親和純化技術(shù)

關(guān)于親和純化技術(shù)第1頁(yè)，課件共47頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月2第九章親和純化技術(shù)親和純化技術(shù)（Affinitypurification）:利用生物分子間的特異性結(jié)合作用的原理進(jìn)行生物物質(zhì)分離純化的技術(shù)“親和力”第2頁(yè)，課件共47頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月3親和純化技術(shù)親和層析(Affinitychromatography)親和過(guò)濾（膜分離）親和分配（雙水相萃?。┯H和反膠團(tuán)萃?。ǚ茨z團(tuán)萃?。┯H和沉淀（沉淀）親和電泳（電泳）第3頁(yè)，課件共47頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月4第一節(jié)親和層析(AffinityChromatography)第4頁(yè)，課件共47頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月5親和層析第5頁(yè)，課件共47頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月6第一節(jié)親和層析

(AffinityChromatography)（1）配基固定化：配基與載體偶聯(lián)，結(jié)合成具有特異親和性的分離介質(zhì)。（2）吸附樣品：親和層析介質(zhì)選擇性吸附生物活性物質(zhì).（3）樣品解吸：選擇適宜的條件使被吸附物活性物質(zhì)解吸。

第6頁(yè)，課件共47頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月7一、親和層析的原理和特點(diǎn)7利用生物大分子物質(zhì)具有與某些相應(yīng)的分子專一性可逆結(jié)合的特性而建立的層析技術(shù)。適用于從成份復(fù)雜且雜質(zhì)含量遠(yuǎn)大于目標(biāo)物的混合物中提純目標(biāo)物。經(jīng)過(guò)一次處理可得到高純度活性物質(zhì)；特異性強(qiáng)、分離效果好、分離條件溫和；親和吸附劑通用性較差，專用的吸附劑。第7頁(yè)，課件共47頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月8親和吸附劑：載體—配基在親和層析中起可逆結(jié)合的特異性物質(zhì)稱為配基（Ligand）。與配基結(jié)合的層析介質(zhì)稱為載體（Matrix）。第8頁(yè)，課件共47頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月9配基-底物（Ligand-substance）配基-底物：親和對(duì)特異性好通用性差第9頁(yè)，課件共47頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月10梁山伯朱麗葉楊貴妃小龍女祝英臺(tái)林黛玉崔鶯鶯LigandSubstance祝英臺(tái)第10頁(yè)，課件共47頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月11酶受體，載體蛋白凝集素抗原，病毒，細(xì)胞谷胱甘肽聚（His）融合蛋白，表面具有Cys/Trp殘基核酸互補(bǔ)堿基序列，組蛋白，核酸聚合酶，核酸結(jié)合蛋白金屬離子谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶，GST融合蛋白抗體多糖類，糖蛋白，細(xì)胞表面受體，細(xì)胞激素，維生素底物類似物，抑制劑，輔助因子底物配基第11頁(yè)，課件共47頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月12二、載體（一）、親和層析對(duì)載體的要求：第12頁(yè)，課件共47頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月13（二）、常用載體第13頁(yè)，課件共47頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月141、纖維素纖維素結(jié)構(gòu)緊密、均一性差，不利于大分子的滲入。非特異性吸附力較強(qiáng)，空間位阻。主要用于分離與核酸有關(guān)的物質(zhì)。第14頁(yè)，課件共47頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月152、瓊脂糖凝膠瓊脂糖濃度有2%、4%、6%，商品為Sepharose2B、4B和6B（Pharmacia）。保持吸附物質(zhì)活性，能迅速活化并接上各種功能基團(tuán)，結(jié)構(gòu)疏松孔徑大，流速快。SepharoseCL,穩(wěn)定性明顯增加，能在pH3~14中應(yīng)用。

第15頁(yè)，課件共47頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月16

3、葡聚糖凝膠：葡聚糖凝膠孔徑太小，偶聯(lián)配基后，孔徑更小，應(yīng)用受到限制。

第16頁(yè)，課件共47頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月174、聚丙烯酰胺凝膠：Bio-gelP有供化學(xué)反應(yīng)的酰胺基，能制得配基含量較高的親和柱，適用于親和勢(shì)比較低的系統(tǒng)。

pH過(guò)高或過(guò)低的溶液中酰胺基易水解。第17頁(yè)，課件共47頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月18

5、多孔玻璃珠：化學(xué)與物理穩(wěn)定性較好，機(jī)械強(qiáng)度高。缺點(diǎn)：親水性不強(qiáng)，對(duì)蛋白質(zhì)尤其是堿性蛋白質(zhì)有非特異性吸附，化學(xué)活性基團(tuán)少。第18頁(yè)，課件共47頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月196、其它載體——?dú)ぞ厶?Chitosan)

甲殼素和殼聚糖殼聚糖是甲殼素N-脫乙?；漠a(chǎn)物第19頁(yè)，課件共47頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月20三、親和配基第20頁(yè)，課件共47頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月21（一）、配基的選擇第21頁(yè)，課件共47頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月22（二）、配基的濃度對(duì)親和勢(shì)比較低的系統(tǒng)（KL≥10-4mol/L），增加配基濃度有利于吸附。配基濃度太高使吸附力太強(qiáng)，洗脫困難?？梢酝ㄟ^(guò)增加親和柱的長(zhǎng)度來(lái)提高吸附率。第22頁(yè)，課件共47頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月23（三）、配基偶聯(lián)的位置配基固定化時(shí)，其不參與親和結(jié)合的部位與載體進(jìn)行偶聯(lián)。AMP-Sepharose親和柱腺嘌呤N6-氨基接到載體上，對(duì)脫氫酶和甘油激酶有吸附力。磷酸基接到載體上，對(duì)甘油醛-3-磷酸脫氫酶有吸附力。例：第23頁(yè)，課件共47頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月24（四）、配基分子的大小

選用大分子配基。小分子物質(zhì)作為配基，載體和配基間插入一個(gè)“手臂”以消除空間障礙。第24頁(yè)，課件共47頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月25四、載體的活化與偶聯(lián)Q:載體在于配基偶聯(lián)前為什么要“活化”？A：載體相對(duì)“惰性”，不能直接與配基連接（不容易發(fā)生化學(xué)反應(yīng)），因此在偶聯(lián)前（載體與配基對(duì)接），需要對(duì)載體進(jìn)行“活化”活化的方式有很多種……第25頁(yè)，課件共47頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月26載體的活化的方式多糖類載體第26頁(yè)，課件共47頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月27聚丙烯酰胺凝膠載體的活化法酰胺基+含氮化合物→胺衍生物第27頁(yè)，課件共47頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月28五、影響吸附親和力的幾個(gè)因素

第28頁(yè)，課件共47頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月29※六、配基與間隔臂的連接（一）、含氮配基的連接（二）、含羧基配基的連接（三）、含巰基配基的連接（四）、含醛基、酮基、羥基配基的連接第29頁(yè)，課件共47頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月30七、親和層析的吸附和洗脫

第30頁(yè)，課件共47頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月31第31頁(yè)，課件共47頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月32（一）、影響吸附的條件1、親和吸附劑及配體的性質(zhì)緩沖液的種類、離子強(qiáng)度、pH、溫度和層析流速有關(guān)。2、溫度升高會(huì)使吸附作用減弱。3、流速每小時(shí)低于10ml/cm2。4、上樣體積為柱床體積的5%。第32頁(yè)，課件共47頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月33第33頁(yè)，課件共47頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月34離子效應(yīng)配基與載體-間隔臂的不完全結(jié)合，將無(wú)關(guān)離子基團(tuán)引入吸附劑。具有離子基團(tuán)的親和吸附劑會(huì)影響蛋白質(zhì)的洗脫行為。第34頁(yè)，課件共47頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月35疏水基團(tuán)吸附劑疏水性基團(tuán)與蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)中的疏水區(qū)相互吸引，形成非專一性吸附。疏水基團(tuán)：（1）長(zhǎng)的烴鏈結(jié)構(gòu)的“手臂”：烴鏈（2）疏水性配基第35頁(yè)，課件共47頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月36復(fù)合親和力離子效應(yīng)作用，又有疏水作用。提高選擇性對(duì)每一具體系統(tǒng)找出最佳的配給濃度、pH、離子強(qiáng)度和溫度。第36頁(yè)，課件共47頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月37（二）、親和層析的洗脫第37頁(yè)，課件共47頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月38非專一性洗脫改變洗脫劑的pH以影響電性基團(tuán)的解離程度離子強(qiáng)度的分步和梯度變化降低緩沖液極性第38頁(yè)，課件共47頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月39特殊洗脫斷裂方法有：硫酯鍵用羥胺處理30分鐘；偶氮鍵用連二亞硫酸鈉硼酸緩沖液處理；二硫鍵用巰基乙醇、半胱氨酸、二硫蘇糖醇等處理。第39頁(yè)，課件共47頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月40專一性洗脫競(jìng)爭(zhēng)性效應(yīng)——正洗脫非競(jìng)爭(zhēng)性效應(yīng)——不能達(dá)到洗脫目的反競(jìng)爭(zhēng)性效應(yīng)——負(fù)洗脫第40頁(yè)，課件共47頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月41專一性洗脫競(jìng)爭(zhēng)性效應(yīng)，即ESI不如EI穩(wěn)定，增加洗脫劑中I，會(huì)使E洗脫下來(lái)（正洗脫）。S（固定化配基），E（酶），I（游離配基）第41頁(yè)，課件共47頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月42專一性洗脫非競(jìng)爭(zhēng)性效應(yīng)，即ESI穩(wěn)定性與EI相同，I的存在不影響E對(duì)S的結(jié)合，用I不能達(dá)到洗脫的目的。S（固定化配基），E（酶），I（游離配基）第42頁(yè)，課件共47頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月43專一性洗脫反競(jìng)爭(zhēng)性效應(yīng)，即ESI比EI穩(wěn)定，I使E與S結(jié)合更緊密。增加了酶與配基的結(jié)合力及親和吸附的選擇性將I除去——“負(fù)洗脫”第43頁(yè)，課件共47頁(yè)，創(chuàng)作于202