免疫組織化學(xué)

免疫組織化學(xué)報(bào)告人：傅琦博指導(dǎo)老師：胡翊群傅琦博F0318102第一頁(yè)，共二十八頁(yè)。何謂免疫組化免疫組織化學(xué)是指在組織細(xì)胞原位通過(guò)抗原抗體反應(yīng)和組織呈色反應(yīng)，借助可見(jiàn)的標(biāo)記物，對(duì)相應(yīng)的抗原或抗體進(jìn)行定位、定性和定量檢測(cè)的一種免疫檢測(cè)方法。傅琦博F0318102第二頁(yè)，共二十八頁(yè)。免疫組化的全過(guò)程抗原的提取與純化免疫動(dòng)物或細(xì)胞融合，制備特異性抗體及純化標(biāo)記物與抗體集合形成標(biāo)記抗體標(biāo)本的處理抗原抗體反應(yīng)和呈色反應(yīng)顯微鏡下觀察結(jié)果傅琦博F0318102第三頁(yè)，共二十八頁(yè)。組織抗原抗體標(biāo)記物

標(biāo)記抗體1熒光2酶3親和技術(shù)4金標(biāo)傅琦博F0318102第四頁(yè)，共二十八頁(yè)。組織抗原免疫細(xì)胞化學(xué)反應(yīng)原理：＋標(biāo)記抗體標(biāo)記的抗原抗體復(fù)合物傅琦博F0318102第五頁(yè)，共二十八頁(yè)。間接法直接法

兩種免疫細(xì)胞化學(xué)反應(yīng)方法傅琦博F0318102第六頁(yè)，共二十八頁(yè)。標(biāo)本的處理標(biāo)本的主要來(lái)源：活體組織、各種體液、穿刺液、培養(yǎng)細(xì)胞標(biāo)本的固定與保存酶消化處理

組織材料處理是獲得良好免疫細(xì)胞組織化學(xué)分析的保障，必須保證要檢測(cè)的細(xì)胞或組織取材新鮮、固定即使及時(shí)、形態(tài)保存良好、抗原物質(zhì)的抗原性不被破壞。傅琦博F0318102第七頁(yè)，共二十八頁(yè)。標(biāo)本的固定與保存

固定的目的：是細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)凝固，終止胞內(nèi)酶活化反應(yīng)，防止細(xì)胞自溶，保持細(xì)胞固有形態(tài)與結(jié)構(gòu)，防止細(xì)胞脫落，去除干擾抗原抗體反應(yīng)的類脂，最主要的是保存組織細(xì)胞的抗原性，在染色和反復(fù)清洗的過(guò)程中使抗原不致釋放。好的固定劑：（1）能快速固定抗原（2）防止抗原物質(zhì)擴(kuò)散（3）固定后的抗原能被抗體識(shí)別，不影響抗原抗體反應(yīng)傅琦博F0318102第八頁(yè)，共二十八頁(yè)。標(biāo)本的固定與保存抗原固定劑固定溫度與時(shí)間蛋白質(zhì)95％乙醇室溫，3～15min免疫球蛋白丙酮4℃，30min酶四氯化磺4℃，30min激素1％聚甲醛4℃，4～5h細(xì)菌丙酮、甲醇室溫，3～10min病毒丙酮，無(wú)水乙醇室溫，5～10min四氯化磺4℃，30～60min類脂質(zhì)10％甲醛室溫，3～10min細(xì)胞懸液1％聚甲醛室溫，2min各種抗原的固定傅琦博F0318102第九頁(yè)，共二十八頁(yè)。標(biāo)本的固定與保存

冰凍切片和石蠟切片時(shí)免疫組化中最常用的制片方法。冰凍切片制片方法簡(jiǎn)單，可避免石蠟切片因固定、脫水、浸蠟等步驟造成的抗原損失。迅速冷凍可防止冰晶的形成，避免組織細(xì)胞結(jié)構(gòu)的破壞。石蠟切片是觀察組織細(xì)胞結(jié)構(gòu)的理想方法，可用于陳舊石蠟包埋材料的回顧性免疫組化研究，切片薄，有連續(xù)性，蠟塊可長(zhǎng)期保存，但是抗原的保存量不如冰凍切片。傅琦博F0318102第十頁(yè)，共二十八頁(yè)。酶消化處理石蠟包埋材料大都用甲醛固定保存，固定過(guò)程中由于醛鍵形成致使某些抗原決定簇被封閉，染色不理想，甚至出現(xiàn)假陰性，因而在進(jìn)行免疫組化反應(yīng)之前，需要酶消化處理切片，可使抗原決定簇重新裸露。常用的消化酶有胰蛋白酶、胃蛋白酶、蛋白酶K等。傅琦博F0318102第十一頁(yè)，共二十八頁(yè)?？贵w處理與保存抗體是免疫組化技術(shù)的首要試劑，通常選用的高特異性、高效價(jià)的第一抗體為多克隆抗體?？贵w稀釋的原則是陽(yáng)性（抗原）物質(zhì)著色應(yīng)鮮明，背景應(yīng)錢或不著色。抗體效價(jià)越高，孵育時(shí)間越長(zhǎng)，方法越敏感抗體稀釋度應(yīng)越高。傅琦博F0318102第十二頁(yè)，共二十八頁(yè)。免疫染色標(biāo)記抗體與標(biāo)本中抗原反應(yīng)并形成抗原抗體復(fù)合物；用緩沖液沖洗去未結(jié)合的成分；直接在顯微鏡下觀察結(jié)果（免疫熒光直接法），或待標(biāo)本顯色后再用顯微鏡觀察結(jié)果（免疫酶直接法）免疫染色是免疫組化技術(shù)的關(guān)鍵步驟。傅琦博F0318102第十三頁(yè)，共二十八頁(yè)。免疫染色

對(duì)一些特殊的標(biāo)本需進(jìn)一步進(jìn)行處理來(lái)增加檢測(cè)的敏感性和特異性，減少非特異性干擾。1.蛋白酶消化法采用蛋白酶消化的目的是暴露抗原，增加細(xì)胞和組織的通透性，以利于抗體與抗原最大限度的結(jié)合。常用蛋白酶有胰蛋白酶、胃蛋白酶、鏈霉蛋白酶等。2.非特異吸附法免疫組化技術(shù)中非抗原抗體反應(yīng)出現(xiàn)的陽(yáng)性染色成為非特異性染色。防止非特異性染色的有效方法是采用與第二抗體相同的動(dòng)物源血清（非免疫血清）吸附封閉底物煮至上的帶電荷物質(zhì)，然后再進(jìn)行抗原抗體結(jié)合反應(yīng)，必要時(shí)也可采用2%左右的?；蛉税椎鞍追馄?，減少非特異性染色。傅琦博F0318102第十四頁(yè)，共二十八頁(yè)。免疫組化染色中標(biāo)識(shí)物的選擇用量微小，容易在光鏡或電鏡下識(shí)別機(jī)體內(nèi)無(wú)同一物質(zhì)或類似物質(zhì)物理或化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定，可與抗原或抗體結(jié)合，其結(jié)合物也穩(wěn)定

目前常用標(biāo)識(shí)物質(zhì)有熒光色素、放射性同位素、重金屬、微粒子、酶等傅琦博F0318102第十五頁(yè)，共二十八頁(yè)。設(shè)立對(duì)照實(shí)驗(yàn)

為確定結(jié)果的可靠性，在實(shí)驗(yàn)中必須設(shè)置對(duì)照。通常是針對(duì)第一抗體設(shè)立對(duì)照，包括陽(yáng)性對(duì)照、陰性對(duì)照、替代對(duì)照、空白對(duì)照、自身對(duì)照和吸收試驗(yàn)等。（1）陽(yáng)性對(duì)照用一直抗原陽(yáng)性的切片與待測(cè)標(biāo)本同時(shí)進(jìn)行免疫細(xì)胞化學(xué)染色，陽(yáng)性對(duì)照應(yīng)呈陽(yáng)性結(jié)果，即為陽(yáng)性對(duì)照。（2）陰性對(duì)照用不含一直抗原的標(biāo)本作對(duì)照，實(shí)驗(yàn)結(jié)果為陰性，即為陰性對(duì)照。陰性對(duì)照中還包括空白對(duì)照、替代對(duì)照、吸收和抑制對(duì)照等，用以排除假陽(yáng)性結(jié)果。傅琦博F0318102第十六頁(yè)，共二十八頁(yè)。免疫組化的結(jié)果判斷染色特異性染色非特異性染色顯色部位特定細(xì)胞或間質(zhì)細(xì)胞和間質(zhì)均勻染色或更強(qiáng)顯色定位特定，具有結(jié)構(gòu)性無(wú)特定部位，無(wú)結(jié)構(gòu)性顯色程度同一部位呈不同程度顯色無(wú)分布規(guī)律，某一片均勻著色

免疫組織化學(xué)的結(jié)果判斷應(yīng)非常嚴(yán)謹(jǐn)，陽(yáng)性細(xì)胞的染色分布有三種類型：胞漿型、細(xì)胞核型和細(xì)胞膜表面型。陽(yáng)性細(xì)胞顯色深淺可反映出抗原的濃度，并以此作為定性、定量和定位的依據(jù)。陽(yáng)性細(xì)胞的染色常定位于細(xì)胞，并于陰性細(xì)胞間有明顯間隔，而非特異性染色常不限于單個(gè)細(xì)胞，而是累及一片細(xì)胞，兩者可由顯著區(qū)別。傅琦博F0318102第十七頁(yè)，共二十八頁(yè)。幾種常用的免疫組化檢測(cè)技術(shù)熒光免疫組織化學(xué)技術(shù)酶免疫組織化學(xué)技術(shù)免疫金（銀）組織化學(xué)技術(shù)免疫標(biāo)記電鏡技術(shù)……傅琦博F0318102第十八頁(yè)，共二十八頁(yè)。

免疫熒光技術(shù)將熒光素作為標(biāo)記物使組織細(xì)胞中形成的抗原抗體復(fù)合物在熒光顯微鏡下可見(jiàn)，從而顯示抗原物質(zhì)的定位

免疫熒光技術(shù)傅琦博F0318102第十九頁(yè)，共二十八頁(yè)。

１.異硫氰酸熒光素FITC２.四乙基羅達(dá)明３.四甲基異硫氰酸羅達(dá)明４.藻紅蛋白

▲呈現(xiàn)不同的熒光：綠色熒光(FITC)

橙色熒光

橙紅色熒光

紅色熒光等

熒光素作為染料在激發(fā)光照射下能產(chǎn)生熒光的一類化合物傅琦博F0318102第二十頁(yè)，共二十八頁(yè)。

熒光：

在激發(fā)光（熒光顯微鏡提供）的照射下，能發(fā)出較激發(fā)光波長(zhǎng)更長(zhǎng)的可見(jiàn)光并隨照射停止而消失

熒光顯微鏡：

熒光顯微鏡的光源提供各種激發(fā)光，如紫外光、藍(lán)紫光（有不同的波長(zhǎng)范圍），使受檢標(biāo)本內(nèi)的熒光物質(zhì)發(fā)出發(fā)射光傅琦博F0318102第二十一頁(yè)，共二十八頁(yè)。海馬細(xì)胞

微管蛋白綠色(胞體、樹突)

軸突終末蛋白紅色(突觸)傅琦博F0318102第二十二頁(yè)，共二十八頁(yè)。

培養(yǎng)的成纖維細(xì)胞微管呈綠色核呈藍(lán)色傅琦博F0318102第二十三頁(yè)，共二十八頁(yè)。免疫組織化學(xué)技術(shù)的應(yīng)用

熒光免疫組織化學(xué)技術(shù)主要用于病原體感染的早期診斷，自身抗體檢測(cè)，分析淋巴細(xì)胞表面標(biāo)記物質(zhì)及抗原、抗體的免疫組化定位等；在病原生物學(xué)方面，主要用于菌種的堅(jiān)定和抗原結(jié)構(gòu)的分析；在細(xì)胞免疫學(xué)檢測(cè)中，用以檢測(cè)拎包細(xì)胞表面的各種CD抗原、免疫球蛋白受體、HLA抗原和各種膜受體等。酶免疫組織化學(xué)技術(shù)主要用于組織切片或其它抗原的定位檢測(cè)。組織切片中的各類抗原性物質(zhì)，如各類蛋白質(zhì)、酶、激素、細(xì)胞、病毒、腫瘤抗原、姜細(xì)胞中的免疫球蛋白、各種多肽、細(xì)胞表面標(biāo)志等均可檢測(cè)。免疫標(biāo)記電鏡技術(shù)由于需要電子顯微鏡，目前仍較多用于科研分析。傅琦博F0318102第二十四頁(yè)，共二十八頁(yè)。免疫組化在臨床病理診斷中的應(yīng)用標(biāo)記淋巴造血組織及其腫瘤的細(xì)胞來(lái)源和細(xì)胞分化程度;協(xié)助腫瘤良惡性的診斷;鑒別低分化癌和肉瘤;鑒別轉(zhuǎn)移癌的性質(zhì);協(xié)助發(fā)現(xiàn)骨髓、淋巴結(jié)微小轉(zhuǎn)移癌灶;鑒別小細(xì)胞惡性腫瘤;癌組織耐藥基因的檢測(cè);為癌癥患者治療方案的擬定提供依據(jù);確定腫瘤組織的增殖活性;評(píng)估癌癥患者的預(yù)后;檢測(cè)病原體。傅琦博F0318102第二十五頁(yè)，共二十八頁(yè)。鑒別低分化癌和低分化肉瘤鑒別低分化癌和惡性淋巴瘤鑒別微小轉(zhuǎn)移癌灶鑒別某些轉(zhuǎn)移癌的類型鑒別低分化癌的類型鑒別低分化肉瘤的類型傅琦博F0318102第二十六頁(yè)，共二十八頁(yè)。謝謝！傅琦博F0318102傅琦博F0318102第二十七頁(yè)，共二十八頁(yè)。內(nèi)容總結(jié)免疫組織化學(xué)。傅琦博F0318102。冰凍切片和石蠟切片時(shí)免疫組化中最常用的制片方法。迅速冷凍可防止冰晶的形成，避免組織細(xì)胞結(jié)構(gòu)的破壞。抗體稀釋的原則是陽(yáng)性（抗原）物質(zhì)著色應(yīng)鮮明