色譜分析分析原理

高效液相色譜儀分析原理李鋒副教授知識點色譜分析法基本原理平衡理論塔板理論速率理論分離度243133混合物中各組分能否被保留或直接流出，以及各組分流出峰之間距離的大小與它們在兩相中的分配系數(shù)有關。分配系數(shù)與組分、固定相和流動相三者的分子結構、性質直接相關分配過程的熱力學-----分配系數(shù)----選擇性和色譜定性兩峰間的距離，峰寬峰的形狀和面積----色譜定量色譜峰的峰形和區(qū)域寬度與組分在固定相和流動相中的擴散、流速有關。色譜過程的動力學----色譜方法的選擇和峰形預測一、平衡理論分配系數(shù)分配比分配等溫線影響色譜峰峰形的因素1、分配系數(shù)(K)

在一定溫度和壓力下，組分在固定相和流動相之間分配達平衡時的濃度之比值。K與固定相和溫度有關，與兩相體積、柱管特性和所用儀器無關。固定相不變的情況下，K與溫度呈反比。一定溫度下，組分的分配系數(shù)K越大，出峰越慢。1、分配系數(shù)(K)

每個組分在各種固定相上的分配系數(shù)K不同；選擇適宜的固定相可改善分離效果。分配色譜-------樣品組分在固定相和流動相之間反復多次地溶解和揮發(fā)過程。吸附色譜-------吸附和解吸附過程。在一定溫度和壓力下，組分在兩相間分配達到平衡時，在固定相和流動相中的質量比，稱為分配比。它反映了組分在柱中的遷移速率。又稱保留因子。也叫容量因子或容量比。2、分配比(k)

分配比k的求算：k也等于組分的校正保留時間與死時間的比值k可通過實驗測得。k可表示出組分在柱中停留時間的長短。k越大，保留時間也就越長。

稱為相比率，它也是反映色譜柱柱型特點的參數(shù)。對填充柱，=6~35；對毛細管柱，=60~600。K只決定于組分和兩相性質，與體積無關。k不僅與組分和兩相性質有關，與相比有關，即與固定相的量有關。K與k的關系：選擇因子：A為先流出的組分，B為后流出的組分。K或k反映的是某一組分在兩相間的分配；而選擇因子

是反映兩組分間的分離情況。兩組分K或k

相差越大時，越大，分離得越好。兩組分在兩相間的分配系數(shù)不同，是色譜分離的先決條件。

二、塔板理論塔板理論是描述色譜柱中組分在兩相間的分配狀況及評價色譜柱的分離效能的一種半經(jīng)驗式的理論。塔板的概念是從精餾中借用的，是一種半經(jīng)驗理論，但它成功地解釋了色譜流出曲線呈正態(tài)分布。塔板理論將一根色譜柱當作一個由許多塔板組成的精餾塔，即將連續(xù)的色譜過程看作是許多小段平衡過程的重復。塔板理論假定：1）塔板之間不連續(xù)；2）塔板之間無分子擴散；3）組分在各塔板內(nèi)兩相間的分配瞬間達至平衡，達一次平衡所需柱長為理論塔板高度H；4）某組分在所有塔板上的分配系數(shù)相同；5）流動相以不連續(xù)方式加入，即以一個一個的塔板體積加入(脈沖式)。(一）、塔板理論概念

塔板理論是把色譜柱假想為一個精餾塔，塔內(nèi)存在許多塔板，組分在每個塔板的氣相和液相間進行分配，達成一次分配平衡。隨著流動相按一個塔板、一個塔板的方式向前移動。經(jīng)過多次分配平衡后，分配系數(shù)小的組分，先離開蒸餾塔（色譜柱），分配系數(shù)大的組分后離開蒸餾塔（色譜柱），從而使分配系數(shù)不同的組分彼此得到分離。

設色譜柱由5塊塔板（n=5，n為柱子的塔板數(shù)）組成并以r表示塔板編號．r=0，1，2，3，4，5；某組分的分配比k=1。根據(jù)上述假定．在色譜分離過程中。該組分的分布可計算如下

板號r載氣體積0123進樣mM0.5mS0.5△△VmM0.250.25mS0.250.252△VmM0.1250.125+0.1250.125mS0.1250.125+0.1250.1253△VmM0.0630.063+0.1250.063+0.1250.063mS0.0630.063+0.1250.063+0.1250.063按上述分配過程，對于n=5，k=1，m=1的體系，隨著進入柱中板體積載氣的增加，組分分布在柱內(nèi)任一板上的總量（氣相和液相的總質量）見下表nr01234出口1100.0050.0240.0690.1450.0951200.0020.0160.0460.1070.0731300.0010.0080.0300.0760.05414000.0040.0190.0530.03815000.0020.0120.0360.02816000.0010.0080.0240.018rn01234出口010000010.50.5000020.250.50.2500030.1250.3750.3750.1250040.0630.250.3750.250.063050.0320.1570.3130.3130.1570.03260.0160.0950.2350.3130.2350.07970.0080.0560.1160.2740.2740.11880.0040.0320.0860.1960.2740.13390.0020.0180.0590.1410.2360.138100.0010.0100.0380.1000.1890.118由表中可見，當n=5時，即5個塔板體積的流動相進入柱中時，組分就開始從柱口流出。并且呈現(xiàn)先小后大的情況。以上是當塔板數(shù)為5時的情況，出現(xiàn)的峰形不對稱，這是由于塔板數(shù)太少的原因。當塔板數(shù)大于50時，峰形就是對稱的。在實際色譜柱中，n值很大（約為106～109

）。所以色譜峰一般為正態(tài)分布。（二）柱效能指標對于一個色譜柱來說，其分離能力（柱效能）的大小主要與塔板的數(shù)目有關，塔板數(shù)越多，柱效能越高。

理論塔板數(shù)有效塔板數(shù)1.理論塔板數(shù)tR為某組分的保留時間；W1/2為某組分色譜峰的半寬度；W為色譜峰的峰寬。柱子的理論塔板數(shù)與峰寬和保留時間有關。保留時間越大，峰越窄，理論塔板數(shù)就越多。柱效能也就越高。對于一個柱長固定為L的柱子，其理論塔板高度H為理論塔板高度，即組分在柱內(nèi)每達成一次分配平衡所需要的柱長叫理論塔板高度。H越小，表示柱效能越高。在以上計算理論塔板數(shù)的式子中使用的是保留時間，它包括了死時間，它與組分在柱內(nèi)的分配無關，因此不能真正反映色譜柱的柱效。2.有效塔板數(shù)(neff)Heff=L/neff(1)當色譜柱長度一定時，塔板數(shù)n

越大(塔板高度H越小)，被測組分在柱內(nèi)被分配的次數(shù)越多，柱效能則越高，所得色譜峰越窄。(2)不同物質在同一色譜柱上的分配系數(shù)不同，用有效塔板數(shù)和有效塔板高度作為衡量柱效能的指標時，應指明測定物質。(3)柱效不能表示被分離組分的實際分離效果，當兩組分的分配系數(shù)K相同時，無論該色譜柱的塔板數(shù)多大，都無法分離。(4)塔板理論無法指出影響柱效的因素及提高柱效的途徑。3.塔板理論的特點：

三、速率理論(一)VanDeemter方程式(范弟姆特)

塔板理論是一個半經(jīng)驗性的理論。它定性的給出了板高的概念，但不能指出影響板高的因素。速率理論就是在塔板理論的基礎上，給出了影響塔板高度的因素：u為流動相線速度；A，B，C為常數(shù)，其中

A—分別表示渦流擴散系數(shù)；

B—分子擴散系數(shù)；

C—傳質阻力系數(shù)（包括液相和固相傳質阻力系數(shù)）。該式從動力學角度很好地解釋了影響板高（柱效）的各種因素。任何減少方程右邊三項數(shù)值的方法，都可降低H，從而提高柱效。由于填充柱固定相顆粒裝填不均勻，顆粒直徑大小不一，流動相在柱中向前移動時就會有不同的路徑，從而使組分在遷移過程中隨流動相不斷改變方向，形成紊亂的“渦流”。同一組分運行路線長短不同流出時間不同峰形展寬1.渦流擴散相(A)展寬程度以A表示：A=2dpdp—填充物平均直徑；—填充不規(guī)則因子使用細粒的固定相并填充均勻可減小A，提高柱效。對于空心毛細管柱，無渦流擴散，即A=0?？v向分子擴散是由于濃度梯度引起的。當樣品被注入色譜柱時，它呈“塞子”狀分布。隨著流動相的推進，“塞子”因濃度梯度而向前后自發(fā)地擴散，使譜峰展寬。B=2D—稱為彎曲因子，它表示固定相幾何形狀對自由分子擴散的阻礙情況；D—組分在流動相中的擴散系數(shù)。組分為氣體或液體時，分別以Dg或Dm表示；2.分子擴散相(B)氣相色譜分子量大的組分，Dg小Dg

隨柱溫升高而增加，隨柱壓降低而減小流動相分子量大，Dg小，u增加，組分停留時間短，縱向擴散小液相色譜Dm

較小，B項可忽略因傳質阻力的存在，使分配不能“瞬間”達至平衡，因此產(chǎn)生峰形展寬。氣相色譜以氣體為流動相，液相色譜以液體為流動相，二者傳質過程不完全相同。下面分別作討論。1）氣液色譜：傳質阻力項C包括氣相傳質阻力系數(shù)Cg和液相傳質阻力系數(shù)Cl。3.傳質阻力相(C)流動相固液界面固定液組分分子ClCg減小填充顆粒直徑dp；采用分子量小的流動相，使Dg增加；減小液膜厚度df，Cl下降。但此時k又減小。因此，當保持固定液含量不變時，可通過增加固定液載體的比表面來降低df。但比表面過大又會因吸附過強使峰拖尾。增加柱溫，可增加Dl，但k值也減小，為保持合適Cl值，應控制柱溫。2）液液色譜：傳質阻力項C包括流動相傳質阻力系數(shù)Cm

和固定相傳質阻力系數(shù)Cs。sm流動相傳質阻力包括兩方面：流動相中的傳質阻力Cm、滯留的流動相傳質阻力Cs。分別與填充物大小dp、擴散系數(shù)(Dm)、微孔大小及其數(shù)量等有關。降低流動相傳質阻力的方法有：細顆粒固定相、增加組分在固定相和流動相中的擴散系數(shù)D、適當降低線速度、短柱。固定相傳質阻力與液膜厚度df、保留因子k和擴散系數(shù)Ds等有關。降低固定相傳質阻力的方法有：與氣液色譜中液相傳質阻力的表述相同。4.流速uH=A+B/u+Cu當u一定時，僅在A、B、C較小時，H較小，柱效較高；反之則柱效較低，色譜峰將展寬。以u對H作圖，可得H-u曲線（如圖），從該曲線得到：板高，H(cm)HminA+B/u+CuCmuCsuAB/uH=A+B/u+Cu渦流擴散項A與流速u無關；低流速區(qū)(u小)，B/u大，分子擴散項占主導，此時選擇分子量大的氣體如N2和Ar為載氣，可減小擴散，提高柱效；高流速區(qū)(u大)，Cu大，傳質阻力項占主導，此時選擇分子量小的氣體如H2和He為載氣，可增加擴散系數(shù)，提高柱效；在LC中，較低流速可獲得較大的柱效。5.固定相顆粒大小對板高的影響實驗表明，顆粒越細，板高越小，受線速影響越小。即，在HPLC分析中采用細粒作固定相的理論根據(jù)！但顆粒細導致柱流速慢，當采用高壓技術，才能實現(xiàn)HPLC的分析要求。板高,H(cm)四、分離度及色譜分離方程1.分離度(Resolution,R)同時反映色譜柱效能和選擇性的一個綜合指標。也稱總分離效能指標或分辨率。直接從色譜流出曲線上求出分離度R①分離效果差，柱效低，選擇性（）低②完全分離，柱效高，峰窄，選擇性（）低；③完全分離，選擇性（）增加，柱效低，峰寬④完全分離，柱效高，選擇性（）好R越大，相鄰組分分離越好。當R=1.5時，分離程度可達99.7%，因此R=1.5通常用作是否分開的判據(jù)。R=1.5R=0.75R=1.0響應信號保留時間t,min2.色譜分離方程R的定義并未反映影響分離度的各種因素。也就是說，R未與影響其大小的因素：柱效n、選擇因子和保留因子k聯(lián)系起來。對于相鄰的難分離組分，由于它們的分配系數(shù)K相差小，可合理假設k1k2=k，W1W2=W。因此可導出R與n、和

k

的關系：1）分離度R與柱效的關系分離度R與理論塔板數(shù)n有關，即R受熱力學性質的影響。對具一定相對保留值的物質對，R與有效塔板數(shù)neff有關，說明neff可正確代表柱效能。由色譜方程可得：因此可通過增加柱長提高分離度。然而，分析時間也相應增加，且峰寬也展寬！為提高柱效，用減小塔板高度H的方法比增加柱長更有效。2）分離度R與保留因子的關系越大，柱選擇性越好，對分離有利。的微小變化可引起R較大改變。如，當從1.01增加至1.10(增加9%)時，R則增加9倍(但>1.5,R增加不大)。改變的方法有：降低柱溫、改變流動相及固定相的性質和組成。3）分離度R分配比k的關系k增加，分離度R增加，但當k>10，則R的增加不明顯。通常k在2~10之間。改變k的方法有：適當增加柱溫(GC)、改變流動相性質和組成(LC)以及固定相含量。溶劑(流動相)組成對色譜分離的影響(梯度淋洗)1：9,10-蒽醌；2：2-甲基-9,10-蒽醌；3：2-乙基-9,10-蒽醌4：1,4-二甲基-9,10-蒽醌；5：