加壓206841～413682Pa在傍晚接種。接種后不保濕，方法與汁液傳染的植物病毒病的大田接種相似。第42頁，課件共57頁，創(chuàng)作于2023年2月4)摩擦接種少量植物接種，可以在葉片上撒少量金剛砂(600目)，然后用紗布蘸取細(xì)菌懸浮液(濃度約107CFU/m1)在表面輕輕摩擦接種。葉斑和葉枯類型的細(xì)菌病害，還可以用將細(xì)菌懸浮液注射到葉片組織或灌注在心葉中(如玉米的喇叭口)的方法接種。有些在維管束組織中蔓延很快的葉枯病(如水稻白葉枯病和玉米細(xì)菌性葉枯病),可以用在細(xì)菌懸浮液中浸過的剪刀剪葉的方法接種第43頁，課件共57頁，創(chuàng)作于2023年2月[2]腫瘤和莖稈枝條病害的接種

腫瘤和莖桿枝條病害的接種，一般都是用針刺或注射的方法接種[3]腐爛病的接種

腐爛病一般都是用針刺或注射的方法接種。塊根和塊莖還可以剖開或切成薄片，在切面上滴細(xì)菌懸浮液接種。植物病原細(xì)菌很少引起根腐(塊根除外)，但莖腐還是常見的。[4]蔫萎病的接種蔫萎病的接種可以采用針刺、注射、蘸或灌注土壤等方法接種，使細(xì)菌侵入到寄主維管束組織中。第44頁，課件共57頁，創(chuàng)作于2023年2月第五節(jié)細(xì)菌的形態(tài)革蘭氏染色法

革蘭氏染色反應(yīng)是細(xì)菌分類和鑒定的重要性狀。它的機(jī)制還不完全了解一種解釋是堿性染料可以穿過細(xì)胞壁與細(xì)胞原生質(zhì)的酸性成分起作用，加碘以后形成復(fù)合體。革蘭氏反應(yīng)陽性的細(xì)菌，它的細(xì)胞壁阻止褪色劑對復(fù)合體中染料的提取，所以不褪色。革蘭氏反應(yīng)陰性的細(xì)菌，可能由于細(xì)胞壁中含有較多的類脂物，可以被褪色劑溶解，因而染料可被提取而褪色。還有一種解釋認(rèn)為碘液是起染媒劑的作用，與結(jié)晶紫以及細(xì)胞中核糖核和鎂離子形成復(fù)合體，這種復(fù)合體不容易被褪色。革蘭氏染色反應(yīng)陰性的細(xì)菌不形成這的復(fù)合體，結(jié)晶紫就容易褪色除去。方法及其他注意事項(略)第45頁，課件共57頁，創(chuàng)作于2023年2月結(jié)果:

陽性菌——紫色

陰性菌——紅色結(jié)晶紫初染碘液媒染乙醇脫色番紅復(fù)染涂片固定由丹麥醫(yī)生HansChristianGram于1884年創(chuàng)立。第46頁，課件共57頁，創(chuàng)作于2023年2月Figure1-Gram+Figure2-Gram-第47頁，課件共57頁，創(chuàng)作于2023年2月鞭毛染色

植物病原細(xì)菌的染色，除去革蘭氏染色外，最重要的是鞭毛染色。鞭毛的有無、數(shù)目和著生部位是重要的分類和鑒定性狀。一種植物病原細(xì)菌，經(jīng)過革蘭氏染色和鞭毛染色，大致已經(jīng)可以確定它的屬。細(xì)菌的鞭毛很細(xì)(只有0.02～0.03μm)，一般光學(xué)顯微鏡看不清，鞭毛上沉積了染劑后才能看到，這是所有鞭毛染色法的根據(jù)。由于染劑也可以在載玻片上沉積，所以要用非常清潔的載玻片。染劑處理的時間很重要，處理時間太短，鞭毛上沒有足夠的沉積物就看不清楚；處理時間太長，載玻片上的沉積物太多則影響檢查。第48頁，課件共57頁，創(chuàng)作于2023年2月(1)載玻片的準(zhǔn)備鞭毛染色要用新的或沒有損傷的載玻片，先在濃鉻酸洗滌液中浸24h，清水洗過后用蒸餾水洗，再在95%的酒精中浸過后，將玻片通過火焰幾次，到載玻片邊緣的火焰呈桔黃色為止。通過火焰的載玻片，放在多層吸水紙上任其冷卻。洗凈的載玻片也可以浸在盛有95%5酒精的扁平染色皿中，使用前再通過火焰燒去酒精，檢驗(yàn)是否潔凈的標(biāo)準(zhǔn)是在載玻片上加1滴蒸餾水，如果水滴很快而且均勻地擴(kuò)散開來，表示載玻片是清潔適用的。第49頁，課件共57頁，創(chuàng)作于2023年2月(2)細(xì)菌懸浮液的配制

配制細(xì)菌懸浮液時要注意菌齡，最好是用在斜面上培養(yǎng)18～24h的，但生長較慢的(如黃單胞桿菌屬)細(xì)菌，可用適當(dāng)延長到36-48h的。染色前，菌種每隔一二天移植一次，必要時可連續(xù)進(jìn)行幾次，以增強(qiáng)細(xì)菌的活性。配制的時候，在培養(yǎng)斜面上加滅菌水3-5ml(可根據(jù)濃度增減)靜置(可以稍加搖