RNA的提取和cDNA合成原理和實驗方法

------------------------------------------------------------------------RNA的提取和cDNA合成原理和實驗方法RNA的提取和cDNA合成原理和實驗方法第一節(jié).概述從真核生物的組織或細(xì)胞中提取mRNA,通過酶促反應(yīng)逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA的第一鏈和第二鏈,將雙鏈cDNA和載體連接,然后轉(zhuǎn)化擴(kuò)增,即可獲得cDNA文庫,構(gòu)建的cDNA文庫可用于真核生物基因的結(jié)構(gòu)、表達(dá)和調(diào)控的分析;比較cDNA和相應(yīng)基因組DNA序列差異可確定內(nèi)含子存在和了解轉(zhuǎn)錄后加工等一系列問題。總之cDNA的合成和克隆已成為當(dāng)今真核分子生物學(xué)的基本手段。自70年代中葉首例cDNA克隆問世以來,已發(fā)展了許多種提高cDNA合成效率的方法,并大大改進(jìn)了載體系統(tǒng)，目前cDNA合成試劑已商品化。cDNA合成及克隆的基本步驟包括用反轉(zhuǎn)錄酶合成cDNA第一鏈,聚合酶合成cDNA第二鏈,加入合成接頭以及將雙鏈DNA克隆到于適當(dāng)載體(噬菌體或質(zhì)粒)。一.RNA制備模板mRNA的質(zhì)量直接影響到cDNA合成的效率。由于mRNA分子的結(jié)構(gòu)特點,容易受RNA酶的攻擊反應(yīng)而降解,加上RNA酶極為穩(wěn)定且廣泛存在,因而在提取過程中要嚴(yán)格防止RNA酶的污染,并設(shè)法抑制其活性,這是本實驗成敗的關(guān)鍵。所有的組織中均存在RNA酶,人的皮膚、手指、試劑、容器等均可能被污染，因此全部實驗過程中均需戴手套操作并經(jīng)常更換（使用一次性手套）。所用的玻璃器皿需置于干燥烘箱中200℃烘烤2小時以上。凡是不能用高溫烘烤的材料如塑料容器等皆可用0.1%的焦碳酸二乙酯(DEPC)水溶液處理,再用蒸餾水沖凈。DEPC是RNA酶的化學(xué)修飾劑,它和RNA酶的活性基團(tuán)組氨酸的咪唑環(huán)反應(yīng)而抑制酶活性。DEPC與氨水溶液混合會產(chǎn)生致癌物,因而使用時需小心。試驗所用試劑也可用DEPC處理,加入DEPC至0.1%濃度,然后劇烈振蕩10分鐘,再煮沸15分鐘或高壓滅菌以消除殘存的DEPC,否則DEPC也能和腺嘌呤作用而破壞mRNA活性。但DEPC能與胺和巰基反應(yīng),因而含Tris和DTT的試劑不能用DEPC處理。Tris溶液可用DEPC處理的水配制然后高壓滅菌。配制的溶液如不能高壓滅菌,可用DEPC處理水配制,并盡可能用未曾開封的試劑。除DEPC外,也可用異硫氰酸胍、釩氧核苷酸復(fù)合物、RNA酶抑制蛋白等。此外,為了避免mRNA或cDNA吸附在玻璃或塑料器皿管壁上,所有器皿一律需經(jīng)硅烷化處理。細(xì)胞內(nèi)總RNA制備方法很多,如異硫氰酸胍熱苯酚法等。許多公司有現(xiàn)成的總RNA提取試劑盒,可快速有效地提取到高質(zhì)量的總RNA。分離的總RNA可利用mRNA3'末端含有多聚(A)+的特點,當(dāng)RNA流經(jīng)oligo(dT)纖維素柱時,在高鹽緩沖液作用下,mRNA被特異的吸附在oligo(dT)纖維素上,然后逐漸降低鹽濃度洗脫,在低鹽溶液或蒸餾水中,mRNA被洗下。經(jīng)過兩次oligo(dT)纖維素柱,可得到較純的mRNA。純化的mRNA在70%乙醇中-70℃可保存一年以上。二.cDNA第一鏈的合成所有合成cDNA第一鏈的方法都要用依賴于RNA的DNA聚合酶(反轉(zhuǎn)錄酶)來催化反應(yīng)。目前商品化反轉(zhuǎn)錄酶有從禽類成髓細(xì)胞瘤病毒純化到的禽類成髓細(xì)胞病毒(AMV)逆轉(zhuǎn)錄酶和從表達(dá)克隆化的Moloney鼠白血病病毒反轉(zhuǎn)錄酶基因的大腸桿菌中分離到的鼠白血病病毒(MLV)反轉(zhuǎn)錄酶。AMV反轉(zhuǎn)錄酶包括兩個具有若干種酶活性的多肽亞基,這些活性包括依賴于RNA的DNA合成,依賴于DNA的DNA合成以及對DNA:RNA雜交體的RNA部分進(jìn)行內(nèi)切降解(RNA酶H活性)。MLV反轉(zhuǎn)錄酶只有單個多肽亞基,兼?zhèn)湟蕾囉赗NA和依賴于DNA的DNA合成活性,但降解RNADNA雜交體中的RNA的能力較弱,且對熱的穩(wěn)定性較AMV反轉(zhuǎn)錄酶差。MLV反轉(zhuǎn)錄酶能合成較長的cDNA(如大于2-3kb)。AMV反轉(zhuǎn)錄酶和MLV反轉(zhuǎn)錄酶利用RNA模板合成cDNA時的最適pH值,最適鹽濃度和最適溫室各不相同,所以合成第一鏈時相應(yīng)調(diào)整條件是非常重要。AMV反轉(zhuǎn)錄酶和MLV反轉(zhuǎn)錄酶都必須有引物來起始DNA的合成。cDNA合成最常用的引物是與真核細(xì)胞mRNA分子3'端poly(A)結(jié)合的12-18核苷酸長的oligo(dT)。三.cDNA第二鏈的合成cDNA第二鏈的合成方法有以下幾種:1.自身引導(dǎo)法合成的單鏈cDNA3'端能夠形成一短的發(fā)夾結(jié)構(gòu),這就為第二鏈的合成提供了現(xiàn)成的引物,當(dāng)?shù)谝绘満铣煞磻?yīng)產(chǎn)物的DNA:RNA雜交鏈變性后利用大腸桿菌DNA聚合酶ⅠKlenow片段或反轉(zhuǎn)錄酶合成cDNA第二鏈,最后用對單鏈特異性的S1核酸酶消化該環(huán),即可進(jìn)一步克隆。但自身引導(dǎo)合成法較難控制反應(yīng)，而且用S1核酸酶切割發(fā)夾結(jié)構(gòu)時無一例外地將導(dǎo)致對應(yīng)于mRNA5'端序列出現(xiàn)缺失和重排,因而該方法目前很少使用。2.置換合成法該方法利用第一鏈在反轉(zhuǎn)錄酶作用下產(chǎn)生的cDNA:mRNA雜交鏈不用堿變性,而是在dNTP存在下,利用RNA酶H在雜交鏈的mRNA鏈上造成切口和缺口。從而產(chǎn)生一系列RNA引物,使之成為合成第二鏈的引物,在大腸桿菌DNA聚合酶Ⅰ的作用下合成第二鏈。該反應(yīng)有3個主要優(yōu)點:(1)非常有效;(2)直接利用第一鏈反應(yīng)產(chǎn)物,無須進(jìn)一步處理和純化;(3)不必使用S1核酸酶來切割雙鏈cDNA中的單鏈發(fā)夾環(huán)。目前合成cDNA常采用該方法。四.cDNA的分子克隆已經(jīng)制備好的雙鏈cDNA和一般DNA一樣,可以插入到質(zhì)粒或噬菌體中,為此,首先必需連接上接頭(Linker),接頭可以是限制性內(nèi)切酶識別位點片段,也可以利用末端轉(zhuǎn)移酶在載體和雙鏈cDNA的末端接上一段寡聚dG和dC或dT和dA尾巴,退火后形成重組質(zhì)粒,并轉(zhuǎn)化到宿主菌中進(jìn)行擴(kuò)增。合成的cDNA也可以經(jīng)PCR擴(kuò)增后再克隆入適當(dāng)載體。第二節(jié).動植物組織mRNA的提取一、材料

水稻葉片或小鼠肝組織。

二、設(shè)備

研缽，冷凍臺式高速離心機，低溫冰箱，冷凍真空干燥器，紫外檢測儀，電泳儀，電泳槽。

三、試劑

1、無RNA酶滅菌水：用將高溫烘烤的玻璃瓶（180℃2小時）裝蒸餾水，然后加入0.01%的DEPC（體積/體積），處理過夜后高壓滅菌。

2、75%乙醇：用DEPC處理水配制75%乙醇，（用高溫滅菌器皿配制），然后裝入高溫烘烤的玻璃瓶中，存放于低溫冰箱。

3、1×層析柱加樣緩沖液；20mmol/LTris·Cl(pH7.6)，0.5mol/LNaCl，1mmol/LEDTA(pH8.0)，0.1%SDS。

4、洗脫緩沖液：10mmol/LTris·Cl(pH7.6)，1mmol/LEDTA(pH8.0)，0.05%SDS。

四、操作步驟

（一）動植物總RNA提取-Trizol法

Trizol法適用于人類、動物、植物、微生物的組織或培養(yǎng)細(xì)菌，樣品量從幾十毫克至幾克。用Trizol法提取的總RNA絕無蛋白和DNA污染。RNA可直接用于Northern斑點分析，斑點雜交，Poly(A)+分離，體外翻譯，RNase封阻分析和分子克隆。

1、將組織在液N中磨成粉末后，再以50-100mg組織加入1mlTrizol液研磨，注意樣品總體積不能超過所用Trizol體積的10%。2、研磨液室溫放置5分鐘，然后以每1mlTrizol液加入0.2ml的比例加入氯仿，蓋緊離心管，用手劇烈搖蕩離心管15秒。

3、取上層水相于一新的離心管，按每mlTrizol液加0.5ml異丙醇的比例加入異丙醇，室溫放置10分鐘，12000g離心10分鐘。

4、棄去上清液，按每mlTrizol液加入至少1ml的比例加入75%乙醇，渦旋混勻，4℃下7500g離心5分鐘。

5、小心棄去上清液，然后室溫或真空干燥5-10分鐘，注意不要干燥過分，否則會降低RNA的溶解度。然后將RNA溶于水中，必要時可55℃-60℃水溶10分鐘。RNA可進(jìn)行mRNA分離，或貯存于70%乙醇并保存于-70℃。

[注意]1、整個操作要帶口罩及一次性手套，并盡可能在低溫下操作。

2、加氯仿前的勻漿液可在-70℃保存一個月以上，RNA沉淀在70%乙醇中可在4℃保存一周，-20℃保存一年。（二）mRNA提取

由于mRNA末端含有多poly(A)+，當(dāng)總RNA流徑oligo(dT)纖維素時，在高鹽緩沖液作用下，mRNA被特異的吸附在oligo(dT)纖維素柱上，在低鹽濃度或蒸餾水中，mRNA可被洗下，經(jīng)過兩次oligo(dT)纖維素柱，可得到較純的mRNA。

1、用0.1mol/LNaOH懸浮0.5-1.0goligo(dT)纖維素。

2、將懸浮液裝入滅菌的一次性層析柱中或裝入填有經(jīng)DEPC處理并經(jīng)高壓滅菌的玻璃棉的巴斯德吸管中，柱床體積為0.5-1.0ml，用3倍柱床體積的滅菌水沖洗柱床。

3、用1x柱層析加樣緩沖液沖洗柱床，直到流出液的pH值小于8.0。

4、將（一）中提取的RNA液于65℃溫育5分鐘后迅速冷卻至室溫，加入等體積2x柱層析緩沖液，上樣，立即用滅菌試管收集洗出液，當(dāng)所有RNA溶液進(jìn)入柱床后，加入1倍柱床體積的1x層析柱加樣溶液。

5、測定每一管的OD260，當(dāng)洗出液中OD為0時，加入2-3倍柱床體積的滅菌洗脫緩沖液，以1/3至1/2柱床體積分管收集洗脫液。

6、測定OD260，合并含有RNA的洗脫組分。

7、加入1/10體積的3MNaAc(pH5.2)，2.5倍體積的冰冷乙醇，混勻，-20℃30分鐘。

8、4℃下12000g離心15分鐘，小心棄去上清液，用70%乙醇洗滌沉淀，4℃下12000g離心5分鐘。

9、小心棄去上清液，沉淀空氣干燥10分鐘，或真空干燥10分鐘。

10、用少量水溶解RNA液，即可用于cDNA合成（或保存在70%乙醇中并貯存于-70℃）。

[注意]1、mRNA在70%乙醇中-70℃可保存一年以上。

2、oligo(dT)纖維素柱用后可用0.3mol/lNaOH洗凈，然后用層析柱加樣緩沖液平衡，并加入0.02%疊氮鈉（NaN3）冰箱保存，重復(fù)使用。每次用前需用NaOH水層析柱加樣緩沖液依次淋洗柱床。第三節(jié)植物病毒RNA提取

大多植物病毒RNA為單鏈RNA，并且其極性與mRNA極性相同，植物病毒RNA提取較為簡單，一般使用酚氯仿即可獲得滿意結(jié)果。

一、材料

提純TMV病毒液（10mg/ml）。

二、設(shè)備

冷凍臺式離心機，低溫真空干燥儀，電泳儀，電泳槽。

三、試劑

TE-飽和酚:氯仿（1:1），氯仿，3MNaAc(pH5.2)，乙醇(100%和70%)，TE緩沖液，無RNA酶的雙菌水。

四、操作步驟

1、取一eppendorf管加入提純TMV（10mg/ml）400ml，再加入等體積酚/氯仿，蓋緊管蓋后用手充分振蕩1分鐘，4℃下12000g離心10分鐘。

2、吸取水相于一新eppendorf管，再用酚/氯仿抽提，直至水相和有機相交界面無蛋白為止。

3、吸取水相于新eppendorf心管，加入等體積氯仿，用手倒置離心管數(shù)十秒，4℃下12000g離心10分鐘。

4、取水相，加入1/10倍體積的3mol/LNaAc(pH5.2)，2.5倍體積的冰冷乙醇，混勻，-20℃30分鐘。

5、4℃下12000g離心15分鐘，小心棄去上清液，用70%乙醇洗滌沉淀，4℃下12000g離心5分鐘。

6、小心棄去上清液，沉淀真空干燥5分鐘或空氣干燥10分鐘，并溶于無RNA酶的雙菌水或TE緩沖液中。

7、取10ml進(jìn)行電泳分析，另10ml用于cDNA合成。

[注意]1、整個操作應(yīng)盡可能在低溫下進(jìn)行。

2、由于病毒RNA鑲嵌于外殼蛋白里面，因此要充分剝?nèi)ゲ《就鈿さ鞍?，一般需要多次進(jìn)行酚/氯仿的抽提。第四節(jié)cDNA合成技術(shù)

一、RibocloneM-MLV(H-)cDNA合成技術(shù)

Promega公司的RibocloneRM-MLV(H-)cDNA合成系統(tǒng)采用M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶的RNaseH缺失突變株取代AMV反轉(zhuǎn)錄酶,使合成的cDNA更長。該系統(tǒng)的第一鏈合成使用M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶,cDNA第二鏈合成采用置換合成法,采用RNaseH和DNA聚合酶Ⅰ進(jìn)行置換合成,最后用T4DNA聚合酶切去單鏈末端,方法簡便易行。該系統(tǒng)試劑包括：

20μg特異性引物

200μlM-MLV第一鏈緩沖液(5×)，配方如下:250mmol/LTris·ClpH8.3(37℃時);375mmol/lKCl;15mmol/LMgCl2;50mmol/LDTT;10mmol/LdATP,dCTP,dGTP,dTTP混合物(各2.5mmol/L)

2×625μrRNasinRRNA酶抑制劑

10,000μM-MLV反轉(zhuǎn)錄酶,RNaseH-

5μg對照RNA

400μlM-MLV第二鏈緩沖液(10×)，配方如下：400mmol/LTris·Cl,pH7.2;850mmol/LKCl;44mmol/LMgCl2;30mmol/LDTT;0.5mg/mlBSA。

500μRNaseH

500μDNA聚合酶Ⅰ

100μT4DNA聚合酶Ⅰ

2×1.25ml不含核酸酶的水

以上所有試劑除對照RNA需在-70℃保存外,其余均可保存于-20℃,可以合成40μgmRNA。

（一）第一鏈合成

1.試劑

[α-32P]dCTP(>400Ci/mmol)，EDTA(50mM和200mM)，TE-飽和酚:氯仿（1:1），7.5MNH4Ac，乙醇(100%和70%)，TE緩沖液。2.操作步驟

(1)取一滅菌的無RNA酶的eppendorf管,加入RNA模板和適當(dāng)引物,每μgRNA使用0.5μg引物(如使用NotⅠ引物接頭,使用0.3μg),用H2O調(diào)整體積至15μl,70℃處理5分鐘,冷卻至室溫,離心使溶液集中在管底,再依次加入

5×第一鏈緩沖液5μl

rRNasinRNA酶抑制劑25U

M-MLV(H-)反轉(zhuǎn)錄酶200U

H2O調(diào)至總體積25μl

(2)用手指輕彈管壁,吸取5μl至另一eppendorf管，加入2-5μCi[α-32P]dCTP(>400Ci/mmol),用以第一鏈同位素?fù)饺敕派湫曰钚詼y定。

(3)37℃(隨機引物)或42℃(其它引物)溫浴1小時

(4)取出置于冰上

(5)摻入測定的eppendorf管加入95μl50mMEDTA終止反應(yīng),并使總體積為100μl?？扇?0μl進(jìn)行電泳分析(先用苯酚抽提),另10μl進(jìn)行同位素?fù)饺敕派湫曰钚詼y定。

第一鏈合成eppendorf管可直接用于第二鏈合成

注：以上25μl反應(yīng)總體積中所用RNA量為1μg,如合成5μgRNA,則可按比例擴(kuò)大反應(yīng)體積,倒5μgRNA使用125μl總體積進(jìn)行合成。（二）第二鏈合成

1、取第一鏈反應(yīng)液20μl,再依次加入

10×第二鏈緩沖液20μl

DNA聚合酶Ⅰ23μ

RNaseH0.8μ

H2O加至終體積為100μl

2、輕輕混勻,如需進(jìn)行第二鏈同位素?fù)饺敕派湫曰钚詼y定,可取出10μl至另一eppendorf管,加入2-5μCi[α-32P]dCTP。

3、14℃溫浴2小時(如需合成長于3kb的cDNA,則需延長至3-4小時)。

4、摻入測定eppendorf管中加入90μl50mMEDTA,取10μl進(jìn)行同位素?fù)饺敕派湫詼y定,余下的可進(jìn)行電泳分析。

5、cDNA第二鏈合成離心管反應(yīng)液70℃處理10分鐘,低速離心后置冰上。

6、加入2μT4DNA聚合酶,37℃溫浴10分鐘。

7、加入10μl200mmol/LEDTA終止反應(yīng)。

8、用等體積酚:氯仿抽提cDNA反應(yīng)液,離心2分鐘。

9、水相移至另一eppendorf管,加入0.5倍體積的7.5M醋酸銨(或0.1倍體積的1.5M醋酸鈉,pH5.2),混勻后再加入2.5倍體積的冰冷乙醇(-20℃),-20℃放置30分鐘后離心5分鐘。

10、小心丟去上清液,加入0.5ml冰冷的70%乙醇,離心2分鐘。

11、小心移去上清液,干燥沉淀。

12、沉淀溶于10-20μlTE緩沖液。（三）同位素?fù)饺敕派湫曰钚詼y定、計算和電泳分析

1.試劑

1mg/ml鮭魚精DNA，三氯乙酸(TCA,5%和7%)，堿性瓊脂糖膠，堿性膠電泳緩沖液，（30mMNaOH，1mMEDTA），2×樣品緩沖液，（20mMNaOH，20%甘油，0.025%溴酚藍(lán)）。

2.操作步驟

(1)各取一2(5)中和二(4)反應(yīng)液各3μl,點于玻璃纖維濾紙,室溫干燥,這些樣品代表總放射性活性。

(2)同樣各取3μl中反應(yīng)液至含有100μl(1mg/ml)鮭魚精DNA中,混勻,加入0.5ml5%TCA,渦旋混合儀混合后置冰上5-30分鐘。

(3)用玻璃纖維濾紙過濾,用冰冷的5%TCA洗三次,每次用5mlTCA,再用5ml丙酮或乙醇漂洗,這些樣品代表摻入放射性活性。

(4)分別測定總放射性活性強度和摻入放射性活性強度,可用蓋革計算器,也可用液閃計數(shù)。

3.第一鏈產(chǎn)量測定

第一鏈摻入率(%)=摻入cpm/總cpm×100%

摻入dNTP(nmol)=2nmoldNTP/μl×反應(yīng)體積(μl)×(第一鏈摻入率)

設(shè)330為每moldNTP的平均分子量

合成cDNA量(ng)=摻入dNTP(nmol)×330ng/nmol

mRNA向cDNA轉(zhuǎn)變率=合成cDNA量(ng)/模板RNA量(ng)×100%

例如總放射性活性強度為254,000cpm,摻入放射性活性強度為3040cpm,所用RNA摸板量為1μg,反應(yīng)體積為25μl,則:

摻入率＝3040/254000×100%=1.2

摻入dNTP量=2nmoldNTP/μl×25×1.2%=0.6nmol

合成cDNA量=0.6nmoldNTP×330ng/nmol=198ng

mRNA向cDNA轉(zhuǎn)變率=198nm/1000ng×100%=19.8%

由于1000ngRNA中20%(5μl/25μl)用于摻入測定,而反應(yīng)體積占總體積80%,因而實際第一鏈cDNA合成量為0.8×198ng=158ng。

4.第二鏈產(chǎn)量計算

除需去除第一鏈摻入dNTP外,方法同第一鏈產(chǎn)量計算

第二鏈摻入率=摻入放射性活性/總放射性活性??

摻入dNTP量(nnol)=[0.4nmoldNTP/μl×反應(yīng)體積(μl)－第一鏈摻入nmol]×第二鏈摻入率

第二鏈cDNA合成量(ng)=nmoldNTP×330ng/nmol

雙鏈cDNA轉(zhuǎn)變率=雙鏈cDNA合成量(ng)/單鏈cDNA合成量(ng)

例:第二鏈摻入放射性活性強度為2780cmp,總放射性活性強度為235000cpm.

第二鏈摻入率=2780/235000×100%=