核酸的理化性質(zhì)研究方法_第1頁
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關(guān)于核酸的理化性質(zhì)研究方法第1頁,課件共28頁,創(chuàng)作于2023年2月第十四章核酸的物理化學(xué)性質(zhì)一、核酸的水解二、核酸的酸堿性質(zhì)三、核酸的紫外吸收四、核酸的變性、復(fù)性及雜交第十五章核酸的研究方法一、核酸的分離、純化和定量測(cè)定二、核酸的超速離心三、核酸的凝膠電泳四、核酸的核苷酸序列測(cè)定五、DNA聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)第2頁,課件共28頁,創(chuàng)作于2023年2月核酸的化學(xué)結(jié)構(gòu)和作為高聚物決定其理化性質(zhì):核酸的糖苷鍵和磷酸二酯鍵:可被水解;磷酸基和堿基:酸堿性質(zhì);堿基:紫外吸收特性;雙螺旋結(jié)構(gòu):變性和復(fù)性。第3頁,課件共28頁,創(chuàng)作于2023年2月一、核酸的水解(一)酸水解糖苷鍵比磷酸酯鍵更易被酸水解,產(chǎn)生嘌呤和嘧啶堿(二)堿水解RNA的磷酸酯鍵更易被堿水解(RNA的核糖上有2’-OH,在堿作用下形成磷酸三酯,極不穩(wěn)定易水解,產(chǎn)生核苷2’,3’-環(huán)磷酸酯,繼續(xù)水解產(chǎn)生2’-核苷酸和3’-核苷酸)第4頁,課件共28頁,創(chuàng)作于2023年2月(三)酶水解專一水解核酸的磷酸二酯鍵的酶稱為核酸酶(nuclease)。能識(shí)別特定的核苷酸順序,并從特定位點(diǎn)水解核酸的內(nèi)切酶稱為限制性核酸內(nèi)切酶(限制酶)。

第5頁,課件共28頁,創(chuàng)作于2023年2月1、核酸酶的分類(1)按底物專一性分類:核糖核酸酶(ribonuclease,RNase):作用于核糖核酸;脫氧核糖核酸酶(deoxyribonuclease,DNase):作用于脫氧核糖核酸;(2)按底物作用的方式分類:核酸外切酶(endonuclease):從多核苷酸鏈的末端開始,逐個(gè)將核苷酸切下的酶;核酸內(nèi)切酶(exonuclease):從多核苷酸鏈的內(nèi)部開始水解核酸的酶。第6頁,課件共28頁,創(chuàng)作于2023年2月(3)按磷酸二酯鍵斷裂的方式分類:一種是在3’-OH與磷酸基之間斷裂,其產(chǎn)物是5’-磷酸核苷酸或寡核苷酸,如(1);另一種是在5’-OH與磷酸基之間斷裂,其產(chǎn)物是3’-磷酸核苷酸或寡核苷酸,如(2)。PPPNNN(1)(2)(1)(2)5’3’第7頁,課件共28頁,創(chuàng)作于2023年2月2、核糖核酸酶類牛胰核糖核酸酶、核糖核酸酶T1、核糖核酸酶T2等;3、脫氧核糖核酸酶類牛胰脫氧核糖核酸酶、牛脾脫氧核糖核酸酶、限制性內(nèi)切酶等。4、N-糖苷酶第8頁,課件共28頁,創(chuàng)作于2023年2月核酸酶底物切點(diǎn)產(chǎn)物胰核糖核酸酶RNA內(nèi)切核酸酶嘧啶3’端,留下3’-P3’嘧啶單核苷酸或3’-嘧啶核苷酸結(jié)尾的寡聚核苷酸蛇毒磷酸二酯酶RNA,DNA外切核酸酶3’端,留下3’-OH5’-單核苷酸牛脾磷酸二酯酶RNA,DNA外切核酸酶5’端,留下5’-OH3’-單核苷酸大腸桿菌核酸外切酶Ⅰ單鏈DNA外切核酸酶5’端,留下5’-OH3’-單核苷酸及一個(gè)末尾二核苷酸大腸桿菌核酸外切酶Ⅲ雙鏈DNA外切核酸酶3’端,留下3’-OH5’-單核苷酸第9頁,課件共28頁,創(chuàng)作于2023年2月第10頁,課件共28頁,創(chuàng)作于2023年2月二、核酸的酸堿性質(zhì)1、堿基的解離C的N3有一對(duì)未共用電子,可與質(zhì)子結(jié)合;C的烯醇式羥基具有釋放質(zhì)子的能力;U的N3酸性解離的pK1’=9.5;T的N3酸性解離的pK1’=9.9;A的N1pK1’=4.15G的N7pK1’=3.2

N1pK2’=9.6;N9pK3’=12.4第11頁,課件共28頁,創(chuàng)作于2023年2月2、核苷的解離戊糖的存在增強(qiáng)了堿基的酸性解離:A的N1pK1’由4.15降為3.63;C的pK1’由4.6降為4.15;第12頁,課件共28頁,創(chuàng)作于2023年2月3、核苷酸的解離HpK1’=1.5第13頁,課件共28頁,創(chuàng)作于2023年2月核苷酸有磷酸與堿基,為兩性電介質(zhì);U的堿基堿性極弱,不能形成兼性離子;A,G,C中,pK1’:第一磷酸基-PO3H2的解離;pK2’:含氮環(huán)=N+H-的解離;pK3’:第二磷酸基-PO3H-的解離;故其pI=(pK1’

+pK2’)/2DNA變性雙鏈打開后,堿基即參與酸堿滴定。

第14頁,課件共28頁,創(chuàng)作于2023年2月三、核酸的紫外吸收Py和Pu有共軛雙鍵,使堿基、核苷、核苷酸和核酸能吸收紫外光,最大吸收峰為260nm。不同核苷酸第15頁,課件共28頁,創(chuàng)作于2023年2月A260=εCL公式中,A260為光密度

ε,為260nm處的堿苦摩爾消光系數(shù)

C,為每升溶液中堿基的摩爾數(shù)

L,為比色杯內(nèi)徑的厚度如:已知鳥嘌呤溶液的A260=0.325,

ε=7.2X103,L=1cm,則:C=0.325/(7.2X103X1)=4.5X10-5(mol/l)紫外光區(qū)最大吸收:260nm,定性定量分析第16頁,課件共28頁,創(chuàng)作于2023年2月第五節(jié)DNA的理化性質(zhì)及其應(yīng)用一、核酸的一般理化性質(zhì)核酸具有酸性;粘度大;第17頁,課件共28頁,創(chuàng)作于2023年2月二、DNA的變性

在理化因素作用下,DNA雙螺旋的兩條互補(bǔ)鏈松散而分開成為單鏈,從而導(dǎo)致DNA的理化性質(zhì)及生物學(xué)性質(zhì)發(fā)生改變,這種現(xiàn)象稱為DNA的變性(denaturation)

。變性時(shí)維持雙螺旋穩(wěn)定性的氫鍵斷裂,堿基間的堆積力遭到破壞,但不涉及到其一級(jí)結(jié)構(gòu)的改變。

第18頁,課件共28頁,創(chuàng)作于2023年2月①增色效應(yīng):指DNA變性后對(duì)260nm紫外光的光吸收度增加的現(xiàn)象;②旋光性下降;③粘度降低;④生物學(xué)功能喪失或改變。引起DNA變性的因素主要有:①高溫,②強(qiáng)酸、強(qiáng)堿,③有機(jī)溶劑等。DNA變性后的性質(zhì)改變:

第19頁,課件共28頁,創(chuàng)作于2023年2月

DNA的變性溫度:加熱DNA溶液,使其對(duì)260nm紫外光的吸收度突然增加,達(dá)到其最大值一半時(shí)的溫度,就是DNA的變性溫度(融解溫度,Tm)。第20頁,課件共28頁,創(chuàng)作于2023年2月

Tm的高低與DNA分子中G+C的含量有關(guān),G+C的含量越高,則Tm越高。Tm=69.3+0.41(%G+C)12nd第21頁,課件共28頁,創(chuàng)作于2023年2月三、DNA的復(fù)性與分子雜交將熱變性后的DNA溶液緩慢冷卻,在低于變性溫度約25~30℃的條件下保溫一段時(shí)間(退火),則變性的兩條單鏈DNA可以重新互補(bǔ)而形成原來的雙螺旋結(jié)構(gòu)并恢復(fù)原有的性質(zhì)。第22頁,課件共28頁,創(chuàng)作于2023年2月將變性DNA經(jīng)退火處理,使其重新形成雙螺旋結(jié)構(gòu)的過程,稱為DNA的復(fù)性。第23頁,課件共28頁,創(chuàng)作于2023年2月

兩條來源不同的單鏈核酸(DNA或RNA),只要它們有大致相同的互補(bǔ)堿基順序,經(jīng)退火處理即可復(fù)性,形成新的雜合雙螺旋,這一現(xiàn)象稱為核酸的分子雜交。第24頁,課件共28頁,創(chuàng)作于2023年2月核酸雜交可以是DNA-DNA,也可以是DNA-RNA雜交。不同來源的,具有大致相同互補(bǔ)堿基順序的核酸片段稱為同源順序。

第25頁,課件共28頁,創(chuàng)作于2023年2月

利用核酸的分子雜交,可以確定或?qū)ふ也煌锓N中具有同源順序的DNA或RNA片段。常用的核酸分子雜交技術(shù)有:Southern雜交(鑒別DNA)及Northern雜交(鑒別RNA)、原位雜交、斑點(diǎn)雜交等。在核酸雜交分析過程中,常將已知順序的核酸片段用放射性同位素或生物素進(jìn)行標(biāo)記。這種帶有一定標(biāo)記的已知順序的核酸片段稱為探針。

第26頁,課件共28頁,創(chuàng)作于2023年2月問題:1、DNA熱變性有何特點(diǎn)?T

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